CN117701768A - 一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合及其应用。本发明基于多重荧光PCR技术具有独特的优势，可以在同一反应管中进行多个病毒的检测，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、新冠病毒ORF 1ab基因及N基因、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及内标的B2M基因。通过同步检测细胞内保守基因B2M，这项技术不仅可以评估采集样本的质量，还能够识别和排除PCR抑制因素，确保检测结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合及其应用。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCoV(SARS-CoV-2)为一种属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。
流行性感冒病毒(Influenza Virus)，简称流感病毒。人流感病毒分为甲、乙、丙三型，它是一种有包膜、分节段基因组的单链RNA病毒，是正粘病毒科的代表种。根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的不同分为不同的亚型。
甲型流感病毒经常发生变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行；乙型流感病毒的核酸变异较小，通常只引起流感的局部爆发；丙型流感病毒相对稳定，且致病力较弱。流感病毒主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触传播。典型的临床症状是发热、全身疼痛、乏力等。
呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，HRSV)是一种RNA病毒，属副粘病毒科，感染婴幼儿后引起的症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后可表现为支气管炎及肺炎。
腺病毒(Human Adenovirus，HADV)是一种没有包膜、直径为70-90nm的双链DNA病毒。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和眼等均可感染，感染呼吸道的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，可能还伴有发热、寒战、头痛等症状。这些病原体引起的临床症状相似，仅靠临床症状难以对这些病原体进行鉴定区分，常见的实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。
目前病毒的检测产品大多只单一性地采用免疫检测或荧光PCR法针对新冠病毒、流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒，并无联合检测产品，无法实现有效筛查。虽有少数联合检测试剂盒，但检测范围覆盖不当，或只进行新冠病毒与流感病毒的同步检测，检测效率太低；或同时检测10余种呼吸道病毒，缺少针对性且患者检测成本过高。而且目前的联合检测基因芯片技术，仪器、研发成本相对较高，灵活度较低，且病毒覆盖种类较少，未能在临床大规模使用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供了一种同时检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合，通过细致的控制探针和引物的设计，确保了检测的可靠性，为疾病的控制和早期治疗提供了坚实的技术支持。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合，包括如下组分：
(1)用于检测新冠病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ IDNo.2所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列；
(2)用于检测甲流感病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ IDNo.5所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.6所示核苷酸序列；
(3)用于检测乙流感病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.7所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ IDNo.8所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.9所示核苷酸序列；
(4)用于检测呼吸道合胞病毒A的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ IDNo.10所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.12所示核苷酸序列；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒B的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ IDNo.13所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.14所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.15所示核苷酸序列；
(6)用于检测腺病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.16所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ IDNo.17所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ IDNo.18所示核苷酸序列。
在上述的一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合中，探针均添加有荧光报告基团。
在上述的一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合中，荧光报告基团包括FAM、Texas Red、CY5、NED中的至少一种。
本发明还提供了一种上述的一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合在制备新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，包括上述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测引物与探针组合。
在上述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中，用于检测靶内标的探针包括具有如SEQ ID No.19所示核苷酸序列，用于检测内标的引物包括具有如SEQ IDNo.20所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.21所示核苷酸序列的反向引物。
在上述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中，用于检测靶基因的探针添加有荧光报告基团VIC。
