CN113186355A - 一种采用二联pcr检测猪ppv、jev的试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQ ID NO：1；P2：SEQ ID NO：2；P3：SEQ ID NO：3；P4：SEQ ID NO：4。本发明一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，具有快速、特异性强等优点，通过联合PCR技术可以快速、有效地鉴别PPV、JEV两种混合病毒，与单一PCR检测相比，具有省时、省力的优点。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，具体涉及一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法。
背景技术
猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病。以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。猪流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(JEV)引起的猪繁殖障碍性疾病，主要以母猪流产、死胎和公猪睾丸炎为特征。在种猪场发生的繁殖障碍性疫病中，这两种疾病繁殖障碍性疾病往往会严重降低种猪的生产效率。生产上对种猪场繁殖障碍性疾病的摸底排查、临床诊断，为猪场制定免疫程序提供科学的理论依据具有重大的实践意义。目前对本病的诊断目前主要是PCR和血清学诊断方法。但是血清学方法不如PCR方法敏感性高，PCR方法大多都是单一PCR检测，要检测这两种病毒的混合感染需要分别进行 PCR操作，因此相对比较繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有检测PPV、JEV两种病毒混合感染的方法为分别进行单一PCR检测操作，相对比较繁琐，目的在于提供一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，可在同一体系中检测两种感染病毒的存在，能够大大的提高诊断效率。
本发明通过下述技术方案实现：
一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的 NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp， P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQ ID NO：1；5'-GGGACCAGGCAACAGACAT-3'；
P2：SEQ ID NO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；
P3：SEQ ID NO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；
P4：SEQ ID NO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。
一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包括10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/LdNTP 4μL，25mmol/L Mg2+溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH2O 11.6μL，其中JEVcDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA。
一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列，
(2)根据选择的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2最佳引物：P1、P2及 P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：
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P2：SEQ ID NO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；
P3：SEQ ID NO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；
P4：SEQ ID NO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。
一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，主要包括以下步骤：
(1)样品的处理；
(2)病料样品RNA和DNA的提取；
(3)二联PCR反应：
采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg2+溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，去 ddH2O 11.6μL；PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min，其中JEV cDNA是JEV抽提后的 RNA经过反转录后得到的cDNA；
(4)结果判定
取二联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后在凝胶成像系统中观察拍照，以标准 DNAmarker(D,L-2000)作参考；电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，且片段大小分别为750bp和475bp，说明病料样品中同时含有PRV、JEV病毒；如果仅出现其中一个对应长度的核酸片段，则表明病料样品中只含有其中一种病毒；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有PRV、JEV病毒。
步骤(4)中，取5μl产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察。
步骤(3)中，JEV的cDNA的合成反应体系：5×PrimeScriptTM缓冲液2μL，PrimeScriptTM RT-Enzyme Mix I 0.5μL，40μmol/L Specific down primer 0.25μL，总RNA2μL，RNase Free ddH2O 5.52μL。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，具有快速、特异性强等优点，通过联合PCR技术可以快速、有效地鉴别PPV、JEV三种病毒，与单一PCR检测相比，具有省时、省力的优点。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为二联PCR的特异性实验结果图；
图2为6份猪病料样品检测结果，其中M为D,L-2000(2000，1000，750，500，250，100)，其中1-6为6份临床猪病料。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
引物的设计
(1)PPV、JEV基因靶序列的选择
从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列作为两对引物的靶序列。
(2)特异性引物的设计及合成
将选择的PPV-VRI-1株的NS1基因、JEV-WHe株的NS1基因的靶序列分别输入primerpremier 5.0软件和oligo 6.0软件程序中联合进行引物设计，分别设计两种基因的特异性引物。 PPV的NS1基因引物设计具体的要求为：G+C含量为55.6～57.9％，引物长度18～19nt，Tm 值57.4～58.2℃，扩增产物长度750bp；JEV的NS1基因引物设计要求为：G+C含量为55.6％，引物长度18nt，Tm值56.8～58.4℃，扩增产物长度475bp。将得到的引物序列进行引物之间的最佳配对筛选试验，得到候选的引物对，用全自动DNA合成仪进行候选引物的合成。
实施例2
二联PCR扩增的体系条件的优化
