KR101236267B1 - 멀티플렉스 실시간 ｒｔ－ｐｃｒ을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 5종 인플루엔자 바이러스 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브를 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행함으로써 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 멀티플렉스 RT-PCR에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트; 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 멀티플렉스 RT-PCR 반응용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다. 본 발명의 멀티플렉스 RT-PCR을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출방법은 기존의 개별검사법에 비해 검사시간이 단축되고, 비용이 감소되며, 검사의 정확성과 용이성을 확보할 수 있으므로, 인플루엔자 바이러스 유전자 검출 및 감시체계(surveillance)에 유용한 기법으로 활용가능하다.
Description
본 발명은 멀티플렉스 실시간 RT-PCR을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
2009년 4월 미국 및 멕시코를 시작으로 전 세계적으로 A/H1N1형 변종 바이러스 (pandemic A/H1N1 2009)가 유행함에 따라 WHO (World Health Organization)에서는 2009년 6월 11일 '대유행(pandemic)'을 선언한 바 있다. 국내에서도 2009년 5월 2일 멕시코를 여행한 환자에서 최초로 감염이 확인되었으며 이후 지역사회 전파를 통하여 전국적 대유행이 발생하였다.
2009년 이후 국내 신종인플루엔자 인체감염 진단 시 질병관리본부 인플루엔자 바이러스과에서 사용하고 있는 유전자 진단법은 미국 CDC (Centers for Diseases Control and Prevention)에서 권고하는 실시간 RT-PCR 방법이며 시,도 보건환경연구원 및 국립검역소에서도 확진법으로 사용하고 있다. 그러나 이 방법의 경우 신종인플루엔자 유전자 중 HA (Hemagglutinin), NP (Nucleoprotein) 그리고 M (Matrix)을 대상으로 하고 있으나 국, 내외적으로 HA유전자 검출 감도 및 NP 유전자의 조류인플루엔자와의 교차반응 등의 문제점이 확인되어 왔다. 특히 계절 인플루엔자바이러스에 대한 감별진단을 개별 시험관에서 실시할 경우 시간과 노력이 많이 소모될 뿐 아니라 실험상의 오류가 발생될 가능성이 높다.
이에 본 발명자들은 신종인플루엔자바이러스를 비롯하여 계절 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형을 동시에 검출한 수 있고, 민감도와 특이도가 향상된 멀티플렉스 한 단계(One step) 실시간 RT-PCR방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 5종 인플루엔자 바이러스(신종 인플루엔자 A/H1N1 2009 인플루엔자 A형, B형 또는 계절 인플루엔자 H1N1, H3N2) 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브를 사용하여 멀티플렉스 실시간 RT-PCR을 수행함으로써 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 멀티플렉스 실시간 RT-PCR에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 멀티플렉스 실시간 RT-PCR 반응용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브; 및
서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브
를 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행함으로써 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브; 및
서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하여 인플루엔자 바이러스 감염 여부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 인플루엔자 바이러스는 신종 인플루엔자 H1N1v; 인플루엔자 A형, B형; 또는 계절 인플루엔자 H1N1, H3N2이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은
인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 멀티플렉스 RT-PCR에 사용되는,
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프로브;
서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브; 및
서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트 및 서열번호 15의 프로브로 구성된 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 멀티플렉스 RT-PCR 반응용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본원발명의 멀티플렉스 실시간 RT-PCR 방법은 현재 국내 신종 인플루엔자 인체감염 진단법인 미국 CDC 방법을 개선하고, 검사의 신속성, 용이성, 민감도 및 특이도를 높였다.
본원발명의 멀티플렉스 실시간 RT-PCR 방법은 미국 CDC 방법과 비교하여 계절 인플루엔자 검출시 유사한 검출 감도를 보였으나 신종 HA 유전자 검출감도가 10배 정도 높게 나타났으며, 형광 시그널(ΔRn) 값 또한 높게 나타나(증폭 그래프가 명확함) 판정의 정확성을 제공한다.
