CN108754027A - 一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法，该方法为实现多样本的繁殖障碍性病毒病一次性筛查检测奠定了基础，同时有效解决了传统方法费时费力、敏感性低、投入大的缺陷。本发明的技术方案如下：基于五种病毒的保守序列利用生物学软件设计特异性引物与探针，用TE Buffer溶解合成好的探针，在基因芯片点样仪上按预先设定好的程序在醛基化基片上喷点式点样，制备用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病的芯片。本发明的使用方法是：提取待测样品的基因组DNA/RNA，利用多重PCR反应体系制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果，大大节省了时间，检测成本低。

Description

一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其 应用方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地说，它涉及一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法。

背景技术

近年来，随着我国规模化养殖场的不断扩大，密集型的饲养方式大大增加了猪群之间的接触几率，接触几率的增加加快了疾病传播的同时，也使得患病猪常呈现混合感染现象，诸如猪瘟病毒(Swine fever,Hog cholera)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、日本乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)及猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)及等许多具有相似的临诊症状的猪繁殖障碍疾病发生混合或继发感染，这就加大了临床诊断的难度。因此，建立有效的实验室诊断是十分必要的，其中实验室诊断包括病毒的分离鉴定、血清学检测以及分子生物学技术。但其中的一些方法存在成本高、费时费力、敏感性较低、特异性较差等缺陷，不能实现临床样品的快速鉴别诊断。

基因芯片技术是一种新型并蓬勃发展的微型化、高通量的基因检测及分析技术，其原理是用荧光标记的样品与固定在固相支持物表面的寡核苷酸或探针相杂交，经检测分析杂交信号后，可得到样品的检测结果。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术可以同时检测多种病毒、多个样品，快速简便且具有高度的灵敏性和准确性。

发明内容

基于我国猪场发病情况，为解决现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病(包括CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2)联合检测基因芯片的制备及其应用方法，可有效解决现有技术敏感性低、稳定性较差、费时费力等缺点。

本发明的技术方案是：利用生物学软件设计并合成特异性引物与探针，用TEBuffer溶解稀释合成好的探针，利用基因芯片点样仪按电脑预设程序将稀释好的特异性探针喷点固化于醛基化基片(公知市售产品)上，制备用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病的基因芯片。

本发明还提供了用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的使用方法，该方法主要包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA/RNA，利用多重PCR反应体系制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果。

本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需2h，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用1μM的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。

综上所述，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：。

为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。

附图说明

图1为本发明的基因芯片点样示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计引物和探针：基于CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2的保守序列，设计特异性引物与探针，同时对各个病病原体的下游引物5’端进行Cy3荧光标记，探针的5’端氨基化修饰，并在氨基和探针之间加上10-15个T的间隔臂。其中引物与探针列表如下：

(2)对引物和探针进行合成：将步骤(1)所设计的引物和探针，交公司进行合成(这是公知的合成途径)；

(3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片(公知市售产品)上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于80℃烘箱固定干燥2小时。

一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检样品(包括CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2)的基因组DNA/RNA；

(2)杂交用PCR产物的制备：采用多重PCR制备杂交用PCR产物，所述的反应体系为：多重PCR反应体系采用25μL体系，包括Taq DNA聚合酶0.4μL、10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL、2.5mM dNTPs 3.0μL、CSFV上下游引物各0.4μL、PPV上下游引物各0.5μL、PRRSV上下游引物各0.6μL、JEV上下游引物各0.4μL、PCV2上下游引物各1μL、ddH2O10.7μL、五种病毒的混合模板2.6μL。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，51.7℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃再延伸10min。

(3)杂交用PCR产物与权利要求1所述的基因芯片杂交：将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出淬火10min。取PCR扩增产物50μL与杂交液等比例加至无菌离心管中，将混合液全部加到芯片的点样区，杂交检测时用杂交围栏隔开，以便同时进行不同样品的杂交反应，随后将芯片放入杂交盒中置于55℃杂交箱中避光杂交2h。

(4)基因芯片的洗涤与干燥：基因芯片的洗涤应在避光条件下进行。杂交完毕的基因芯片置于玻片架上，分别置于洗液Ⅰ(1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅱ(0.1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅲ(0.1×SSC)中浸泡2min，并上下抽提10-20次，用低温离心甩干机离心甩干后即可用于扫描分析；

(5)基因芯片的结果分析：将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。

所述的引物浓度为10μM。

所述探针浓度为1μM-15μM。

点样环境参数为相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃，点样阵列根据实验要求设定。

所述的杂交芯片洗涤所用洗液Ⅰ(1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅱ(0.1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅲ(0.1×SSC)。

所述的基因芯片杂交结果判定的依据如下：

(1)模板DNA的PCR扩增效果良好，且RNA无降解无污染；

(2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；

(3)检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。

经试验证明，此方法灵敏可靠。应用效果好，有关资料如下：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株及病料来源

