CN116219076A - 一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物及应用 - Google Patents

一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物及应用 Download PDF

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侯晓林
刘凤华
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Abstract

本发明公开了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系检测的LAMP引物组合及其应用，属于生物技术领域。能鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒主要谱系。每种病毒的引物包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB。本发明提供的引物组合物可65℃恒温条件下，60min内实现猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，具有操作简单、快速、灵敏等特点，为猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系分型检测提供了有效的技术手段。

Description

一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物及 应用
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物及应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndromevirus，PRRSV)所引起的一种较为常见的猪传染病，主要表现妊娠期母猪流产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸系统疾病，该病对仔猪影响较大，临床上患病仔猪经常出现肺炎、化长缓慢、死亡率上升等主要症状。此病临床上还表现为耳部皮肤发绀，因此又称为“蓝耳病”。
PRRSV是单股正链RNA病毒，具有欧洲型与美洲型2个基本型，美洲型又包括多个谱系，主要有NADC30-like谱系、高致病性毒株样(HP-like)谱系、VR2332-like谱系等。临床上，PRRSV流行毒株日益多样化和复杂化，给PRRS的有效防控带来很大困难。掌握当全世界PRRSV流行毒株的特点，建立快速、特异的鉴别检测方法，探索有针对性的免疫防控措施，并且有效防控PRRS，具有重要意义。
目前针对PRRSV的检测方法有：实时荧光定量PCR、荧光抗体试验、ELISA等，但以上检测方法均存在试验周期长、操作繁琐、特异性不强等缺点。环介导等温快速检测方法(loopmediated isothermal amplification，LAMP)由日本的Notomi发明的一种能够在恒温条件下快速扩增核酸片段的技术，该技术已被应用到多种动物病毒的检测中，其可以高效、快速、高特异地扩增靶序列，对于操作人员来说也比较简单易行，适合基层养殖户PRRSV病原分型的快速诊断。因此该专利建立了适用于PRRSV分型鉴别的快速检测方法。
发明内容
本发明提供一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的LAMP引物组合物及其应用。具体通过以下技术方案实现：
表1检测PRRSV美洲型NADC30-like谱系的引物
Figure SMS_1
表2检测PRRSV美洲型HP-like谱系的引物
Figure SMS_2
表3检测PRRSV美洲型VR2332-like的引物
Figure SMS_3
表4检测PRRSV欧洲型毒株的引物
Figure SMS_4
所述的引物还包括将上述各F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。
本发明提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以PRRSV谱系检测的应用。
所述的引物组合物在环介导等温扩增(LAMP)方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：8：8：4：4。
所述的环介导等温扩增反应条件为65℃。
本发明还提供了上述组合物在用于PRRSV谱系检测的试剂盒或芯片中的应用，具体为：
在制备PRRSV分型检测试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
所述的试剂盒或芯片的检测步骤包括：
1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组cDNA
2)以步骤1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行对PRRSV各谱系基因的环介导等温扩增。
本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有PRRSV各谱系基因。
应用上述引物组合物可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有PRRSV该谱系基因；如果不可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增，则待测样品中不含有PRRSV该谱系基因。
本发明提供的用于检测PRRSV各谱系基因的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言，能够在1小时内获得检测结果。
附图说明
图1为PRRSVNADC30-like引物扩增曲线。
图2为PRRSV HP-like引物扩增曲线。
图3为PRRSVVR2332-like引物扩增曲线。
图4为PRRSV LV-like引物扩增曲线。
图5为PRRSV谱系引物检测限扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法；
实施例1
分别人工合成PRRSV各谱系特征基因。
使用RNAfast 200总RNA抽提试剂盒分别提取PRRSV基因组，然后分别加入反转录体系，42℃水浴1h。随后70℃水浴10min，冰浴5min，得到PRRSV的cDNA。
使用EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒提取猪基因组。即为PCR反应的模板。
实施例2
将各谱系PRRSV的cDNA，猪基因组用作模板，反应体系如下表；
猪繁殖与呼吸综合征病毒分型检测的LAMP 25ul反应体系：
Figure SMS_5
用PRRSV美洲型NADC30-like谱系的引物组合物扩增，反应体系如上。
Figure SMS_6
结果如图1所示，NADC30-like荧光曲线为特异S型曲线,PRRSV其他谱系的cDNA，猪基因组荧光曲线为近乎基线。引物组1可以特异检测PRRSV的NADC30-like谱系毒株。
实施例3
将各谱系PRRSV的cDNA和猪基因组用作模板，用PRRSV美洲型HP-like谱系引物扩增，反应体系同实施例2；
Figure SMS_7
结果如图2所示，HP-like荧光曲线为特异S型曲线,PRRSV其他谱系的cDNA和猪基因组荧光曲线为近乎基线。引物2组合可以特异检测PRRSVHP-like谱系毒株。
实施例4
将各谱系PRRSV的cDNA和猪基因组用作模板，用PRRSV美洲型VR2332-like谱系引物扩增，反应体系同实施例2；
Figure SMS_8
/>
Figure SMS_9
结果如图3所示，VR2332-like荧光曲线为特异S型曲线，PRRSV其他谱系的cDNA和猪基因组荧光曲线为近乎基线。引物3组合可以特异检测PRRSVVR2332-like毒株。
实施例5
将各谱系PRRSV的cDNA和猪基因组用作模板，用PRRS欧洲型引物扩增，反应体系同实施例2；
Figure SMS_10
结果如图4所示，PRRSV欧洲型荧光曲线为特异S型曲线，PRRSV其他谱系的cDNA和猪基因组荧光曲线为近乎基线。引物4组合可以特异检测PRRSV欧洲型毒株。
实施例6
利用实施例2、3、4、5的引物，分别扩增系列浓度的人工合成猪繁殖与呼吸综合征病毒的NADC30-like基因、HP-like基因、VR2332-like基因、欧洲型(LV-like)基因的质粒，获得检测限。100拷贝质粒代表性图谱见图5。
猪繁殖与呼吸综合征病毒的NADC30-like、HP-like、VR2332-like、LV-like检测限分别为50、100、100和100拷贝。
参考毒株信息如下：
1、PRRSV美洲型NADC30-like谱系，参考毒株GenBank号：JN654459，ORF1a序列位置：2595-3417。
2、PRRSV美洲型HP-like谱系，参考毒株GenBank号：EU860248，ORF1a序列位置：1699-2382。
3、PRRSV美洲型VR2332-like谱系，参考毒株GenBank号：U87392，ORF1a序列位置：1962-2883。
4、PSSSV欧洲株(LV-like)谱系，参考毒株GenBank号：AY588319，ORF1a序列位置：2543-3349。

