JP5745202B2 - 前立腺細胞増殖障害の予後に関連する遺伝子発現分析のための方法および核酸 - Google Patents

前立腺細胞増殖障害の予後に関連する遺伝子発現分析のための方法および核酸 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
発明の分野
本発明の態様は、前立腺癌患者において、異種発現パターンを示すヒトＤＮＡ配列に関連し、さらに詳しくは、前記患者の予後を提供する新規組成および方法に関連する。
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年１２月２日に出願された、「前立腺細胞増殖障害の予後に関連する遺伝子発現分析のための方法および核酸」という表題の米国仮出願番号第６０／６３２，４２６号、同表題で２００５年３月１４日に出願された第６０／６６２，２２０号、同表題で２００５年１０月３日に出願された第６０／７２３，１２５号、同表題で２００５年１１月３０日に出願された第６０／＿＿＿，＿＿＿号、２００４年１２月２日に出願された、「前立腺細胞増殖障害の予後に関連する遺伝子発現分析のための方法および核酸」という表題の、第６０／６３３，２５０号、および同表題で２００５年１０月３日に出願された第６０／７２３，０５４号に対する優先権の利益を要求し、それらは全て、参照することによりその全体がここに組み込まれるものとする。
配列リスト
ＰＣＴ実施細則第８０１（ａ）号８項の規定に従って、３．２５ＭＢテキストファイル（４７６＿０００１．ｔｘｔ）として、コンパクトディスク（１ページの１ページ）上に配列リストを提供し、参照することによりその全体がここに組み込まれるものとする。
背景
前立腺癌。前立腺癌は、米国内の男性の間で最もよく見られる悪性腫瘍であり（１年あたり（〜２００，０００人の新規患者）、世界的に見て、男性において癌関連の死因の第６位である（１年あたり〜２０４，０００人）。前立腺癌は、疾患を持つ６０歳から７９歳の男性の約１６％で、主として高齢者の疾患である。剖検時での概算によれば、８０歳以上の男性全体の８０％が、前立腺疾患（例えば、癌、ＢＰＨ、前立腺炎、等）の症状を有する。良性前立腺肥大は、５０歳以上の男性の約５０％、７５歳以上の男性では９５％を占める。これらの報告書によると、前立腺癌は、男性が必ずしも死に至るというわけではないが、一般的に罹患している疾患である。最近の徴候では、より良い治療、手術、および早期発見の結果として、前立腺癌の発生率は、事実、減少傾向にある。
前立腺癌の診断、分子アプローチ。米国癌協会は、前立腺癌スクリーニングに対する現在の指針を以下のように提案している。５０歳の時点で、ヘルスケアの専門家は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のための血液検査を提案し、直腸指診（ＤＲＥ）を実施すべきである。アフリカ系アメリカ人および前立腺疾患の家族歴がある患者のような、高リスク集団は、４５歳でスクリーニングを開始すべきである。前立腺の病理に異常がない男性は、一般に血液内のＰＳＡ値が４ｎｇ／ｍｌ未満である。ＰＳＡ値が４ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間（「グレーゾーン」と称する）である場合は、前立腺癌にかかる確率が２５％である。結果的に、ＤＲＥが異常でおよびＰＳＡ値がグレーゾーンにある男性の７５％は、は、陰性または一見したところ生検の必要がないとされる。グレーゾーンを超えると、前立腺癌にかかる可能性は著しくなり（＞６７％）、ＰＳＡ値が上がるにつれて、さらに増加する。ＰＳＡ（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比、ＰＳＡ速度、ＰＳＡ濃度、等）を測定するための方法は、多数存在し、それぞれが、癌の存在を検出するための関連した精度を有する。検出において多少の改善点があり、スクリーニングに関連して死亡率の低下が見られることが報告されているにもかかわらず、偽陽性の頻度は高いままである。特異度の低下は、一部、ＢＰＨおよび前立腺炎に関連する増加した血液ＰＳＡ値から生じる。現在の指針のもとでは、前立腺生検の４５％までが偽陰性となり、生検でさえ感度の低下をもたらすということも推測されている。
ＴＲＵＳガイド下生検は、前立腺癌を診断するための「標準」であると考えられている。生検の推奨は、ＰＳＡおよび／またはＤＲＥの異常値に基づいている。ＰＳＡに関しては、おそらく生検が必要ではないグレーゾーンが存在する。しかし、グレーゾーンの患者について、生検なしで癌を発見する（４．０から１０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ値）のは困難である。こうした特異度の欠如から、生検を受ける男性の７５％は癌にかかっていないという状態である。しかし、生検なしでは癌を見落とすことになり、罹患率および死亡率の増加につながることになる。残念ながら、不必要な生検に関連する危険性もまた高い。
分子マーカーは、極小サンプル、および組織構造が維持されないサンプルでさえ、効果的に分析するために使用することができる利点を提供する。過去１０年間以内に、前立腺の良性過形成および前立腺癌の異なるグレードの間で差次的発現について、多数の遺伝子の研究がなされている。しかしながら、薬が使用される状況において、前立腺腫瘍の予後分類を十分に示すマーカーは１つもない。
あるいは、特定の例において、高次元のｍＲＮＡを基礎にしたアプローチは、異なる腫瘍のタイプと良性および悪性の病変を識別する手段を提供できる。しかしながら、ｍＲＮＡの極度の不安定な性質は、臨床環境における日常的診断ツールとしての当該のアプローチの出願を妨げ、大幅に制限し、最も重要なことには、日常的生検から頻繁に摂取することができない分析に必要とされる大量のｍＲＮＡにより、急激に起こる発現は、続いて起こる特定の要因（例えば、試料捕集）を変える（例えば、Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：２０−２４、１９９９；Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ． ２１：２５−３２、１９９９を参照）。
前立腺癌における異常遺伝メチル化は、ＧＳＴＰｉ、ＡＲ、ｐ１６（ＣＤＫＮ２ａ／ＩＮＫ４ａ）、ＣＤ４４、ＣＤＨ１を含む、いくつかの遺伝子で観測されている。例えば、ＬＩＮＥ−１の反復成分のゲノム規模での低メチル化はまた、腫瘍進行に関連がある（Ｓａｎｔｏｕｒｌｉｄｉｓ，Ｓ．ら、前立腺 ３９：１６６−７４、１９９９）。
前立腺癌治療の選択肢。前立腺癌と診断される患者に利用可能な多くの治療法があり、患者および医師の決定は、不明確な場合がある。前立腺癌は、ゆっくり進行する疾患であるため、多くの男性は、経過観察および保守的管理と称する治療法を選択する。名称が暗示するように、この方法は、患者を治療することを目的とするいかなる過激な治療を含まない。そのかわり、疾患は、ＰＳＡテストおよびＤＲＥを使用して、注意深く観察される。この方法の理想的な患者は、腫瘍がゆっくり進行し、非侵襲性であり、従って、前立腺癌が問題になる前にその他の死因で亡くなる患者である。
限局性疾患を有する若い患者に対しては、治療処置がさらに適切である。前立腺、願わくは、腫瘍の全ての痕跡を切除するために、根治的前立腺摘除術を使用する。切除縁、精嚢、および時折リンパ節を癌の存在のためにテストし、いずれの場合にも、癌の存在は、無病生存期間を軽減することに関連がある。概して、男性の約７０％は、術後１０年間疾患がないままである（Ｒｏｅｈｌら、２００４）。根治的前立腺摘除術は、血液の喪失、失禁、およびインポテンスを含む副作用を伴う、深刻な手術である。術中合併症および術後合併症の比率は、２％未満であると推定される（Ｌｅｐｏｒら、２００１）。
また、前立腺癌患者を治療するために放射線治療を使用する。患者は、外照射療法または近接照射療法（密封小線源療法）のどちらかを選択できる。生存率および副作用は、根治的前立腺摘除術に類似する（Ｄ’ａｍｉｃｏら、１９９８）。根治的前立腺摘除術および放射線治療の双方に関しては、生存率は、腫瘍のステージおよび分化によって大いに決まる。局部的な不活性腫瘍は、さらに治療できる可能性が高い。
癌が前立腺を超えて広がっている患者、または前立腺摘除術または放射線治療後、癌が再発している患者にホルモン療法を頻繁に使用する。言い換えれば、ホルモン療法は、癌を管理するために使用するが、治療のためではない。ホルモン療法は、時折、放射線療法のようなその他の治療と併用して、または術前の新補助化学療法として使用される。ホルモン療法の目的は、前立腺腫瘍において、アンドロゲンの促進作用を低下させることである。ホルモンの低下は、睾丸摘出、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アナログ、および抗アンドロゲンを通して、達成する。ホルモン療法の副作用は、インポテンス、顔面紅潮、疲労、および性欲減退を含むことができる。最終的には、前立腺腫瘍は、アンドロゲンに対して反応しにくく、ホルモン療法は、もはや効果的ではない。
腫瘍が、被膜外に広がり、ホルモン療法が不成功であった後、痛みを鎮めたり、疾患の進行を遅らせるために、化学療法を使用することができる。化学療法の反応は、可変であり、少数の患者にのみ、寿命を延ばすことができる。骨に転移した腫瘍の骨破壊性活性を低下させるために、ビスホスフォネートを使用する。
前立腺癌予後推定。ＤＲＥ、ＴＲＵＳ、生検、およびＰＳＡは、腫瘍の初期ステージの情報を提供するが、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔスキャン、および骨のスキャンは、前立腺被膜を越える癌のまん延を決定するために使用される。これらのテストは、全ての前立腺癌患者に使用されるわけではなく、転移の可能性のある患者のみに使用される。転移が確認される場合、患者は、疾患の進行を遅らせるように設計された治療を受ける。転移が検出されない場合、患者は、前立腺摘除術および放射線治療のような潜在的治療処置の適応となる。前立腺の切除前に、時折、転移の最終検査として、リンパ節を切開する。切開した節に転移がある場合、手術を中止することができる。前立腺摘除術中外科的に切除された組織の分析は、手術を受けることを選択した患者に対する最終的かつ標準的な病期決定技術である。多くの場合、外科標本の分析は、患者が診断テストにより本来は過小診断されていたことを示す（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ、１９９７）。
予後の正確な推定は、各患者に対する最も適切な治療の選択にとって重要である。臓器に閉じ込められた前立腺癌は、死に至らないため、予後の推定はまた、存在の推定または転移に発展する可能性である。前立腺被膜外に癌が発生する見込みのある患者は、ＭＲＩおよびＣＴスキャンを含む、さらに広範囲に及ぶ診断用精密検査、手術および放射線療法を含む、場合によりさらに根治治療を受ける。
初期予後評価は、ＰＳＡテスト、ＤＲＥ、および生検分析の結果から行われる。ＴＮＭスケールにおいて、病期のスコアを出すために、腫瘍の大きさ、位置、および検出方法を組み合わせる。より高い病期段階の腫瘍および高いＰＳＡ値を有する患者は、前立腺外にまん延している、またはまん延する恐れがある癌を発生する可能性がある。生検の組織学的分析は、病理学者にグリーソンスコアを決定させる。グリーソンスコアは、組織サンプルにおける２つの最も一般的なグレードの合成であり、そのグレードは、１から５段階に分類される。グレードが高いほど、脱分化がさらに大きくなることを示し、集成値が高いほど、転移の可能性がより高くなり、無病生存期間を短くすることに関連する。
前立腺癌ノモグラムは、ＰＳＡ値、グリーソン悪性度、および術前病期診断情報に基づき、一次療法後、癌再発の危険性を予測するために開発され、修正されている（Ｋａｔｔａｎら、２００３；Ｋａｔｔａｎら、１９９８；Ｐｏｔｔｅｒら、２００１）。データは、多数の施設で何千もの患者における実際の患者生存率から生じる。前立腺癌における全ての予後測定と共に、ノモグラムによる再発危険性の推定はまた、前立腺被膜外の癌の存在の可能性の推定である。患者が示す癌の臨床的特徴が、ＰＳＡの普及で変化したため、ノモグラムは、旧式で、広く使用されていない。しかしながら、グリーソン、病期、およびＰＳＡ情報を一体化する一般処理は、いまだに使用される。
リンパ節またはその他の転移部位にまん延する癌を患う患者は、ホルモン療法のような全身療法で治療される。限局性疾患（Ｔ１−Ｔ３）を患う患者は、手術または放射線療法のような決定的療法、治療処置の候補である。低リスクであると考えられる限局性疾患を患う患者は、経過観察の理想的な候補である。中程度のリスクを有する患者は、手術または放射線療法のような単剤療法が理想的である。高リスクの限局性疾患を患う患者は、多様な治療法または臨床試験を考慮すべきである。