본 발명의 멀티플렉스 RT-PCR을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출방법은 기존의 개별검사법에 비해 검사시간이 단축되고, 비용이 감소되며, 검사의 정확성과 용이성을 확보할 수 있으므로, 인플루엔자 바이러스 유전자 검출 및 감시체계(surveillance)에 유용한 기법으로 활용가능하다.
도 1은 신종인플루엔자 (A/H1N1v) 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 위치를 도시한 것이다(* NIID, National Institute of Infectious Disease, JAPAN; CDC, Center for Disease Control and Prevention, US; KCDC, Center for Disease Control and Prevention, KOREA.)
도 2는 멀티플렉스 One step 실시간 RT-PCR 검출한계를 나타낸 것이다.
도 3은 멀티플렉스 One step 실시간 RT-PCR 정확도를 나타낸 것이다.
도 4는 멀티플렉스 실시간 RT-PCR법을 이용한 신종인플루엔자 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 멀티플렉스 One step 실시간 RT-PCR 검출한계를 나타낸 것이다.
도 3은 멀티플렉스 One step 실시간 RT-PCR 정확도를 나타낸 것이다.
도 4는 멀티플렉스 실시간 RT-PCR법을 이용한 신종인플루엔자 검출 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예
실시예
1:
프라이머
및
프로브
개발
프라이머와 프로브는 인플루엔자 (A, B, H1, H3 그리고 신종인플루엔자 H1) 대상의 유전자를 Genebank NCBI (Nation Center for Biotechnology Information)웹 사이트 (http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 확보[(인플루엔자_A/M: GU811753, GQ454867, CY043564, CY043444, FJ865263, FJ865261, FJ865251, GU183818, CY040291, CY039695), (인플루엔자 B/NP: CY040381, CY037410, CY030786, CY030604, CY033927, EF041672, EF041655, CY019734, CY018224, AJ784080), 계절 인플루엔자 H1: CY040242, GU183807, GQ902833, CY053656, GU111960, AB501378, GQ994958, CY044660, GQ476145, GQ475964), (계절 인플루엔자 H3: CY006043, D13582, GU215034, AB517989, CY039878, FJ769856, EU798796, EU857014, EF566075, CY013669), (신종 인플루엔자 H1: GU565034, GU721168, GU585441, GU585432, GU585423, GU585418, GU585409, GU585404,GU459133, GU459126), (사람 GAPDH: NM_002046, AF261085, NG_007073, AY340484, AC006064, J04038, AK299448, BC013310, M33197, BC029618)]하여 비교 분석하였다. 이후 MegAlign (DNAStar Ver 8.0, USA) 프로그램을 이용하여 각 바이러스 유전자의 유사성을 비교하였다. 또한 Pimer Express 3.0 (ABI, USA) 프로그램으로 프라이머 및 프로브를 제작하였고 BLAST (Basic Local Alignement Search Tool)를 이용하여 각 바이러스에 대한 특이도를 확인하였다 (표 1).
아래 표 1은 제작된 인플루엔자 (A, B, H1, H3 그리고 신종인플루엔자 H1) 유전자의 프라이머 및 프로브 서열을 나타낸다.