(1)先后对退火温度、酶浓度、引物浓度、Mg2+分别进行优化；体系中变量较多，优化某一变量时，保持其它变量恒定。确定了测定PPV的NS1基因单项PCR的最佳引物量，确定单项PCR的反应条件如下：25μL PCR反应体系，单联PCR的体系组成为：
扩增程序为：95.5℃5min预变性，进入95℃变性30s、57℃退火30s，72℃延伸45s共35个循环，最后72℃延伸5min。反应完成后取5μl产物，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察；
(2)在二联PCR反应体系中分别加入PPV的NS1基因的最佳引物量及不同浓度的JEV的NS1基因引物，进行二联PCR，筛选出PPV的NS1基因二联PCR反应体系中JEV的NS1 基因引物的最佳工作浓度和最佳的二联PCR扩增模式，确定二联PCR扩增反应条件如下：采用25μLPCR反应体系；PCR反应体系的组成为：
PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min。
实施例3
二联PCR特异性实验
用所建立的二联PCR进行单一模板和二联模板的检测，并以PRV-SA215、PCV1和发病猪及健康猪淋巴结DNA抽提物作为对照，确定本方法具有极强的特异性，不会出现无关扩增条带。
如图1所示，M：DL2000；1-4为分别含有PPV、JEV、PRV-SA215、PCV1病毒的病料， 5为健康猪淋巴结核酸抽提物；实验结果表明，PPV、JEV都扩增出了明亮的条带，而 PRV-SA215、PCV1、健康猪淋巴结核酸抽提物均未扩增出任何条带，表明该方法具有很强的特异性。
实施例4
用建立的二联PCR检测方法对6份具有繁殖障碍性疾病的病料样品进行PPV、JEV病毒的检测
(1)6个病料样品的选取：经过单一PCR检测，6粉病料PPV和JEV均为阳性的病料
(2)样品的处理；
(3)6个病料样品DNA的提取；
(4)二联PCR反应：
采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg2+溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，去 ddH2O 11.6μL；PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火 30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min；
(5)分别取5μl 6个病料的二联PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳30分钟后在下观察拍照，以标准DNA marker(D,L-2000)作参考，结果如图2所示，可以看出1-6号病料的琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，片段大小分别为750bp，和475bp，说明病料1-6感染了JEV、PPV两种混合病毒。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宜宾职业技术学院
<120> 一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 1(1)
<400> 1
gggaccaggc aacagacat 19
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<212> DNA
<213> 2(2)
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<212> DNA
<213> 4(4)
<400> 4
aagggagcaa ctgcgaca 18
Claims (6)
1.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；
所述引物序列为如下核苷酸序列：
P1：SEQ ID NO：1；
P2：SEQ ID NO：2；
P3：SEQ ID NO：3；
P4：SEQ ID NO：4。
2.根据权利要求1所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg2+溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH2O 11.6μL，其中JEV cDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA。
3.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列；
(2)根据选择的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；
所述引物序列为如下核苷酸序列：
P1：SEQ ID NO：1；
P2：SEQ ID NO：2；
P3：SEQ ID NO：3；
P4：SEQ ID NO：4。
4.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)样品的处理；
(2)病料样品RNA/DNA的提取；
(3)二联PCR反应：
采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，25mmol/L Mg2+溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，去ddH2O 11.6μL；PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min，其中JEV cDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA；
(4)结果判定
取二联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后在凝胶成像系统中观察拍照，以标准DNAmarker(D,L-2000)作参考；电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，且片段大小分别为750bp和475bp，说明病料样品中同时含有PRV、JEV病毒；如果仅出现其中一个对应长度的核酸片段，则表明病料样品中只含有其中一种病毒；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有PRV、JEV病毒。
5.根据权利要求4所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，其特征在于，步骤(4)中，取5μl产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察。
6.根据权利要求4所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，其特征在于，步骤(3)中，JEV的cDNA的合成反应体系：5×PrimeScriptTM缓冲液2μL，PrimeScriptTMRT-EnzymeMix I 0.5μL，40μmol/L Specific down primer 0.25μL，总RNA 2μL，RNase Free ddH2O5.52μL。
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| CN104830995A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-12 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 一种用于同时检测或诊断猪多种病毒感染的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用 |
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- 2021-05-28 CN CN202110594315.3A patent/CN113186355A/zh active Pending
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| 曹洪志: "多重PCR诊断猪5种繁殖障碍性疾病的方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
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