腫瘍まん延は、直接に分析できるため、術後、さらなる予後情報が利用可能になる。前立腺摘除術中、リンパ節を直接解離し、結節状態を確認する。全ての手術において、精嚢に転移する腫瘍およびその縁の状態を確認する。陽性の節部、精嚢、および縁は全て、予後が良くないことを示し、患者は、補助療法を受けることを推奨できる。
分子前立腺癌予後マーカー；先行技術のアプローチの欠如。前立腺癌患者の予後分類に対する現在のアプローチに代わるものとして、様々な分子アプローチを検討している。適切な分子マーカーの開発は、精度、費用対効果、および／または患者の侵襲性において、現在のアプローチ上で有意な利点を有することが今後予測される。様々な分子マーカーは、モノクローナル抗体を含み、発見されている。Ｘｕら（ＩＣＤＢ／９５６１３７６３）による調査では、１１４の前立腺癌の症例が、骨髄標本の５７％はＯＶＸ１値（７．２Ｕ／ｍｌより大きい）を高めることを示した。その他の実験では、ＯＶＸ１は、アンドロゲン依存性前立腺癌患者の血清試料よりもアンドロゲン非依存性の血清試料の方が約２倍高く（ｐ値は０．００１より低い）、進行する場合、この疾患は、典型的にアンドロゲン非依存性になるため、血清ＯＶＸ１は、前立腺癌の進行を予期できることを提案する。ＰＳＣＡタンパク質およびｍＲＮＡの発現は、病理的悪性度を増加し（細胞分化が悪い）、臨床病期およびアンドロゲン非依存性を悪化し、前立腺発癌で考え込むような、逆の腫瘍特性との間に正の相関が認められる（Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、４：４１４−９、２００４）。その他の予測ｍＲＮＡ分析マーカーは、ヘプシンを含む。ヘプシンの発現は、低リスク（ｐＴ２、Ｇ２および７より低いグリーソンスコア）の患者と高リスク（ｐＴ３／４、Ｇ３および７以上のグリーソンスコア）の患者間で、再発に対する有意な差異を示した（Ｊ Ｕｒｏｌ、１７１：１８７−９１、２００４）。
ＧＳＴＰｉ遺伝子は、最もよく特徴付ける前立腺癌診断的マーカーである。Ｚｈｏｕら（Ｊ Ｕｒｏｌ、１７１：２１９５−８、２００４）は、最近、ＧＳＴＰｉ遺伝子の発現をグリーソン悪性度および癌のボリュームと関連させた。さらに、辺縁領域に位置する前立腺癌の検出のためのマーカーとしてのＧＳＴＰｉ遺伝子の使用（すなわち、転移の可能性が高いことを伴う）はまた、米国出願番号第１０／３５０，７６３号に記載され、それは、参照することによりその全体がここに組み込まれるものとする。
前立腺癌の予後分類に適しているその他のメチル化マーカーは、ｕＰＡである。Ｒａｂｂａｎｉら（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １７：１０８１−１０８８、２００３）は、ｕＰＡプロモーターは、ホルモン感受性ＰｒＥＣおよびＬＮＣａＰ細胞内の高メチル化およびホルモン不応性ＰＣ−３細胞内の高メチル化であることを示す。ＬＮＣａＰ細胞株内のプロモーターの脱メチル化は、ｍＲＮＡ分析の増加、および浸潤能の増加をもたらす。Ｓｉｎｇａｌらは、前立腺癌において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰｉ１（ＧＳＴＰ１）、レチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲＢ）、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）および１Ａ遺伝子ＲＡＳ関連ドメイン・ファミリー・タンパク質（ＲＡＳＳＦ１Ａ）から成る遺伝子パネルのメチル化を分析した。メチル化指数（ＭＩ）は、メチル化した遺伝子の総数として算出され、より高いＭＩは、ステージIIの疾患と比べて、ステージIIIであり、グリーソンスコア６のサンプルと比べて、グリーソンスコア７を意味する。従って、Ｓｉｎｇａｌらは、その結果は、遺伝子パネルのメチル化が不良な予後の臨床病理的特性と関連があることを示すという結論を出した。
技術的に著しい必要性。しかしながら、薬が使用される状況における効果的利用のために十分な堅固および／または正確である前立腺細胞増殖障害の予後のためのマーカーを提供するのは、どのマーカーも十分開発されていない。
前立腺癌の正確な診断は重要であるものの、前立腺癌治療において最も差し迫った必要性は、治療計画決定の指針となる情報に対してである。
その分野の先導者らは、臨床的に重要でない疾患を有する多くの患者が前立腺摘除術または放射線治療のような不必要な根治治療を受けることに同意する。しかしながら、これらの治療処置をうける患者の２０％が疾患再発を経験する。分子テストは、最適処置を選択し、過不足の治療を軽減するために患者の役に立つ。
現在、治療選択は、疾患のまん延の可能性に基づいて行われる。低リスクの患者は、経過観察の候補である。中程度および高リスクの患者は、手術または放射線療法を受けるべきであり、高リスクの患者は、さらに補助療法の候補である。病期、グリーソン、およびＰＳＡは、現在、このリスクを推定するために使用されるが、これらのテストから組み合わせた情報では、十分ではない。臨床医学者は、どの癌が痛みを伴わないのか確かではないため、経過観察を推奨される患者はほとんどいない。さらに、単剤療法を受ける多くの患者が再発を経験する。
グリーソン悪性度は、現在、予後評価において主な役割を果たす。限局性疾患を患い、グリーソンスコアが高い（８〜１０）患者は、常に根治治療を受ける。グリーソンスコアが低い（２〜５）患者は、治療処置を延期する選択および経過観察を選ぶ選択があるが、多くは、診断後すぐに治癒的療法を受けることを選ぶ。中程度のグリーソンスコアを有する患者、今日診断される大部分の患者にとっては、臨床医学者は、さらなる情報のその他のあまり失敗しない予後指標を使用しなければならない。
それに応じて、新規の、効果的な予後テストに対する大きな技術的必要性があり、特に、生検サンプルのメチル化パターンに基づいて癌が発生する、または前立腺外にまん延する恐れがある可能性を予期する方法が必要である。情報の型は、診断、および治療計画処理において大いに有用である。この情報は、画像検査が転移を確認する完璧な精密診断のために必要であるか否かについて決定を下すために、初期に使用される。癌が既に広がっている患者にとって、手術は必要ではないが、患者が画像検査を選択しない場合、転移は、手術またはその後まで検出できない。
さらに、新規の、効果的な前立腺細胞増殖障害分子分類テストに対する大きな技術的必要性があり、特に、生検サンプルの分析に適していて、患者の成層の低、中、高リスクの分類を向上させ、患者それぞれに最適な処置計画を選択できるものが必要である。正確な分類で、患者および医師は、早期再発のリスクがほとんどない経過観察を自信を持って選択することができる。従って、このテストは、不必要な手術および放射線療法の数を軽減することができる。
さらに、単剤療法で再発する恐れがある患者をより良く推定できることで、医師は、利用可能な補助療法をもっと上手く利用することができる。患者が手術を受けることを選択する場合、テストは前立腺摘除術サンプルで繰り返され、補助療法の必要性の評価を確認することができる。異なる補助療法のアプローチの利点は、今もなお、臨床試験において計画され、分子テストは、利用可能な情報を提供し、さらなる治療、または臨床試験のために患者を階層化することができる。
さらに、ＰＴＸ２、ＲＩＥＧ１、またはＡＲＰ１として知られているＰＩＴＸ２（Ｐａｉｒｅｄ様ホメオドメイン転写因子２）は、ＲＩＥＧ／ＰＩＴＸホメオボックスの仲間の一員を暗号化し、それは、ホメオドメインタンパク質のビコイドクラス内にある。ＰＩＴＸ２は、代替転写を暗号化し、遺伝子における突然変異は、主に目に影響を及ぼす発達障害で常染色体優性の疾患であるリーガー症候群を引き起こす（Ｓｅｍｉｎａら、１９９６）。タンパク質は、転写因子としての役割を果たし、主な臓器の発達に関連する。それは、ＷＮＴ経路により誘発され、増殖調節遺伝子を誘発することにより、細胞型特異的増殖を媒介する（Ｋｉｏｕｓｓｉら、２００２）。
Ｔｏｙｏｔａら（２００１）は、急性骨髄性白血病の大部分において遺伝子の高メチル化を発見した。その出願者による研究（ＷＯ２００５／０５９１７２を参照）では、ＰＩＴＸ２の高メチル化は、乳癌患者に対する不良な予後に関連することを示す。
ＧＰＲ７マーカーは、染色体１０上のイントロンを含まない遺伝子のプロモーター領域内のＣｐＧ島に位置する。ＧＰＲ７、またはＧ−タンパク質受容体７は、神経ペプチドＷおよび神経ペプチドＢの受容体である（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、２００２；Ｔａｎａｋａら、２００３）。ＧＰＲ７の発現は、脳内における研究であり、小脳および前頭葉内で主に発現する（Ｏ’Ｄｏｗｄら、１９９５）。Ｉｓｈｉｉら（２００３）は、ＧＰＲ７の機能的コピーを欠くネズミの表現型を研究した。ネズミは、エネルギーの消費の低下およびブドウ糖およびインスリンの血中濃度増加のような、成人型肥満および代謝障害に発展した。興味深いことに、これらの表現型は、雄のネズミのみに検出された。ＧＰＲ７リガンド、神経ペプチドＷおよびＢはまた、別の研究において代謝および肥満に関与する（Ｓａｍｓｏｎら、２００４；Ｌｅｖｉｎｅら、２００５）。オピオイド受容体の配列に類似する、ＧＰＲ７はまた、痛み信号における役割を果たすことができる（Ｚａｒａｔｉｎら、２００５）。
配列番号：６３は、ヒストン遺伝子を有する領域内の染色体１上のＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦの調節領域内に位置する。クロマチンのヒストン量および状態は、暗号化された遺伝子の発現に影響を及ぼす。前立腺癌においてヒストン遺伝子のメチル化および変化した発現は、さらに浸潤性腫瘍特性をもたらす方法において、遺伝子発現を変化するゲノムを通じて、クロマチン変化を引き起こす。この特定のヒストンの機能における公表された論文はない。
配列番号：３５として参照されるマーカーは、ＦＯＸＬ２（フォークヘッド転写因子）遺伝子の染色体３下流、予測遺伝子またはＥＳＴ内、または付近に位置する。それは下流側にあるものの、マーカーのメチル化は、ＦＯＸＬ２の発現に影響を及ぼし、瞼裂縮小―眼瞼下垂―逆内眼角贅皮症候群（ＢＰＥＳ）に突然変異することを今後予測される。この症候群は、眼、頭蓋顔面、および卵巣異常により特徴化される。マーカーのメチル化はまた、ＥＳＴの発現に影響を及ぼし、またはＥＳＴは、ＦＯＸＬ２遺伝子に対する選択的エクソンに示される。
発明の開示
本発明は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供するための、新規かつ有効な方法および核酸を提供する。
本発明は、その発現が、前立腺細胞増殖障害の予後の指標またはその特性を示すような、表１１に従う遺伝子、ゲノム配列、および／またはその調節領域（またはそれらの１つ以上）を提供することにより、当技術分野での長年にわたる必要性を解決する。前記遺伝子、ゲノム配列、および／または調節領域は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。前記遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。本発明の特に好ましい実施例において、表１１による遺伝子、ゲノム配列、および／またはその調節領域（またはそれらの１つ以上）のＣｐＧの場所のメチル化状態は、前立腺細胞増殖障害の予後またはその特性を示す。前記遺伝子、ゲノム配列、および／または調節領域は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。前記遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。前記前立腺細胞増殖障害は、前立腺癌または前立腺腫瘍であることが特に好ましい。
本分析を可能にするために、本発明は、前立腺細胞増殖障害の発達に関連するゲノムメチル化に対する生体試料の分析方法を提供する。前記方法は、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９およびさらに好ましくは、配列番号：９６１）から成る群からの少なくとも１つの核酸、またはその断片が、ゲノム配列、または該当する配列内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを識別することができる試薬または一連の試薬と接触することを特徴とする。
本発明による方法または核酸は、前立腺細胞増殖障害の予後、監視、および治療および監視の少なくとも１つのために利用することが特に好ましい。