| 세트 | 목적 유전자 | 서열 번호 |
프라이머 | 서열 | 위치 | Conn(nM) | 산물 크기 |
| IFN_Multi_rRT 1 | Influenza type A Matrix protein |
1 | Forward | AAT CCT GTC ACC TCT GAC TAA GG | 149~172 | 590 | 99 |
| 2 | Reverse | CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G | 226~247 | 590 | |||
| 3 | Probe | FAM-TGC AGT CCT CGC TCA C-MGBNFQ | 209~224 | 140 | |||
| Influenza type B Nucleocapside protein |
4 | Forward | GAA TGC TGT CAA TGA ATA TTG AGG G | 1485~1509 | 590 | 77 | |
| 5 | Reverse | CAT TGA GTC ATT CAT CAT CTT GAG TAG AT | 1532~1561 | 590 | |||
| 6 | Probe | VIC-TCC TTT GAC ATC TGC AT-MGBNFQ | 1515~1531 | 140 | |||
| IFN_Multi_rRT 2 | H1N1v Hemagglutinin |
7 | Forward | GCA CTC ATT CTG AGG GGA TCA G | 402~421 | 590 | 67 |
| 8 | Reverse | TGC AAG CCC ATA CAC ACA AGC | 450~468 | 590 | |||
| 9 | Probe | FAM-CAC ATA AAT CCT GCC TGC-MGBNFQ | 427~443 | 140 | |||
| IFN_Multi_rRT 3 | Seasonal H1N1 Hemagglutinin |
10 | Forward | CCC CAA GAC AAG TTC ATG GC | 402~421 | 590 | 67 |
| 11 | Reverse | AGC ATG AGG ACA TGC TGC C | 450~468 | 590 | |||
| 12 | Probe | FAM-CAT GAC TCG AAC AAA GG -MGBNFQ | 427~443 | 140 | |||
| Seasonal H3N2 Hemagglutinin |
13 | Forward | TAG AAA ATG GTT GGG AGG GAA TG | 1093~1115 | 590 | 102 | |
| 14 | Reverse | CTG CTT GAG TGC TTT TAA GAT CTG C | 1170~1194 | 590 | |||
| 15 | Probe | VIC-TGG TAC GGT TTCA GGC AT-MGBNFQ | 1125~1142 | 140 |
* Human GAPDH 정보는 제외하였음.
실시예
2: 멀티플렉스 실시간
RT
-
PCR
세트의 구성
멀티플렉스 실시간 RT-PCR은 인플루엔자 A형 또는 B형 검출용 (IFN_Multi_rRT 1), 신종인플루엔자 검출용 (IFN_Multi_rRT 2), 계절 인플루엔자 H1형, H3형 검출용 (IFN_Multi_rRT 3)으로 총 3개의 세트로 구성되었으며 각 리포터 형광물질로 FAM과 VIC을 사용하여 멀티플렉스를 구현하였다. 내위 표준 물질(Internal Positive Control)로는 사람 GAPDH를 사용하여 검체 채취, 핵산 추출 및 증폭반응과정에서의 대조물질로 사용하였다 (표 2).
| 멀티플렉스 세트명 | 목적 유전자 | 리포터 | 대상바이러스 |
| IFN_Multi_rRT 1 | Influenza A-MP | FAM | Influenza A |
| Influenza B-NP | VIC | Influenza B | |
| IFN_Multi_rRT 2 | Pandemic H1v-HA | FAM | 신종 H1N1v |
| IPC-GAPDH | VIC | Human GAPDH | |
| IFN_Multi_rRT 3 | Human H1-HA | FAM | 계절 H1N1 |
| Human H3-HA | VIC | 계절 H3N2 |
실시예
3: 멀티플렉스 실시간
RT
-
PCR
반응
실시간 PCR 반응액의 제조 방법과 온도 조건은 표 3 및 4와 같이 사용되었으며, 총 5 종의 바이러스 검출을 위한 3 세트의 조건은 동일하다.