Claims (8)

1.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型NADC30-like谱系、高致病样HP-like谱系、VR2332-like谱系和欧洲型毒株的引物；
检测繁殖与呼吸综合征病毒美洲型NADC30-like谱系毒株基因的引物组合物，包括以下引物：
Figure FDA0004150723720000011
检测繁殖与呼吸综合征病毒美洲型高致病样HP-like谱系毒株基因的引物组合物，包括以下引物：
Figure FDA0004150723720000012
所述用于检测繁殖与呼吸综合征病毒美洲型VR2332-like谱系毒株基因的引物组合物，包括以下引物：
Figure FDA0004150723720000021
所述用于检测繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株基因的引物组合物，包括以下引物：
Figure FDA0004150723720000022
2.根据权利要求1所述的一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物，其特征在于，所述的组合物包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。
3.据权利要求2所述一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物，其特征在于，在环介导等温扩增方法中用以检测猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1a特征基因。
4.根据权利要求3所述一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物在环介导等温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：8：8：4：4。
5.根据权利要求3所述的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应条件为65℃恒温，60min。
6.根据权利要求1所述的一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系鉴别的引物组合物，其特征在于，在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒基因试剂盒和基因芯片中的应用。
7.一种权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，用于猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系检测检测的试剂盒或芯片中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒和芯片的检测步骤包括：
1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组RNA；
2)以步骤(1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物对不同分型猪繁殖与呼吸综合征病毒特征基因进行环介导等温扩增。
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