本発明は、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／またはエピジェネティックパラメータを解明する方法を提供する。この方法は、具体的には、前記障害の改善された識別、および前記障害の浸潤性および非浸潤性形態の改善された差別化を可能にすることにより、前立腺細胞増殖障害の改善された予後分類に役立つ。本発明は、最先端技術に対し、実質的な改善を提供する。癌の検出に対するメチル化アッセイが既知ではあるが、現在、腫瘍の予後分類に対する分子分類システムはない。
ＤＮＡソースは、適したソースであればいかなるものでもよい。好ましくは、ＤＮＡのサンプルソースは、細胞または細胞株、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、精液、尿、血液、およびその組み合わせから成る群から選択される。好ましくは、ソースは、生検、体液、精液、尿、または血液である。
特に、本発明は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供する方法であって、ゲノム核酸を含む生体試料を獲得するステップと、核酸、またはその断片を、対象となる核酸の標的配列内で、メチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を識別するために十分な１つの試薬、または複数の試薬と接触させるステップであって、前記標的配列は、ストリンジェントな条件のもとで、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１の少なくとも１６の隣接するヌクレオチド（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９およびさらに好ましくは配列番号：９６１）を含む配列を備え、またはハイブリダイズされ、前記隣接するヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含むステップと、少なくとも一部分において前記の識別に基づいて、少なくとも１つの標的ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、または複数の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態、または平均メチル化状態を反映する値を決定するステップを備える方法を提供する。好ましくは、前記標的配列内でメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を識別することは、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５から成る群、および前記標的配列に対応する隣接する領域から選択される配列内で、その対応する変換型または非変換型ジヌクレオチド配列に、少なくとも１つの当該のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態依存型変換を備える。好ましくは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０から成る群から前記配列を選択し、さらに好ましくは、配列番号：９６２〜９６５から成る群から前記配列を選択する。
さらなる実施例は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供する方法を提供するものであって、対象ゲノムＤＮＡを有する生体試料を獲得するステップと、前記ゲノムＤＮＡを抽出するステップと、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイゼーションの特性において、検出可能な程度にシトシンとは異なるその他の塩基に変換するために、前記ゲノムＤＮＡまたはその断片を、１つ以上の試薬で処理するステップと、処理されたゲノムＤＮＡまたはその処理された断片を、増幅酵素と、いずれの場合にも、少なくとも９ヌクレオチドの長さの、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５から成る群から選択される配列（好ましくは、配列番号１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０から成る前記群、およびさらに好ましくは、９６２〜９６５から成る前記群）、およびその補体から成る群から選択される配列と相補的であるか、または、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズする、隣接する配列を備える、少なくとも２つのプライマーとに接触させるステップであって、前記処理されたＤＮＡまたはその断片は、増幅されて１つ以上の増幅産物を形成するか、または増幅されないステップと、前記増幅産物の有無、または前記増幅産物の特性に基づき、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９から成る前記群、およびさらに好ましくは、配列番号：９６１である）から成る群から選択される少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、または複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態、または平均メチル化状態を反映する値を決定するステップと、を備える方法を提供する。
好ましくは、ハイブリダイズする核酸分子またはペプチド核酸分子のような少なくとも１つは、固相にしなければならない。好ましくは、決定するステップは、少なくとも９ヌクレオチドの長さの、配列番号：６５から配列番号：３２０（好ましくは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０から成る前記群、およびさらに好ましくは、配列番号：９６２〜９６５から成る前記群）、およびその補体から成る群から選択される配列と相補的であるか、または、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズする、隣接する配列を備える、少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズするステップと、少なくとも９ヌクレオチドの長さの、配列番号：６５から配列番号：３２０、および配列番号：９６２から配列番号：９６５（好ましくは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０から成る前記群、およびさらに好ましくは、配列番号：９６２〜９６５から成る前記群）、およびその補体から成る群から選択される配列と相補的であるか、または、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズする、隣接する配列を備える、固相にしなければならない、少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズするステップと、少なくとも９ヌクレオチドの長さの、配列番号：６５から配列番号：３２０、および配列番号：９６２から配列番号：９６５（好ましくは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０から成る前記群、およびさらに好ましくは、配列番号：９６２〜９６５から成る前記群）、およびその補体から成る群から選択される配列と相補的であるか、または、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズする、隣接する配列を備える、少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズするステップと、少なくとも１つのヌクレオチド塩基により少なくとも１つの当該のハイブリダイズされる核酸分子を拡張するステップと、前記増幅産物を配列するステップから成る、群から選択される少なくとも１つの方法を使用することを備える。
さらに実施例は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供する方法を提供するものであって、対象ゲノムＤＮＡを有する生体試料を獲得するステップと、前記ゲノムＤＮＡを抽出するステップと、を含むステップであって、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９から成る前記群、およびさらに好ましくは、前記配列が配列番号：９６１である）から成る群から選択される１つ以上の配列、またはそのストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズする配列を備える前記ゲノムＤＮＡ、またはその断片を、１つ以上のメチル化感受性制限酵素に接触させるステップであって、前記ゲノムＤＮＡは、消化断片を生成するためにそれにより消化されるか、それにより消化されないかのどちらかであるステップと、少なくとも１つの当該断片の有無、または当該断片の特性に基づき、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１から成る群から選択される１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、または複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態、または平均メチル化状態を反映する値を決定するステップとを備える方法を提供する。好ましくは、前記群は配列番号：３５、６３、１９から成り、最も好ましくは前記配列は配列番号：９６１である。好ましくは、前記消化されたゲノムＤＮＡは、前記決定するステップの前に増幅される。
さらに実施例は、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１から成る群からの配列内で、シトシンメチル化パターンの分析のためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーと同様に、新規のゲノムおよび化学的に修飾された核酸配列を提供する。
図面の簡単な説明
図１は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：１９のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図２は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：３５のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図３は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：３７のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図４は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：７のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図５は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：６３のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図６は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：８のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図７は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、ＭＳＰアッセイ配列番号：６４のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。
図８は、１２のＤＮＡサンプルにおけるゲル電気泳動分析を示す。ＤＮＡあたり２００ｎｇを０．８％のアガロース・ゲルに適用した。ゲルを８０ボルトで４時間流した。サイズマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、番号：１０４９６−０１６）は、１０．０００ｂｐ、６．０００ｂｐの断片を含む。
図９は、単一のＰＣＲ生成物（ｓＰＣＲ Ｓｅｔ Ｄ２）と比較する多重送信のＰＣＲ生成物（８ｐｌｅｘ、ｍＰＣＲ Ｓｅｔ Ｄ２）のＡＬＦ Ｅｘｐｒｅｓｓ分析を示す。サイズ標準（レーン１、４）は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｂｐの長さの断片を含んだ。全ての断片を増幅することができた。好ましくない副生物（２２０ｂｐ）を観察した。