在上述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中，还含有阳性对照，该阳性对照包括含新型冠状病毒2019-nCoV、甲/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内标B2M基因的假病毒及腺病毒的质粒。
在上述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中，还含有酶混合液，包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶，所述热启动Taq酶的用量为5-10U/人份，所述逆转录酶的用量为3-8U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1-0.2U/人份。
在上述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中，还含有PCR反应液，包括35-40mol/LpH8.0 Tris-HCl，25-50mmol/L(NH4)2SO4，40-45mmol/L KCl，2.5-3.5mmol/L MgCl2，0.25-0.35mol/L dNTPs。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于多重荧光PCR技术具有独特的优势，可以在同一反应管中进行多个病毒的检测，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、新冠病毒ORF 1ab基因及N基因、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及内标的B2M基因。通过同步检测细胞内保守基因B2M，这项技术不仅可以评估采集样本的质量，还能够识别和排除PCR抑制因素，确保检测结果的可靠性。本发明引物和探针的设计特点也非常关键，所有探针的熔解温度(Tm)接近，并且高于引物的Tm值同时所有引物的Tm值也相近，这种设计确保了引物在PCR延伸过程中能够牢固结合目标序列，从而提高了检测的特异性和灵敏性。
附图说明
图1为实施例1阳性对照扩增曲线。
图2为实施例1阴性对照扩增曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明的新型冠状病毒2019-nCoV、甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)包含1管新冠呼四-预混液，1管新冠呼四-酶液，1管新冠呼四-阳性对照，1管新冠呼四-阴性对照，适用的临床样本类型包括：鼻拭子、咽拭子、痰液。
表1：引物与探针组合
表2：探针与基团组合
| 探针 | 荧光报告基团 | 淬灭基团 |
| 新冠病毒探针 | CY5 | BHQ2 |
| 甲流感病毒探针 | FAM | BHQ1 |
| 乙流感病毒探针 | FAM | BHQ2 |
| 呼吸道合胞病毒A探针 | Taxes Red | BHQ2 |
| 呼吸道合胞病毒B探针 | Taxes Red | BHQ2 |
| 腺病毒探针 | NED | BHQ2 |
| 内标B2M基因探针 | VIC | BHQ1 |
表3：组分含量
新冠呼四-预混液包括35-40mol/L pH8.0 Tris-HCl，25-50mmol/L(NH4)2SO4，40-45mmol/L KCl，2.5-3.5mmol/LMgCl2，0.25-0.35mol/L dNTPs，600nM引物探针mix；
新冠呼四-酶液包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶。所述热启动Taq酶的用量为5-10U/人份，所述逆转录酶的用量为3-8U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1-0.2U/人份；
新冠呼四-阳性对照包括含新型冠状病毒2019-nCoV、甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内标B2M基因的假病毒及腺病毒的质粒各10^4Copies/mL；
新冠呼四-阴性对照包括含内标基因的假病毒10^4Copies/mL。
试剂配制：新冠呼四-预混液和新冠呼四-酶液按照1:1的比例混匀后再使用。
表4：反应条件
核酸提取：取300μL待测样本，使用核酸提取或纯化试剂(宁波海尔施基因科技股份有限公司，备案号：浙甬械备20150246号)进行提取；或使用核酸提取或纯化试剂(圣湘生物科技股份有限公司,备案号湘长械备20150021号)，50μL洗脱进行提取，提取方法参见提取试剂说明书。阳性对照参与提取，用于对整个提取和PCR过程进行监控；阴性对照参与提取，用于对环境进行监控。
配制RT-PCR体系：预混液使用前应解冻，并充分混匀，按下列组成配制PCR反应液(N为反应管数)。预混液为5μL×N，酶液为5μL×N；测试数N＝n+2，其中n表示待检测样本数量，另2份为阴阳性对照。应根据实验室情况，适当考虑混合液分装过程中的损耗。将反应混合液振荡混匀，瞬时离心10秒。10μL/管分装至PCR反应管中，分装时应尽量避免产生气泡。将装有反应混合液的反应管移至样本处理区。
加样：分别取阴阳性对照核酸和待检样本核酸各15μL加到装有反应体系的PCR反应管中。盖上管盖，混匀后离心数秒后移至扩增检测区。
RT-PCR扩增：
(1)将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。
(2)循环参数设定如表5所示；
表5：循环参数
表6：ABI 7500荧光定量PCR仪检测通道选择
反应体积(Sample Volume)选择25μL；Passive reference选择None。
质量控制程序：
阴性对照：VIC通道的Ct值≤35，其他通道的Ct值＞40或无扩增曲线。
阳性对照：所有通道的Ct值均≤35。
以上两项需在一次实验中同时满足；否则，本次实验无效，实验应重新进行。
实施例1：
新冠呼四-预混液：35-40mol/L pH8.0 Tris-HCl，25-50mmol/L(NH4)2SO4，40-45mmol/L KCl，2.5-3.5mmol/L MgCl2，0.25-0.35mol/L dNTPs，600nM引物探针mix。
新冠呼四-酶液包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶。所述热启动Taq酶的用量为5-10U/人份，所述逆转录酶的用量为3-8U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1-0.2U/人份。；
新冠呼四-阳性对照包括含新型冠状病毒2019-nCoV、甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内标B2M基因的假病毒及腺病毒的质粒各10^4Copies/mL；
新冠呼四-阴性对照包括含内标基因的假病毒10^4Copies/mL。
实施例2：
新冠呼四-预混液：40-45mol/L pH8.0 Tris-HCl，20-30mmol/L(NH4)2SO4，30-35mmol/L KCl，1.5-2.5mmol/L MgCl2，0.25-0.35mol/L dNTPs，400nM引物探针mix。
新冠呼四-酶液包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶。所述热启动Taq酶的用量为5-10U/人份，所述逆转录酶的用量为5-10U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份；
新冠呼四-阳性对照包括含新型冠状病毒2019-nCoV、甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内标B2M基因的假病毒及腺病毒的质粒各10^5Copies/mL；