| Primer/probe Mix | 2 ㎕ |
| 2x buffer | 7.5 ㎕ |
| 25x enzyme | 0.6 ㎕ |
| Template | 4 ㎕ |
| DW 또는 TE buffer | 0.9 ㎕ |
| Total | 15 ㎕ |
| Temp. | Time | Cycle |
| 50℃ | 30 min | 1 |
| 95℃ | 10 min | 1 |
| 95℃ | 15 sec | 40 |
| 55℃ | 30 sec |
실시간 RT-PCR 반응용 조성물은 주형 RNA 4 ㎕, 프라이머 세트(590 nM), 프로브 (140 nM), Agpath ID (Ambion, USA) 25× One-step RT enzyme 0.6 ㎕, 2X buffer 7.5 ㎕ 그리고 잔량은 멸균증류수 0.9 ㎕를 혼합하여, 총 부피를 15 ㎕가 되도록 제조하였다. 또한 실시간 RT-PCR 기종은 ABI 7500 Fast (ABI, USA)를 사용하였고, 프로브의 5'-리포터 부분은 FAM 또는 VIC dye를 사용하였고, 프로브의 3' 켄쳐(Quencher)는 MGBNFQ(minor grove binding no fluorescence quencher)를 붙여 사용하였다 (표 1). 실시간 PCR 반응 조건은 표 4와 같다. 실시간 RT-PCR 증폭 유무는 검출 소프트웨어 (ABI Version 1.4, USA)를 이용하여 실시간으로 분석하였다.
실시예
4: 멀티플렉스 실시간
RT
-
PCR
반응 결과
4-1. 검출한계 (
sensitivity
)
인플루엔자 검출용 멀티플렉스 각 세트 (IFN_Multi_rRT 1-3)의 검출한계는 신종 인플루엔자 바이러스 2.5×107 pfu/ml, 계절 인플루엔자 H1N1 1.3×106 pfu/ml, H3N2 8.4×103 pfu/ml, B형 인플루엔자 1×106 pfu/ml의 역가를 가진 각 바이러스로부터 RNA를 추출 후 10배 단계 희석한 RNA를 주형으로 분석하였다. 또한 A/M과 A/H1v는 복제수가 정해진 RNA로부터 확인할 수 있었고 검출한계는 3.5 복제수 까지 검출 가능하였다 (도 2).
4-2. 정확도 (
specificity
)
검사의 정확도를 측정하기 위하여 인플루엔자 바이러스 H1N1, H3N2, H5N1, PIV 1/2/3, RSV, 아데노바이러스, 리노바이러스, 엔테로바이러스, 코로나바이러스 229E/OC43을 사용하여 동일조건에서 검사를 수행한 결과 멀티플렉스 IFN_Multi_rRT 1/2/3 세트와의 교차반응이 없음을 확인하였다 (도 3).
4-3. 재현성
재현성을 확인하기 위하여 내외부 생육 검출법(inter/intra assay variability) 측정을 3 회 반복테스트를 각각 다른 날짜에 3 회 실시하였다. 각 검사법의 재현성은 CV(%) 5 이하 수준으로 높은 재현성을 보였다 (표 5).
4-4. 미국
CDC
법과 본원발명의 멀티플렉스
RT
-
PCR
방법(
KCDC
)의
검출능
비교
인플루엔자 바이러스과에서 기 확립되어 적용하고 있는 미국 CDC 검사법과 비교결과 인플루엔자 A형(A/M) 유전자 검출법에서 3.5 복제까지는 두 방법 모두 안정적으로 검출되었으나, 신종인플루엔자 H1v유전자에서는 본원발명의 멀티플렉스 RT-PCR 방법(이하, KCDC 방법)에서만 한 자리수 copy수 (3.5 복제)에서만 안정적으로 검출되었다. 따라서 미국 CDC법의 H1v 검출한계가 A/M 검출법에 비해 낮아, 본원발명의 멀티플렉스 RT-PCR 방법을 통하여 낮은 농도의 검체 결과판정의 어려움을 해결할 수 있을 것이다 (도 4 및 표 6). 계절 인플루엔자 H1형, H3형; 및 인플루엔자 B형에서는 유사한 검출능을 보였다.