図１０は、多重送信ＰＣＲの実施を示す。レーン１：１００ｂｐマーカー。レーン２〜１１：１０のテストサンプルの多重送信ＰＣＲの実施、レーン１２：陽性対照、レーン１３：Ｈ２Ｏ対照。
図１１は、ウィルコクソン検定により順位付けされた腫瘍対リンパ球のサンプルを示す。ボンフェローニの補正をしたｐ値（最大値）およびＡＵＣ（最小値）をデータ行列の右に示す。各行は、１つのサンプルを示し、各列は、１つのオリゴヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチドをマーカー候補ごとに分類した。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加と共に、上からの下の順となっている。各マーカーの右側に、ボンフェローニの補正をしたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを示す。０．７５未満の特異度でＡＵＣ感度以下のものを大括弧で囲んで示している。個々のオリゴヌクレオチドに対する標準偏差で、メチル化データを中心とし、正規化した。色は、平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を示す。濃い灰色は、オリゴヌクレオチド内での高メチル化ＣｐＧを示すが、薄灰色は、オリゴヌクレオチド内での低メチル化ＣｐＧを示す。
図１２は、グリーソンマーカー順位付けにおける高い値と低い値の比較を示す。プロットは、ＧｅｎｅＷｉｓｅのウィルコクソン順位統計分析から補正されていないｐ値を示す。低い破線と高い破線は、それぞれ５％のボンフェローニおよびＦＤＲの境界を示す。
図１３は、最高のＡＵＣ値を有する、１０のマーカーのうちグリーソンマーカーにおける高い値と低い値の比較を示す。グリーソンスコアは、サンプルの各グループの上に示す。各行は、１つのサンプルを示し、各列は、１つのオリゴヌクレオチド（各１、２、または３つのＣｐＧの場所）を示す。オリゴヌクレオチドをマーカー候補ごとに分類した。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加と共に、上からの下の順となっている。各マーカーの右側に、ボンフェローニの補正をしたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを示す。０．７５未満の特異度でＡＵＣ感度以下のものを大括弧で囲んで示している。個々のオリゴヌクレオチドに対する標準偏差で、メチル化データを中心とし、正規化した。色は、平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を示す。濃い灰色は、オリゴヌクレオチド内での高メチル化ＣｐＧを示すが、薄灰色は、オリゴヌクレオチド内での低メチル化ＣｐＧを示す。
図１４は、マーカー順位付けにおける早期再現と再現のないものの比較を示す。プロットは、ＧｅｎｅＷｉｓｅのウィルコクソン順位統計分析から補正されていないｐ値を示す。低い破線と高い破線は、それぞれ５％のボンフェローニおよびＦＤＲ限界を示す。
図１５は、最高のＡＵＣ値を有する、１０のマーカーのメチル化マトリクスにおける早期再現と再現のないものの比較を示す。各行は、１つのサンプルを示し、各列は、１つのオリゴヌクレオチド（各１、２、または３つのＣｐＧの場所）を示す。オリゴヌクレオチドをマーカー候補ごとに分類した。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加と共に、上からの下の順となっている。各マーカーの右側に、ボンフェローニの補正をしたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを示す。０．７５未満の特異度でＡＵＣ感度以下のものを大括弧で囲んで示している。個々のオリゴヌクレオチドに対する標準偏差で、メチル化データを中心とし、正規化した。色は、平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を示す。濃い灰色は、オリゴヌクレオチド内での高メチル化ＣｐＧを示すが、薄灰色は、オリゴヌクレオチド内での低メチル化ＣｐＧを示す。
図１６〜８８に関しては、各図は、各配列番号の分析された増幅産物の配列を示す。各図において、分析された増幅産物は、パネルの「包まれた」級数において表示され、各パネルにおける先頭行（一番上の行）は、増幅されるゲノム配列（ゲノム配列の行）を示し、転送および逆増幅プライマー（「単位複製配列」に定義）は、先頭行より直下のパネル行（プライマーの表示行）で示す。プライマー表示行の下の行（または、プライマーを表示しないパネルにおいて、ゲノム表示行より下の行）は、増幅産物のバイサルファイト変換型配列（バイサルファイト変換型配列の行であって、ＣｐＧの場所は、赤で記される）である。いくつかのパネルにおいて表示される残った行は、増幅産物を分析するために使用されるオリゴヌクレオチド（ＣＧおよびＴＧオリゴ）の検出の配列を示す。
図１６は、配列番号：１４の増幅産物を示す。
図１７は、配列番号：１５の増幅産物を示す。
図１８は、配列番号：１６の増幅産物を示す。
図１９は、配列番号：１７の増幅産物を示す。
図２０は、配列番号：１８の増幅産物を示す。
図２１は、配列番号：１９の増幅産物を示す。
図２２は、配列番号：２０の増幅産物を示す。
図２３は、配列番号：２１の増幅産物を示す。
図２４は、配列番号：２２の増幅産物を示す。
図２５は、配列番号：２３の増幅産物を示す。
図２６は、配列番号：２４の増幅産物を示す。
図２７は、配列番号：２５の増幅産物を示す。
図２８は、配列番号：２６の増幅産物を示す。
図２９は、配列番号：２７の増幅産物を示す。
図３０は、配列番号：２８の増幅産物を示す。
図３１は、配列番号：２９の増幅産物を示す。
図３２は、配列番号：３０の増幅産物を示す。
図３３は、配列番号：３１の増幅産物を示す。
図３４は、配列番号：３２の増幅産物（増幅産物Ａ）を示す。
図３５は、配列番号：３２の増幅産物（増幅産物Ｂ）を示す。
図３６は、配列番号：３３の増幅産物を示す。
図３７は、配列番号：３４の増幅産物を示す。
図３８は、配列番号：３５の増幅産物を示す。
図３９は、配列番号：１３の増幅産物を示す。
図４０は、配列番号：３６の増幅産物を示す。
図４１は、配列番号：３７の増幅産物を示す。
図４２は、配列番号：１の増幅産物を示す。
図４３は、配列番号：２の増幅産物を示す。
図４４は、配列番号：３の増幅産物を示す。
図４５は、配列番号：４の増幅産物を示す。
図４６は、配列番号：５の増幅産物を示す。
図４７は、配列番号：６の増幅産物を示す。
図４８は、配列番号：７の増幅産物を示す。
図４９は、配列番号：３８の増幅産物を示す。
図５０は、配列番号：３９の増幅産物を示す。
図６０は、配列番号：４０の増幅産物を示す。
図６１は、配列番号：４１の増幅産物を示す。
図６２は、配列番号：４２の増幅産物を示す。
図６３は、配列番号：４３の増幅産物を示す。
図６４は、配列番号：４４の増幅産物を示す。
図６５は、配列番号：４５の増幅産物を示す。
図６６は、配列番号：４６の増幅産物を示す。
図６７は、配列番号：４７の増幅産物を示す。
図６８は、配列番号：４８の増幅産物を示す。
図６９は、配列番号：４９の増幅産物を示す。
図７０は、配列番号：５０の増幅産物を示す。
図７１は、配列番号：５１の増幅産物を示す。
図７２は、配列番号：５２の増幅産物を示す。
図７３は、配列番号：５３の増幅産物を示す。
図７４は、配列番号：５４の増幅産物を示す。
図７５は、配列番号：５５の増幅産物を示す。
図７６は、配列番号：５６の増幅産物を示す。
図７７は、配列番号：５７の増幅産物を示す。
図７８は、配列番号：５８の増幅産物を示す。
図７９は、配列番号：５９の増幅産物を示す。
図８０は、配列番号：６０の増幅産物を示す。
図８１は、配列番号：６１の増幅産物を示す。
図８２は、配列番号：６２の増幅産物を示す。
図８３は、配列番号：８の増幅産物を示す。
図８４は、配列番号：９の増幅産物を示す。
図８５は、配列番号：１０の増幅産物を示す。
図８６は、配列番号：１１の増幅産物を示す。
図８７は、配列番号：１２の増幅産物（増幅産物Ａ）を示す。
図８８は、配列番号：１２の増幅産物（増幅産物Ｂ）を示す。
図８９は、実施例５に分析されるような、患者のフォローアップ期間の分布を示す。白い帯は、全ての打ち切り（ＰＳＡ再現がない）患者の分布を示す。灰色の帯は、全ての再発患者に対する無ＰＳＡ生存期間の分布を示す。頻度をＹ軸に示し、期間（月）をＸ軸に示す。
図９０は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＰＩＴＸ２のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合をＹ軸に示し、期間（年）をＸ軸に示す。
図９１は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＧＰＲ７のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。
図９２は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、配列番号：６３のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。
図９３は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、配列番号：３５のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。
図９４は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＡＢＨＤ９のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。
図９５は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＣＣＮＤ２のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。
図９６は、実施例５による、病期に基づき、亜母集団におけるＰＩＴＸ２実施のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。
図９７は、実施例５による、グリーソンスコアに基づき、亜母集団におけるＰＩＴＸ２実施のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。
図９８は、実施例５による、ノモグラムスコアに基づき、亜母集団におけるＰＩＴＸ２実施のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。
図９９は、実施例５による、高グリーソンスコアに基づき、亜母集団における配列番号：６３のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。
図１００は、実施例５による、不良のノモグラムスコアに基づき、亜母集団における配列番号：６３のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。
図１０１は、実施例５による、Ｔ２の亜母集団における配列番号：３５のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。
図１０２は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１０３は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１０４は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１０５は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１０６は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１０７は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１０８は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１０９は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１０は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１１は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１２は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１３は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１４は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１１５は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１１６は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１１７は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。