新冠呼四-阴性对照包括含内标基因的假病毒10^5Copies/mL。
最低检出限测定：
选择新型冠状病毒2019-nCoV、甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒培养物分别用阴性咽拭子样本稀释至500Copies/mL浓度，并每个样本测试20次计算检出率。
表7：检出率检测结果
2、精密度测定
在重复性条件下，用中低浓度样品测试20次，分别计算测量值的平均值(x)和标准差(S)。按公式CV＝s/x×100％，计算变异系数(CV)。式中：CV-变异系数，S-标准差，x-测量值的平均值。
表8：精密度检测结果
3、阴阳性符合率测定
测试第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品，检测新型冠状病毒核酸检测试剂国家参考品并核对阴阳性是否符合标准。
表9：阴阳性符合率测定结果
图1为实施例1阳性对照扩增曲线。从图中可知，本发明试剂盒在测试包含有新型冠状病毒2019-nCoV甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒靶标的阳性对照时各个靶标均有对应扩增曲线，说明本试剂能够准确检测出相应病原体，检测结果准确。
图2为实施例1阴性对照扩增曲线。从图中可知，本发明试剂在扩增仅包含B2M靶标的阴性对照时，仅B2M靶标检测到信号没有非特异性扩增曲线出现，说明本发明检测结果准确。
综上所述，本发明基于多重荧光PCR技术具有独特的优势，可以在同一反应管中进行多个病毒的检测，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、新冠病毒ORF 1ab基因及N基因、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及内标的B2M基因。通过同步检测细胞内保守基因B2M，这项技术不仅可以评估采集样本的质量，还能够识别和排除PCR抑制因素，确保检测结果的可靠性。本发明引物和探针的设计特点也非常关键，所有探针的熔解温度(Tm)接近，并且高于引物的Tm值同时所有引物的Tm值也相近，这种设计确保了引物在PCR延伸过程中能够牢固结合目标序列，从而提高了检测的特异性和灵敏性。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (10)
1.一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合，其特征在于，包括如下组分：
(1)用于检测新冠病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQID No.3所示核苷酸序列；
(2)用于检测甲流感病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQID No.6所示核苷酸序列；
(3)用于检测乙流感病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.7所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.8所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQID No.9所示核苷酸序列；
(4)用于检测呼吸道合胞病毒A的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.10所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.12所示核苷酸序列；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒B的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.13所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.14所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQ ID No.15所示核苷酸序列；
(6)用于检测腺病毒的引物对和探针，该引物对包括具有如SEQ ID No.16所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.17所示核苷酸序列的反向引物，探针包括具有如SEQID No.18所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合，其特征在于，探针均添加有荧光报告基团。
3.根据权利要求1所述的检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合，其特征在于，荧光报告基团包括FAM、Texas Red、CY5、NED中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的检测新冠、甲/乙型流感、呼吸道合胞及腺病毒的引物与探针组合在制备新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒中的应用。
5.一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任意一项所述的一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测引物与探针组合。
6.根据权利要求5所述一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，其特征在于，用于检测靶内标的探针包括具有如SEQ ID No.19所示核苷酸序列，用于检测内标的引物包括具有如SEQ ID No.20所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQID No.21所示核苷酸序列的反向引物。
7.根据权利要求6所述一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，其特征在于，用于检测靶基因的探针添加有荧光报告基团VIC。
8.根据权利要求5所述一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，其特征在于，还含有阳性对照，该阳性对照包括含新型冠状病毒2019-nCoV、甲/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内标B2M基因的假病毒及腺病毒的质粒。
9.根据权利要求5所述一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，其特征在于，还含有酶混合液，包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶，所述热启动Taq酶的用量为5-10U/人份，所述逆转录酶的用量为3-8U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1-0.2U/人份。
10.根据权利要求5所述一种新冠病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒联合检测试剂盒，其特征在于，还含有PCR反应液，包括35-40mol/L pH8.0 Tris-HCl，25-50mmol/L(NH4)2SO4，40-45mmol/L KCl，2.5-3.5mmol/L MgCl2，0.25-0.35mol/L dNTPs。
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