4-5. 임상검체 평가
본원발명의 멀티플렉스 One step 실시간 RT-PCR 검사방법(KCDC)의 임상검체 평가를 위하여 질병관리본부 인플루엔자 바이러스과, 시,도 보건환경연구원(광주, 인천)과 협력하여 총 453건의 인후 도찰물 검체를 사용하여 대하여 현재 사용하고 있는 미국 CDC 방법과 비교 분석하였다. 미국 CDC 방법과 KCDC 멀티플렉스법은 높은 결과의 일치도를 보였으며, 특히 모든 양성 검체는 (미국 CDC기준) KCDC 방법에서도 양성으로 확인되었다. 또한 미국 CDC 방법 적용 시 인플루엔자 A형-M(matrix)만 검출되어 판정보류 검체에 대하여 KCDC 방법은 정확하게 해석할 수 있었다.
| 검사기관 | 검체수 (N=416) | 비 고 | |||||
| 양 성 | 판정보류 (A/M 만 양성) |
음 성 | |||||
| CDC | KCDC | CDC | KCDC | CDC | KCDC | ||
| 광 주 | 64 | 76 | 61 | 1 | 70 | 63 | 1) 멀티결과 5건 양성 |
| 인 천 | 85 | 85 | 22 | 0 | 64 | 66 | 2) 멀티결과 2건 음성 |
| 질병관리본부 | 116 | 121 | 33 | 0 | 6 | 4 | 3) 멀티결과 2건 H3, 1건 양성 |
| 광 주 | 인 천 | 질병관리본부 (인플루엔자 바이러스과) |
전 체 | |
| 양성결과 일치도 (미국 CDC기준) |
100% (64/64) | 100% (85/85) | 100% (116/116) | 100% |
| 음성결과 일치도 (미국 CDC기준) |
96% (66/69) | 100% (68/68) | 33%* (2/6) | 95% |
* 인플루엔자 바이러스과 음성결과 일치도가 낮은 이유는 음성건수가 적어서 오차가 큼. CDC 음성 6건 중 2건 일치, 4건은 Multi 양성.
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention
<120> The method for detecting pandemic and seasonal influenza virus
using Multiplex Real-Time RT-PCR
<130> IPDC38637
<160> 15
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
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<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 3
tgcagtcctc gctcac 16
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
gaatgctgtc aatgaatatt gaggg 25
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
cattgagtca ttcatcatct tgagtagat 29
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 6
tcctttgaca tctgcat 17
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
gcactcattc tgaggggatc ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
tgcaagccca tacacacaag c 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 9
cacataaatc ctgcctgc 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
ccccaagaca agttcatggc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
agcatgagga catgctgcc 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prboe
<400> 12
catgactcga acaaagg 17
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
tagaaaatgg ttgggaggga atg 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
ctgcttgagt gcttttaaga tctgc 25
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 15
tggtacggtt tcaggcat 18
Claims (6)
- 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브를 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행함으로써 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는 계절 인플루엔자 H1N1임을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법. - 제1항 또는 제2항의 프라이머 및 프로브를 포함하는 멀티플렉스 RT-PCR 반응용 조성물.
- 제3항의 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
- 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트, 및 서열번호 12의 프로브를 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하여 인플루엔자 바이러스 감염 여부에 관한 정보를 제공하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는 계절 인플루엔자 H1N1임을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 여부에 관한 정보를 제공하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120118726A KR101236267B1 (ko) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | 멀티플렉스 실시간 ｒｔ－ｐｃｒ을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120118726A KR101236267B1 (ko) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | 멀티플렉스 실시간 ｒｔ－ｐｃｒ을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100034398A Division KR101223944B1 (ko) | 2010-04-14 | 2010-04-14 | 멀티플렉스 실시간 ｒｔ-ｐｃｒ을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120131144A KR20120131144A (ko) | 2012-12-04 |
| KR101236267B1 true KR101236267B1 (ko) | 2013-02-26 |
Family
ID=47515081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120118726A KR101236267B1 (ko) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | 멀티플렉스 실시간 ｒｔ－ｐｃｒ을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101236267B1 (ko) |
-
2012
- 2012-10-24 KR KR1020120118726A patent/KR101236267B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J Virol Methods, Vol. 167, No. 2, pp. 113-118 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20120131144A (ko) | 2012-12-04 |
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