図１１８は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１９は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２０は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２１は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２２は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２３は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２４は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２５は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
本発明を実施するための最良の形態
定義：
ここに使用される、発現という用語は、遺伝子の転写および翻訳を意味すると解釈されるべきである。遺伝子発現のレベルは、メチル化分析、ヘテロ接合性の消失（以下、ＬＯＨともいう）、ＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルを含むがそれらに限定されない、遺伝子の転写および翻訳のレベルに関連する、または示すいずれの因子の分析により決定することができる。
さらに、転写遺伝子活性は、遺伝変種に限定されない（ＳＮＰ、点変異、欠失、挿入、反復長、再配列およびその他の多型を含むがそれらに限定されない）、遺伝的変異により影響を受けることができる。
ここに使用される、「予後」という用語は、疾患の経過予測（例えば、回帰、状態および転移に限定されない）、特に、浸潤性および前立腺腫瘍の転移能を意味すると解釈されるべきである。
ここに使用される、「予後マーカー」という用語は、疾患の経過予測の指標、特に、浸潤性および前立腺腫瘍の転移能を意味すると解釈されるべきである。
ここに使用される、「予後分類」という用語は、疾患の経過予測による、特に、浸潤性および前立腺腫瘍の転移能による、前立腺細胞増殖障害の分類を意味すると解釈されるべきである。
好ましくは、疾患処理の先天的な異種から生じる、治療後の死亡または再発の高い、低い、および中程度の危険性を有する患者を定義するのに使用される。ここに使用される、前立腺腫瘍について使用される「浸潤性」という用語は、前立腺外に急速にまん延する生物学的可能性を有する前立腺細胞増殖障害を意味すると解釈されるべきである。技術的な腫瘍浸潤性標準の指標は、腫瘍の病期、腫瘍の悪性度、グリーソンの悪性度、結節状態および生存を含むがそれらに限定されない。ここに使用される、「生存」という用語は、死亡までの生存を意味するのに限定されるべきではない（前記死亡が、前立腺細胞増殖障害または前立腺細胞増殖障害関連のいずれに起因するかに関わらず）が、例えば、「無再発生存期間」（再発という用語は、限局性および遠隔再発の双方を含まなければならない）、無転移生存期間、無病生存期間（疾患という用語は、前立腺癌およびそれに関連する疾患を含む）に限定されない、臨床的用語を定義するためにその他の用語との組み合わせで使用することができる。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断の時期および治療開始）および定義された終了点（例えば、死亡、再発または転移）を参照することにより算出することができる。
「観察／期待比（Ｏ／Ｅ比）」という用語は、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を指し、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基数×Ｇ塩基数）］に対応する。
「ＣｐＧ島」という用語は、（１）０．６より大きい「観察／期待比」に対応するＣｐＧジヌクレオチドの頻度を有し、（２）０．５より大きい「ＧＣ含有量」を有する基準を満たすゲノムＤＮＡの隣接する領域を指す。ＣｐＧ島は、常にではないが、典型的に、約０．２から約１ｋｂ、または約２ｋｂの間の長さである。
「メチル化状態」または「メチル化ステータス」という用語は、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドで、５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の有無を指す。ＤＮＡ配列内の１つ以上の特定のＣｐＧメチル化部位でのメチル化状態（２つのＣｐＧ、ＣｐＧジヌクレオチド配列をそれぞれ有する）は、「非メチル化」、「完全メチル化」および「ヘミメチル化」を含む。
「ヘミ・メチル化」または「ヘミメチル化」という用語は、回文ＣｐＧメチル化部位のメチル化状態を指し、回文ＣｐＧメチル化部位の２つのＣｐＧジヌクレオチド配列のうちの１つにおいて、１つのシトシンのみが、メチル化（例えば、５’−ＣＣMＧＧ−３’（トップストランド）：３’−ＧＧＣＣ−５’（ボトムストランド））である。
ここに使用される、「ＡＵＣ」という用語は、曲線下面積の略語である。特に、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を指す。ＲＯＣ曲線は、診断テストの異なる起こり得るカットポイントの無病誤診率に対する真の陽性率のプロットである。それは、選択されたカットポイントにより（感度の増加は、特異度の減少を伴う）、感度と特異度との間の得失評価を示す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断テスト（面積が大きいほどよく、最適条件は１であり、無作為試験は、０．５の面積を有する対角線にあるＲＯＣ曲線を有する。参照：Ｊ．Ｐ．Ｅｇａｎ．Ｓｉｇｎａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ＲＯＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５）の精度の測定である。
「高メチル化」という用語は、正常対照ＤＮＡサンプル内の対応するＣｐＧジヌクレオチドで検出された５−ｍＣｙｔ量に対して、テストＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐジヌクレオチドでの５−ｍＣｙｔの存在の増加に対応する平均メチル化状態を指す。
「低メチル化」という用語は、正常対照ＤＮＡサンプル内の対応するＣｐＧジヌクレオチドで検出された５−ｍＣｙｔ量に対して、テストＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐジヌクレオチドでの５−ｍＣｙｔの存在の減少に対応する平均メチル化状態を指す。
「マイクロアレイ」という用語は、技術的に認められている、「ＤＮＡマイクロアレイ」および「ＤＮＡチップ」の双方を広く指し、全ての技術的に認識された固定用支持を網羅し、それに核酸分子を添付し、またはその上で核酸の合成をするための全ての方法を網羅する。
「遺伝パラメータ」は、その規範にさらに必要とされる遺伝子および配列の突然変異および多型である。突然変異として指定されるものは、特に、挿入、欠失、点変異、反転および多型、特にＳＮＰ（一塩基変異多型）である。
特に、「エピジェネティックパラメータ」は、シトシンメチル化である。さらに、エピジェネティックパラメータは、例えば、記載された方法、言い換えると、ＤＮＡメチル化に関連がある方法を使用して、直接的に分析することができないヒストンのアセチル化を含む。
「バイサルファイト試薬」という用語は、メチル化と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を識別するためにここに述べたように役に立つ、重亜硫酸塩、二硫酸塩、亜硫酸水素塩またはその化合を含む試薬を指す。
「メチル化アッセイ」という用語は、ＤＮＡ配列内で１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するためのアッセイを指す。
「ＭＳ.ＡＰ−ＰＣＲ」（メチル化感受性任意配列プライマーポリメラーゼ連鎖反応）という用語は、ＣｐＧジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に焦点を合わせるために、Ｇｏｎｚａｌｇｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４−５９９、１９９７により記載されるＣＧリッチなプライマーを使用してゲノムのグローバルスキャンを可能にする、技術的に認められている技術を指す。
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM」という用語は、Ｅａｄｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０２−２３０６、１９９９により記載される技術的に認められている蛍光ベースの実時間ＰＣＲ技術を指す。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM」アッセイという用語は、ここに実施されるその実施例において、アッセイを言及し、増幅プライマー間のＣｐＧの位置を覆い、増幅プライマーにより覆われたメチル化特異的遮断プローブ（ここにまた、遮断薬として参照）は、核酸サンプルのメチル化特異選択的増幅を可能にする。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM」アッセイという用語は、ここに実施されるその実施例において、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイを指すが、これはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイの変形であり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイは、増幅プライマー間のＣｐＧの位置をカバーするメチル化特異遮断プローブと結合する。
「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長法）という用語は、Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１、１９９７により記載される技術的に認められているアッセイを指す。
「ＭＳＰ」という用語（メチル化感受性ＰＣＲ）は、ＨｅｒｍａｎらＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６、１９９６、および米国特許番号第５，７８６，１４６号により記載される、技術的に認められているメチル化アッセイを指す。
「ＣＯＢＲＡ」（結合された重亜硫酸塩の制限の分析）という用語は、Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４、１９９７により記載される、技術的に認められているメチル化アッセイを指す。
「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧ島増幅）という用語は、Ｔｏｙｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７−１２、１９９９、およびＷＯ００／２６４０１Ａ１に記載される、メチル化アッセイを指す。
「ハイブリダイゼーション」という用語は、二重構造を形成する、サンプルＤＮＡにおけるワトソン・クリック塩基対合の線図に沿って相補的配列にオリゴヌクレオチドの結合剤として理解される。