PRV疫苗、PRV Min-A株、CSFV疫苗、CSFV石门株，猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙脑病毒(JEV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)，大肠杆菌(E.coli)均为本实验室保存。临床组织病料从河南农大猪病门诊疑似患病猪内采集，包括心、肝、脾、肺、肾及淋巴结等16份组织样品。

1.1.2芯片材料

基因芯片基片采用醛基化载玻片，购自北京博奥晶典科技有限公司。

1.1.3试验仪器

1.1.4主要试剂和溶液

2.0％琼脂糖凝胶、50×电泳储存液(50×TAE)、10％SDS、洗液Ⅰ(1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅱ(0.1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅲ(0.1×SSC)均由本实验室配制，所用试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1病毒基因组DNA的提取

基因组DNA的提取利用的是上海生工的DNA提取试剂盒，操作步骤如下，本试验的DNA病毒有PPV、PCV2：

(1)取病毒液150μL到离心管(1.5mL)中，分别加25μL OB Protease混合均匀后，于60℃水浴锅中水浴10min，期间进行震摇使之充分反应；

(2)水浴完成后，10000×g高速离心5min，弃去沉淀，取上清另置一新离心管中，加220μL Buffer BL混匀，水浴锅70℃水浴10min；

(3)后向离心管中加220μL无水乙醇溶液(室温)，快速混匀，然后将液体移入吸附柱并套上收集管，8000×g高速离心1min，弃去液体；

(4)更换收集管，向吸附柱中加入500μL Buffer HB，8000×g离心1min，弃液；(5)再次更换收集管，吸附柱中加入DNA Wash Buffer(预先加入酒精至终浓度为25mg/mL)700μL，8000×g高速离心1min，弃去液体；

(6)重复加入DNA Wash Buffer对DNA进行二次洗涤并离心，倒掉收集管中的液体，14000×g高速离心2min干燥吸附柱；

(7)用无菌离心管(1.5mL)替换收集管，在吸附柱内加入150μL提前70℃预热好的Elution Buffer，室温静置3min后，10000×g高速离心1min，将DNA从吸附柱中洗脱出来，

(8)再加150μL Elution Buffer对DNA进行二次洗脱，将溶液移至无菌离心管(1.5mL)，-20℃保存备用。

1.2.2基因组RNA的提取及反转录

本试验RNA的提取利用的是Magen公司Hipure Viral RNA Spin Kit试剂盒，操作步骤如下，其中本试验的RNA病毒包括CSFV、PRRSV和JEV：

(1)转移20μL Proteinase K至1.5mL离心管中；

(2)转移200μL样品，如血清、血浆、尿液、培养液上清、或其它无细胞体液至装有Proteinase K的离心管中，振荡混匀5s。若样品不足200μL，用BufferPBS或Nuclease FreeWater补足。咽/口腔拭子，或固体组织样品先用Buffer PBS浸泡或匀浆后，离心取上清进行操作；

(3)转移200μL Buffer AL/Carrier RNA至样品中，涡旋混匀15s。使用前，按每1mLBuffer AL加入15μL Carrier RNA(1μg/μL)。该混合液室温可保存2d；

(4)56℃水浴10min；

(5)加入250μL无水乙醇至裂解液中，涡旋混匀15s。室温静置3min；

(6)把HiPure Viral Micro Column装在2mL收集管中。转移混合液至柱子中。8,000×g离心30-60s；

(7)倒弃滤液把柱子装回收集管中。加入500μL Buffer VHB(已用无水乙醇稀释)至柱子中。8,000×g离心30-60s。使用前Buffer VHB必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释；

(8)倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入500μL Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8,000×g离心30-60s，使用前Buffer RW2必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释；

(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500μL Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8,000×g离心30-60s；

(10)倒弃滤液把柱子套回收集管，13,000×g离心空柱3min甩干柱子；

(11)将柱子转移至新的1.5mL离心管，加入15-30μL Nuclease Free Water至柱子的膜中央，13,000×g离心1min；

(12)弃去柱子，把RNA保存于-80℃备用。

利用Magen公司M-MLV H-First-Stand Synthesis Kit反转录试剂盒将提取的RNA进行反转录，反应体系为20μL，操作步骤如下：

(1)取RNA溶液6μL(RNA的量可根据其浓度进行适当调整)，Oligo(dT)20 1μL，dNTPs 1μL，Nuclease Free Water补足至13μL，将混合液置于65℃孵育5min，迅速取出置于冰上冷却1min；

(2)随后向反应液中加入5×M-MLV First Stand Buffer 4μL，0.1M DTT 1μL，M-MLV RNase H-RT 1μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，轻柔吹打混匀后瞬间离心。经反应45℃30min，85℃10s后瞬间离心，将产物立即放置-20℃保存备用。