ここに定義される、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１．０％ＳＤＳにおいて、６８℃でハイブリダイズすることを含み、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおいて、室温で洗浄すること、またはその技術的に認められている同等な条件（例えば、ハイブリダイゼーションが２．５×ＳＳＣバッファにおいて行われ、続いて低バッファ濃度において３７℃で洗浄され、しかも安定性を保つという条件）を含む。ここに定義される、適度にストリンジェントな条件とは、３×ＳＳＣにおいて４２℃で洗浄すること、またはその技術的に認められている同等条件を含む。塩濃度および温度のパラメータは、前記プローブと標的核酸との間の同一性の最適水準を達成するために、塩濃度および温度のパラメータを変化することができる。当該の状態に関するガイドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．）、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）ユニット２．１０で技術的に利用可能である。
「アレイ配列番号」、「複合アレイ配列番号」、または「複合アレイ配列」という用語は、対象となるアレイ（例えば、その順番において、配列番号：１〜７１のｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ型複合）の全ての個々の隣接する配列のｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ型（５’〜３’）線形複合から成る、仮定に基づいた、またはその他の配列を指す。
「アレイ配列番号ノード」、「複合アレイ配列番号ノード」、または「複合アレイ配列ノード」という用語は、「アレイ配列番号」、「複合アレイ配列番号」または「複合アレイ配列」のいずれの２つの個々の隣接する配列間での接合を指す。
複合アレイ配列に関連して、「隣接するヌクレオチド」という成句は、複合アレイのいずれの個々の隣接する配列に対する隣接する配列を指すが、上記に定義される、「ノード」を含む、複合アレイ配列の領域を含まない。
要約：
本発明は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供するための新規の実用性を有する分子遺伝子マーカーを提供する。特定の実施例において、前記マーカーは、浸潤性および／または侵襲性による腫瘍を分類するために使用することができる。特に、本発明による方法および核酸は、前立腺細胞増殖障害の予後、治療、監査、および治療および監査の少なくとも１つのために使用されることが好ましい。
「予後」という用語は、疾患進行（進行という用語は、治療後再発も含むと解釈されなければならない）の結果予測を意味と解釈される。予後は、全体的な患者生存、疾患または無再発生存率、増加した腫瘍関連の合併症および腫瘍または転移の進行速度において発現し、事前決定レベルに関連して、前記因子の減少（増加した腫瘍関連の合併症の進行速度を除いて）は、「陰性」結果であり、その増加は、「陽性」結果である。事前決定レベルに関連して、腫瘍関連の合併症および腫瘍または転移の進行速度の減少は、「陽性」結果であり、その増加は、「陰性」結果である。
浸潤性癌は陰性結果の高い危険性を有するとされ、非浸潤性癌は陰性結果の低い危険性を有するとされるように、以下では、予後はまた「浸潤性」という点で言及される場合がある。
１つの態様において、陰性結果の危険性の概算を提供するために本発明による予後マーカーを使用する。予測される結果において前立腺癌の特徴付けは、医師に再発および／または死亡の危険性を決定することを可能にする。これは、アジュバント・ホルモン治療、化学治療、および放射線治療などの治療後、再発および死亡の危険性の絶対削減として治療選択に役立つ。治療に起因する危険性における絶対削減は、予測される陰性結果に基づき決定できる。その後、治療に起因する危険性における絶対削減は、患者に対する前記治療の適合性を決定するために、前記治療の難点（例えば、副作用、費用）を比較することができる。
逆に、非浸潤性（すなわち、死亡および／または再発の低い危険性を有する陽性結果）として特徴付けられる癌は、患者がアジュバントまたはその他の治療から得られる絶対的利点は低く、経過観察により適切に治療を受けることができる。そこに、本発明の偉大な利点がある。患者が治療より有意に恩恵を受けないことを決定する手段を提供することにより、本発明は、経過観察に対する適切な候補を識別し、治療の過剰処方を妨げる。
疾患の予測される結果（すなわち、予後）によれば、適切な治療が選択できる。癌が浸潤性として特徴付けられることは、ホルモン治療、化学治療、および放射線治療を含むがこれらに限定されないアジュバント治療が、さらなる治療に加えて、または当該治療の代わりに提供されることが特に好ましい。
ここに記載されるマーカーは、手術治療後、患者の結果を予測するためにさらに使用される。また、以下「予測」マーカーとして言及される。表１１による遺伝子の過剰発現（特に、ＦＯＸＬ２、配列番号：３５、配列番号：６３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦ、ＧＰＲ７およびさらに好ましくは、ＰＩＴＸ２）は、前立腺癌患者の陰性結果に関連する。予測される陽性結果を有する患者（すなわち、低メチル化または過剰発現）は、前記治療後の結果、術後アジュバント療法を有する治療後、再発および死亡の危険性の絶対的減少の低下をもたらす。予測される陰性結果を有する患者（すなわち、高メチル化）は、前記治療後の結果、術後アジュバント療法を有する治療後、再発および死亡の危険性の相対的により大きい絶対的減少をもたらす。従って、前記治療後、陰性結果を有する患者は、陽性結果を有する患者よりもアジュバント治療のより適した候補であると見なされる。従って、陽性結果を有する患者をアジュバント治療の過剰処方されないように阻止することができる。
ＤＮＡのバイサルファイト修飾は、ＣｐＧメチル化状態にアクセスするために使用される技術的に認められているツールである。５−メチルシトシンは、真核細胞ＤＮＡ内で最も頻繁な共有修飾塩基である。例えば、転写の規制において、遺伝子刷り込みにおいて、および腫瘍形成において、役割を果たす。従って、遺伝情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定は、極めて注目されるべきことである。しかしながら、５−メチルシトシンは、シトシンと塩基対合の挙動が同一であるため、５−メチルシトシンの位置は、シークエンシングにより特定できない。さらに、５−メチルシトシンにより媒介されるエピジェネティック情報は、例えば、ＰＣＲ増幅中、完全に喪失する。
５−メチルシトシンの存在に対してＤＮＡを分析するために最も頻繁に使用される方法は、バイサルファイトとシトシンとの特異反応に基づくもので、続くアルカリ加水分解の際にシトシンがウラシルに変換され、その塩基対合の挙動においてチミンに対応する。しかしながら、重要なことに、５−メチルシトシンは、これらの状態のもとで、修飾されないで維持される。最終的に、元のＤＮＡが変換されるが、ハイブリダイゼーションの挙動により、本来はシトシンとは識別できないメチルシトシンが、例えば、増幅およびハイブリダイゼーション、またはシークエンシングなどの標準的で技術的に認められている分子生物学的技法を使用して、現在唯一の残存シトシンとして検出することができるようになる。これらの技法全ては、現在十分に活用できる、特異な塩基対合の特性に基づく。
感度において従来の技術は、分析されるＤＮＡをアガロースマトリクス中に封入してＤＮＡの拡散および再生を防ぐステップと（重亜硫酸塩は、単鎖ＤＮＡとのみ反応する）、高速透析法を用いた全ての沈殿および精製法を差し替えるステップ（Ｏｌｅｋ Ａら、Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０６４−６、１９９６）とを含む方法で定義される。従って、その方法の有用性および感度を示しながら、メチル化状態に対する個別細胞を分析することが可能である。５−メチルシトシンを検出するために技術的に認められている方法の概要は、Ｒｅｉｎ、Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：２２５５、１９９８により提供される。
バイサルファイト技法は、例外を除いて（例えば、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ Ｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．５：９４−９８、１９９７）、現在調査においてのみ使用される。全ての場合に、既知遺伝子の短い、特異的断片は、バイサルファイト治療後、個々のシトシンの位置を分析するために、完全に配列されるか（Ｏｌｅｋ＆Ｗａｌｔｅｒ、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７ １７：２７５−６、１９９７）、１つ以上のプライマー拡張反応に従って（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２５２９−３１、１９９７；ＷＯ９５／００６６９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２５１，５９４）、酵素消化により処理される（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２５３２−４、１９９７）かのどちらかで、増幅される。ハイブリダイゼーションによる検出はまた、技術的に記載される（Ｏｌｅｋら、ＷＯ９９／２８４９８）。さらに、個々の遺伝子に関してメチル化検出のためのバイサルファイト技法の使用を記載する（Ｇｒｉｇｇ＆Ｃｌａｒｋ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１６：４３１−６、１９９４；Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ Ｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、６：３８７−９５、１９９７；Ｆｅｉｌ Ｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：６９５−、１９９４；Ｍａｒｔｉｎ Ｖら、Ｇｅｎｅ、１５７：２６１−４、１９９５；ＷＯ９７４６７０５およびＷＯ９５１５３７３）。
本発明は、１つ以上のメチル化アッセイと組み合わせて、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１から成る群から配列内でＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するためのバイサルファイト技法の使用を提供するものである。好ましくは、前記群は、配列番号：３５、６３、１９から成るものであり、最も好ましくは、前記配列は配列番号：９６１である。本発明によれば、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１から成る群から配列内でＣｐＧジヌクレオチド配列を決定するステップおよび配列番号：９６１は予後有用性を有する。
メチル化アッセイ手順。様々なメチル化アッセイ手順が技術的に知られており、本発明に関連して使用することができる。これらのアッセイは、ＤＮＡ配列内で１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ島）のメチル化状態を決定させる。当該アッセイは、バイサルファイト処理されるＤＮＡのＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲ（配列特異的な増幅に対する）、サザンブロット分析、およびメチル化感受性制限酵素の使用などの技法の中に含まれる。
例えば、ゲノムシークエンシングは、バイサルファイト治療を使用することにより、ＤＮＡメチル化パターンおよび５−メチルシトシン分配の分析を単純にする（Ｆｒｏｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１、１９９２）。さらに、バイサルファイト変換されたＤＮＡから増幅されるＰＣＲ生成物の制限酵素での消化は、例えば、Ｓａｄｒｉ＆Ｈｏｒｎｓｂｙにより記載される方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８−５０５９、１９９６）、またはＣＯＢＲＡ法（結合された重亜硫酸塩の制限の分析）を使用する（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４、１９９７）。
ＣＯＢＲＡ。ＣＯＢＲＡ分析法は、少量のゲノムＤＮＡ内の特異遺伝子座で、ＤＮＡメチル化レベルを決定するために役立つ定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４、１９９７）。つまり、制限酵素での消化は、重亜硫酸ナトリウム処理されるＤＮＡのＰＣＲ生成物にメチル化依存型配列の差異を示すために使用される。メチル化依存型配列の差異は、Ｆｒｏｍｍｅｒらにより記載される手順によれば、標準バイサルファイト治療によりゲノムＤＮＡを初めに持ち込まれる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１、１９９２）。その後、バイサルファイト変換型ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、該当するＣｐＧ島に対して特異的なプライマーを使用して実行され、制限エンドヌクレアーゼでの消化、ゲル電気泳動、および特定の、標識ハイブリダイゼーションプローブを使用する検出に続く。元のＤＮＡサンプルのメチル化レベルは、広範囲のＤＮＡメチル化レベルにわたり、線形的かつ定量的に、相対量の消化および未消化のＰＣＲ生成物により示される。さらに、この技法は、顕微解剖されたパラフィン包埋組織サンプルから得たＤＮＡに正確に適用することができる。ＣＯＢＲＡ分析法に対する標準試薬（例えば、標準ＣＯＢＲＡベースのキットにあるような）は、特異遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはバイサルファイト処理されたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）、制限酵素および適切なバッファ、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ、制御ハイブリダイゼーションオリゴ、オリゴプローブに対するキナーゼ標識キット、および標識ヌクレオチドを含むことができるが、それらに限定されない。さらに、バイサルファイト変換試薬は、ＤＮＡ変性バッファ、スルホン化バッファ、ＤＮＡ再生試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）、脱スルホン化バッファ、およびＤＮＡ再生構成要素などを含む。
好ましくは、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM」（蛍光ベースの実時間ＰＣＲ技法）（Ｅａｄｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６、１９９９）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー延長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１、１９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（“ＭＳＰ”；Ｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６、１９９６；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７８６，１４６）、およびメチル化ＣｐＧ島増幅（“ＭＣＡ”；Ｔｏｙｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７−１２、１９９９）などのアッセイは、これらの方法を単独で、またはこれらのその他の方法と組み合わせで使用する。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ TM 。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイは、ＰＣＲステップ後、これ以上の操作を必要としない蛍光ベースの実時間ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎTM）技法を使用するハイスループット定量メチル化アッセイである（Ｅａｄｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６、１９９９）。つまり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM処理は、標準手順によれば、重亜硫酸ナトリウム反応において、メチル化依存型配列の差異の混合プールに変換されるゲノムＤＮＡの混合サンプルではじまる（バイサルファイト手順は、非メチル化シトシン残渣をウラシルに変換する）。その後、蛍光ベースのＰＣＲは、「非特定的な」（既知ＣｐＧメチル化部位に重ならないプライマーを有する）ＰＣＲ反応か、「特定的な」（既知ＣｐＧジヌクレオチドに重なるＰＣＲプライマーを有する）反応のどちらかで実行される。配列識別は、増幅処理のレベルで、または蛍光検出処理のレベルのどちらかで、またはその両方で起こってもよい。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイは、ゲノムＤＮＡサンプル内のメチル化パターンの定量試験として使用することができ、配列識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量版において、ＰＣＲ反応は、特異推定メチル化部位に重なる蛍光プローブの存在下において、非特定的増幅を提供する。投入ＤＮＡの量の非特定的制御は、プライマーも、プローブにもＣｐＧジヌクレオチドの上に横たわらない反応によって、提供される。また、ゲノムメチル化の定量試験は、既知メチル化部位（「ＭＳＰ」技法の蛍光ベースン版）を「被覆」しない制御オリゴヌクレオチドか、潜在メチル化部位を被覆するオリゴヌクレオチドのどちらかを用いて、特定的ＰＣＲプールのプロービングにより達成される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイ処理は、増幅処理において「ＴａｑＭａｎ(登録商標)」プローブと共に使用することができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウムで処理され、例えば、特定的プライマーおよびＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブか、非特定的プライマーおよびＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブかのどちらかを有するＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブを使用して、２セットのＰＣＲ反応のうちの１つに従う。ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブは、蛍光「レポーター」および「抑制」分子と共に、二重標識化され、相対的に高いＧＣ含有領域に対して特異的であるために策定され、前方または逆プライマーよりもＰＣＲサイクルで約１０℃高い温度で溶解する。これは、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブをＰＣＲアニ−リング／延長ステップ中、完全にハイブリダイズさせる。Ｔａｑポリメラーゼが、ＰＣＲ中、酵素的に新規のストランドを合成する場合、最終的に、アニ−ルしたＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブを達成する。その後、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性は、実時間蛍光検出システムを使用して、消滅していない信号の定量検出のために蛍光レポーター分子を放出するために、それを消化することにより、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブを置換する。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM分析のための標準試薬（例えば、標準ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMベースのキットにあるような）は、特異遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはバイサルファイト処理されたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブ、最適化ＰＣＲバッファおよびデオキシヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼなどを含むことができるが、それらに限定されない。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ。Ｍｓ−ＳNｕＰＥ技法は、ＤＮＡのバイサルファイト治療、そして続く単一ヌクレオチドプライマー延長に基づき、特定のＣｐＧサイトでのメチル化差異を評価するための定量方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１、１９９７）。つまり、ゲノムＤＮＡは、変化しない５−メチルシトシンを離れる場合、重亜硫酸ナトリウムと反応し、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。その後、望ましい標的配列の増幅は、バイサルファイト変換型ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して実行され、結果生成物は、隔離され、該当するＣｐＧ部位でメチル化分析のテンプレートとして使用される。少量のＤＮＡは分析され（例えば、顕微解剖された病理セクション）、ＣｐＧ部位でメチル化状態を決定する制限酵素の利用を避ける。
Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ分析のための標準試薬（例えば、標準Ｍｓ−ＳＮｕＰＥベースのキットにあるような）は、特異遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはバイサルファイト処理されたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）、最適化ＰＣＲバッファおよびデオキシヌクレオチド、およびゲル抽出キット、陽性コントロールプライマー、特異遺伝子に対するＭｓ−ＳｎｕＰＥプライマー、反応バッファ（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応に対する）、および標識化されたヌクレオチドなどを含むことができるが、それらに限定されない。さらに、バイサルファイト変換型試薬は、ＤＮＡ変性バッファ、スルホン化バッファ、ＤＮＡ再生試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）、脱スルホン化バッファ、およびＤＮＡ再生構成要素を含むことができる。
ＭＳＰ。ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、ＣｐＧ島内のＣｐＧ部位の事実上いずれの群のメチル化状態、メチル化感受性制限酵素の使用の依存性を評価することを可能にする（ＨｅｒｍａｎらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６、１９９６；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７８６，１４６）。つまり、ＤＮＡは、メチル化シトシンをウラシルに変換するものではない、全ての非メチル化を変換する重亜硫酸ナトリウムにより修飾され、メチル化対非メチル化ＤＮＡに対する特異的なプライマーで増幅する。ＭＳＰは、少量のＤＮＡのみ必要とし、与えられたＣｐＧ島遺伝子座の０．１％のメチル化対立遺伝子に敏感で、パラフィン包埋サンプルから抽出したＤＮＡにおいて実行することができる。標準試薬（例えば、標準ＭＳＰベースのキットにあるような）は、特異遺伝子に対するメチル化および非メチル化ＰＣＲプライマー（またはバイサルファイト処理されたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）、最適化ＰＣＲバッファおよびデオキシヌクレオチド、および特異的プローブなどを含むことができるが、それらに限定されない。
ＭＣＡ。ＭＣＡ技法は、ゲノムＤＮＡ内の改変メチル化パターンのスクリーニング、およびこれらの変化に関連する特異配列を隔離するために使用できる方法である（Ｔｏｙｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７−１２、１９９９）。つまり、それらの認識部位でシトシンメチル化に対して異なる感度を有する制限酵素は、任意的配列ＰＣＲ増幅より前に、主要な腫瘍、細胞株、および正常組織からゲノムＤＮＡを消化するために使用される。差異的メチル化を示す断片は、高分解能のポリアクリルアミドゲルにＰＣＲ生成物を分解した後、クローン化し、配列化する。その後、クローン化された断片は、これらの領域の差異的メチル化を確認するためにサザン分析のプローブとして使用される。標準試薬（例えば、標準ＭＣＡベースのキットにあるような）は、任意配列プライマーゲノムＤＮＡのＰＣＲプライマー、ＰＣＲバッファおよびヌクレオチド、制限酵素および適切なバッファ、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴまたはプローブ、制御ハイブリダイゼーションオリゴまたはプローブなどを含むことができるが、それらに限定されない。