1.2.3引物的设计与合成

设计引物和探针：基于CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2的保守序列，设计特异性引物与探针，同时对各个病原体的下游引物的5’端进行Cy3荧光标记，探针的5’端氨基化修饰，并在氨基和探针之间加上10-15个T的间隔臂。特异性引物和探针均在大连宝生物工程有限公司合成。引物用TE Buffer稀释成10μM的浓度，置于-20℃冻存备用。其中引物与探针列表如下：

表1 特异性引物与探针序列

1.2.4基因芯片的制备

使用TE Buffer将合成的五种病毒的特异性的冻干探针(使用前要进行离心)稀释成100μM的母液，依次稀释成1μM(1μL探针+49μL灭菌水+50μL点样缓冲液)、5μM(5μL探针+45μL灭菌水+50μL点样缓冲液)、15μM(15μL探针+35μL灭菌水+50μL点样缓冲液)。取100μL的阳性对照移至96孔板的A7、B7、C7，阴性对照加至96孔板的A1、B1、C1处，1μM的CSFV探针、PPV探针、PRRSV探针、JEV探针、PCV2探针依次加入96孔板的A2、A3、A4、A5、A6中，5μM的CSFV探针、PPV探针、PRRSV探针、JEV探针、PCV2探针加至96孔板的B2、B3、B4、B5、B6，而15μM的各病毒探针分别加到96孔板的C2、C3、C4、C5、C6中。然后使用美国Bio-Dot公司的AD1500基因芯片点样仪按电脑预设程序在醛基化基片上进行喷点式点样。每样点点样量约为60nL，样点直径约为1mm，点心间距为2mm，点样时环境相对湿度55％-65％，温度15-30℃。将点完样的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于80℃烘箱固定2h后备用。芯片点样示意图见图1。

1.2.5杂交用PCR产物的制备与鉴定

多重PCR反应体系采用25μL体系，包括Taq DNA聚合酶0.4μL、10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL、2.5mM dNTPs 3.0μL、CSFV上下游引物各0.4μL、PPV上下游引物各0.5μL、PRRSV上下游引物各0.6μL、JEV上下游引物各0.4μL、PCV2上下游引物各1μL、ddH2O10.7μL、五种病毒的混合模板2.6μL。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，51.7℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃再延伸10min。用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，操作步骤如下：取5μL多重PCR扩增的产物与1μL 6×Lording Buffer混合均匀，随后用10μL移液器将吸取的样品小心加入加样孔中，注意枪头不要伸到孔底部，以免穿透加样孔而导致样品外溢，应缓慢推出使样品垂直落入加样孔中。加样结束后，盖上电泳槽盖，调节电压为100v，关闭电泳室灯光，避光电泳30min。待电泳结束后，小心取出凝胶放置于UVI凝胶成像系统中，观察结果并拍照保存。

1.2.6基因芯片的杂交

将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出淬火10min。取50μL PCR扩增产物与超级杂交液等比例加至无菌离心管中，将混合液全部加到芯片的点样区，杂交检测时用杂交围栏隔开，以便同时进行不同样品的杂交反应，随后将芯片放入杂交盒中置于55℃杂交箱中避光杂交2h。

1.2.7基因芯片的洗涤和干燥

基因芯片的洗涤应在避光条件下进行。杂交完毕的基因芯片置于玻片架上，分别置于洗液Ⅰ(1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅱ(0.1×SSC/0.2％SDS)、洗液Ⅲ(0.1×SSC)中浸泡2min，并上下抽提10-20次，用离心甩干机离心甩干后即可用于扫描分析。

1.2.8基因芯片的扫描及扫描结果分析

将芯片置于InnoScan 700A高性能激光共聚焦扫描仪上扫描，如果背景较高可用洗液Ⅲ(0.1×SSC)再洗涤一次，以TIF格式保存图像，然后再另存为为JPG格式图片。用MAPIX软件分析Cy3荧光信号的强度和比值，用以下三个条件作为基因芯片杂交结果判定的依据：

(1)模板DNA的PCR扩增效果良好；

(2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰(清晰程度和杂交条件有很大关系)；

(3)检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。

本发明工艺简单，能对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2进行快速、灵敏的检测，经试验取得了满意的效果，有关试验结果如下：

1、PCR扩增结果

利用合成的CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2五种病毒的特异性引物，利用五种病毒的模板进行多重PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示，针对五种病毒单项和多重PCR均能扩增出约91bp、152bp、198bp、238bp、417bp的特异性片段，与预计目的片段相同，特异性较好。

2、基因芯片杂交结果

将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出淬火10min。取50μL PCR扩增产物与超级杂交液等比例加至无菌离心管中，将混合液全部加到芯片的点样区，杂交检测时用杂交围栏隔开，以便同时进行不同样品的杂交反应，随后将芯片放入杂交盒中置于55℃杂交箱中避光杂交2h。杂交结果经扫描仪扫描，各杂交斑点的SNR值均大于1.5。

将含有1μM、5μM、15μM的探针芯片与标记样品杂交后，荧光信号强度无明显差别。因此，在不影响杂交结果的前提下，选择1μM浓度的探针以降低科研成本。

本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需2h，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用1μM的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。

3、临床样品检测结果

使用已经建立好的基因芯片诊断技术对16份病料进行临床样品检测。16份病料中共检出阳性病料为14份，阳性率为87.5％，其中混合感染的比例为21.4％(3/14)。检测结果与PCR鉴定结果一致，符合率达100％。因检测样本量过少，基因芯片还未能显示出较高的检测率。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计引物和探针：以CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2的保守基因设计特异性引物与探针序列如下：

CSFV的引物及探针序列为：

F:5’-TGCAACTGAATGACGGGAC-3’

R:5’-Cy3-GCCAAATACCTCCTACTGACCAC-3’

P:NH2-TTTTTTTTTTCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCAGC

PPV的引物及探针序列为：

F:5’-AAAAACAATCCACCAGGACAAC-3’

R:5’-Cy3-CTGGATCTCATTTTTGCTGTGA-3’

P:NH2-TTTTTTTTTTGATTTCAATGACTCTCCTCAACAACC

PRRSV的引物及探针序列为：

F:5’-CGGGCGGTATGTCCTAAGTA-3’

R:5’-Cy3-ACCTCAACTTTGCCCCTTTT-3’

P:NH2-TTTTTTTTTTTGCGTTGACTTGCTTCGTCATTAGGTC

JEV的引物及探针序列为：

F:5’-AGCTTGTTGGACGGCAGAG-3’

R:5’-Cy3-GCCACATGATTGAGCCTTCA-3’

P:NH2-TTTTTTTTTTCCGATGGAAAGCAGGAAAGCAGTGGAAAAGAGTGT

PCV2的引物及探针序列为：

F:5’-CTATCAAGCGAACCACAGT-3’

R:5’-Cy3-GGTCTACATTTCCAGCAGT-3’

P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTCACAGCCCTCACCTATAGCCCCTATTG，

在每段探针下游5’端都进行Cy3荧光标记，探针的5’端氨基化修饰，并在氨基和探针之间加上10-15个T；

2)按常规方法对引物和探针进行合成；

3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于80℃烘箱固定干燥2小时。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，所述引物的浓度为10μM。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，所述探针的浓度为1μM-5μM。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，每样点的点样量约为60nL，样点直径约为1mm，点心间距为2mm，点样时环境相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃，点样阵列根据实验要求设定。

5.一种如权利要求1-4任一所述的用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检样品的基因组DNA/RNA，待检样品包括CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2；

2)杂交用PCR产物的制备：采用多重PCR制备杂交用PCR产物，所述的反应体系为：多重PCR反应体系采用25μL体系，包括Taq DNA聚合酶0.4μL、10×PCR buffer(Mg2+Plus)2.5μL，2.5mM dNTPs 3.0μL、CSFV上下游引物各0.4μL、PPV上下游引物各0.5μL、PRRSV上下游引物各0.6μL、JEV上下游引物各0.4μL、PCV2上下游引物各1μL、ddH2O 10.7μL、五种病毒的混合模板2.6μL，扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，51.7℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃再延伸10min；

3)杂交用PCR产物与权利要求1所述的基因芯片杂交：将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出淬火10min；取PCR扩增产物与超级杂交液等比例加至无菌离心管混合均匀，随后将混合液全部加到芯片的点样区，杂交检测时用杂交围栏隔开，以便同时进行不同样品的杂交反应，随后将芯片放入杂交盒，55℃杂交箱中避光杂交2h；

4)基因芯片的洗涤与干燥：基因芯片的洗涤应在避光条件下进行；杂交完毕的基因芯片置于玻片架上，分别置于洗液Ⅰ1×SSC/0.2％SDS、洗液Ⅱ0.1×SSC/0.2％SDS、洗液Ⅲ0.1×SSC中浸泡2min，并上下抽提10-20次，用低温离心甩干机离心甩干后即可用于扫描分析；

5)基因芯片的结果分析：将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值，基因芯片杂交结果判定的依据如下：模板DNA/cDNA的PCR扩增效果良好；信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。

6.根据权利要求5所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的应用方法，其特征在于，所述的基因芯片洗涤所用洗液Ⅰ为1×SSC和0.2％SDS；洗液Ⅱ为0.1×SSC和0.2％SDS；洗液Ⅲ为0.1×SSC。