配列番号：１〜６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９および最も好ましくは配列番号：９６１）によるゲノム配列、および配列番号：６５〜３２０および配列番号：９６２〜９６５（好ましくは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０および最も好ましくは配列番号：９６２〜９６５）により異常に起こる処理された変異は、前立腺細胞増殖障害の予後および／または治療を提供するために使用を有すると決定された。
１つの実施例において、本発明は、対象に前立腺細胞増殖障害の予後を提供するための方法を提供する。特に好ましい実施例において、本発明は、前立腺細胞増殖障害の浸潤性に基づき、分類のための方法を提供する。
前記方法は、
ｉ）表１１による１つ以上の遺伝子または遺伝子配列の発現レベルおよび／またはその調節領域を決定するステップと、
ii）前記の発現レベルによる前記前立腺細胞増殖障害の予後を決定するステップとを含む。
前記発現レベルは、メチル化分析、ヘテロ接合性の消失（以下はまた、ＬＯＨという）、ＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルを含むがそれらに限定されない、技術的かつ標準的ないずれの手段により決定することができる。
従って、前期方法は、そこから転写されたＲＮＡの発現、または前記ＲＮＡから翻訳されたポリペプチドまたはタンパク質のいずれの分析を用いて可能であり、好ましくはｍＲＮＡ発現分析またはポリペプチド発現分析を用いて可能である。従って、本発明はまた、前立腺癌または腫瘍を患う対象において、表１１による遺伝子、ゲノム配列の発現および／または調節領域を検出、および前記対象において、治療成果の予後および／または予測を決定するための定量および質的の双方の予後アッセイおよび方法を提供する。前記遺伝子、ゲノム配列および／または調節領域は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択することが特に好ましい。さらに好ましいものは、遺伝子ＰＩＴＸ２である。

表 １１による遺伝子またはゲノム領域から転写されるｍＲＮＡの異常発現は、特に配列番号：３５、配列番号：６３およびＧＰＲ７、および最も好ましいＰＩＴＸ２は、前立腺癌の治療結果の予後および／または予測に関連する。
遺伝子またはゲノム配列をコード化するｍＲＮＡの存在を検出するために、サンプルは、患者から得られる。前記サンプルは、腫瘍の細胞問題、最も好ましくは、原発腫瘍を含むいずれの適切なサンプルであってもよい。適切なサンプルタイプは、腫瘍細胞または細胞株、組織スライド、パラフィン包埋組織、生検、パラフィンに包埋した組織、体液（前立腺マッサージ流体および尿などのに限定されない）またはいずれの他の適切な生体試料およびその全ての可能な組み合わせを含む。
特に好ましい前記方法の実施例において、前記ソースは、原発腫瘍組織である。前記サンプルは、そこに含まれるＲＮＡを抽出するために処理することができる。その後、前記サンプルに起因する核酸は、分析される。多くの技法は、遺伝子発現の絶対、および相対的レベルを決定するために技術的な状態において周知のことであり、本発明に使用するのに適する一般的な技法は、ｉｎ ｓｉｔｕ（その場）ハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、ノーザン解析、リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイおよび定量的ＰＣＲおよび差次的発現ＰＣＲまたはその他の核酸検出方法などのＰＣＲベースの技法が公知である。
逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用が特に好ましい。ＲＴ−ＰＣＲ法は、技術的分野で公知である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｎｇ、上記参照）。
ＲＴ−ＰＣＲ法は、以下のように実行することができる。例えば、トータル細胞ＲＮＡは、標準グアニジウム・イソチオシアネート法により分離され、トータルＲＮＡは、逆転写される。逆転写法は、逆転写酵素酵素および３’エンドオリゴｄＴプライマーおよび／またはランダムヘキサマープライマーを使用して、テンプレートＲＮＡにＤＮＡ合成を生じる。従って、ｃＤＮＡは、その後、ＰＣＲを用いて増幅される（Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７：２９１９−２９３２、１９８９； Ｋｒｕｇ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｖｏｌ．１５２、ｐｐ．３１６−３２５、１９８７は、参照することにより組み込まれる）。ＲＴ−ＰＣＲ法の「実時間」変形型がさらに好ましく、ＰＣＲ生成物は、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ＆Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）またはＳＹＢＲグリーンを用いて検出される。前記プローブまたはＳＹＢＲグリーンからの検出信号は、その後、標準曲線を参照することによるか、較正基準の曲線のＣｔ値を比較することによるどちらかで定量される。ハウスキーピング遺伝子分析は、頻繁に結果を標準化するために使用される。
ノーザンブロット分析において、トータルまたはｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、変性アガロースゲルを継続し、乾燥ゲル自身の、または細胞膜にある標識プローブへのハイブリダイゼーションにより検出される。結果を示す信号は、ＲＮＡ集団の標的ＲＮＡの量に比例する。
２つ以上の細胞集団または組織からの信号の比較は、遺伝子発現レベルの相対的差異を示す。絶対量測定は、標的ＲＮＡに対応するインビトロ転写の既知量を使用して、生成した標準曲線への信号を比較することにより実行することができる。発現レベルが状態に関わらず相対的に一定であることを期待される遺伝子である、ハウスキーピング遺伝子分析は、頻繁に結果を標準化するために使用され、細胞膜での不均一な運搬ＲＮＡ、またはゲルでＲＮＡの不均一荷重により起こる見かけの差異を削除する。
ノーザンブロット分析における最初のステップは、該当する細胞または組織から純粋な、損なわれていないＲＮＡを分離することである。ノーザンブロット分析は、大きさによりＲＮＡを識別するため、サンプルの完全性は、信号が単一バンドに局部集中する程度に影響を及ぼす。部分的に劣化したＲＮＡサンプルは、感度の総合損失、あるいはデータの誤った解釈を用いていくつかのバンドがなすりつけたように尾を引いたり、または当該のバンドを分布させる信号を生じる。ノーザンブロット分析において、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブを使用することができ、好ましくは、これらのプローブを標識化する（例えば、放射性標識、ｍａｓｓａ標識または蛍光標識）。前記プローブではなく、前記標的ＲＮＡの大きさは、検出バンドの大きさで決定するため、可変長プローブを生成するランダムプライムド法などの方法では、プローブ合成に適している。前記プローブの特異的活性は、感度のレベルを決定するためであり、高特異性活性を有するプローブを使用することが好ましい。
リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイにおいて、定義された長さの標的ＲＮＡおよびＲＮＡプローブは、溶解してハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに続き、前記ＲＮＡは、いずれの非ハイブリダイズされた一本鎖ＲＮＡおよびプローブを除去するために、一本鎖核酸に対して特異的なリボヌクレアーゼを用いて消化される。リボヌクレアーゼを不活性化し、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を変性することにより、ＲＮＡを分離する。損なわれてないＲＮＡプローブの量は、ＲＮＡ集団の標的ＲＮＡの量に比例する。ＲＰＡは、遺伝子発現の相対的および絶対量測定、およびイントロン／エクソン境界および転写開始部位などのＲＮＡ構造のマッピングにも使用することができる。リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイは、一般に低い限度の検出を有する場合、ノーザンブロット分析に好ましい。
ＲＰＡに使用されるアンチセンスＲＮＡプローブは、定義されたエンドポイントを用いて、ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写により生成され、それは、一般的に５０〜６００の範囲のヌクレオチドである。標的ＲＮＡに相同ではない追加配列を含むＲＮＡプローブの使用は、保護された断片を等身大プローブから識別させる。ＲＮＡプローブは、一本鎖ＲＮＡプローブ、ＲＮＡの再現性および信頼性：リボヌクレアーゼを有するＲＮＡ二重消化を生成する容易さにより、一般的にＤＮＡプローブの代わりに使用され（Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３）、高特異性活性を有するプローブを使用することが特に好ましい。
マイクロアレイの使用が特に好ましい。マイクロアレイ解析処理は、２つの主要な部分に分けることができる。第一は、スライド・ガラス上に固定化された既知遺伝子に蛍光標識されたｃＤＮＡ（問合せされた配列を含む）のハイブリダイゼーションすることにより続いて、スライド・ガラス上、またはその他の固体サポート上に既知遺伝子配列の固定化する処理である。ハイブリダイゼーション後、アレイは、蛍光マイクロアレイスキャナーを使用してスキャンされる。異なる遺伝子の相対的蛍光強度の分析は、遺伝子発現における差異の測定を提供する。
ＤＮＡアレイは、準備したスライド・ガラス上に事前合成されたオリゴヌクレオチドを固定化することにより生成することができる。この場合において、代表的な遺伝子配列は、標準オリゴヌクレオチド合成および精製方法を使用して、製造され、準備される。これらの合成された遺伝子配列は、該当する遺伝子（最もこのましくは、ＰＩＴＸ２）に相補的であり、２５から７０の範囲のヌクレオチドにおいて、短い配列になりがちである。あるいは、固定化されたオリゴは、科学的にスライドの表面にｉｎ−ｓｉｔｕに合成することができる。Ｉｎ ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成は、マイクロアレイ上のスポットに逐次添加の適切なヌクレオチドを含み、ヌクレオチドを受け取らないスポットは、物理的または仮想マスクを使用して、各ステージの処理中、保護される。
マイクロアレイ試験をプロファイリングする発現において、使用されるＲＮＡテンプレートは、検査のもとで、細胞または組織の転写分析結果の代表である。初めに、ＲＮＡは、比較される細胞集団または組織から分離される。各ＲＮＡサンプルは、その後、逆転写反応を介して、蛍光標識されたｃＤＮＡを生成するためにテンプレートとして使用される。ｃＤＮＡの蛍光標識は、直接標識するか、間接標識するかのどちらかにより、達成することができる。直接標識する間、蛍光修飾ヌクレオチド（例えば、Ｃｙ(登録商標)３−またはＣｙ(登録商標)５−ｄＣＴＰ）は、逆転写の間、ｃＤＮＡに直接組み込まれる。あるいは、間接標識は、ｃＤＮＡ合成中、アミノアリル修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、達成することができ、逆転写反応完了後、アミノアリル修飾ｃＤＮＡにＮ−ハイドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）−エステル色素を結合することができる。あるいは、前記プローブは、非標識化することができるが、直接または間接的のどちらかで、標識化するリガンドを用いて特異結合することにより検出可能である。リガンド（およびプローブ）を標識化するのに適する標識および方法は、技術分野において公知であり、例えば、既知の方法により組み込むことができる放射性標識（例えば、ニック翻訳法またはｋｉｎａｓｉｎｇ法）を含む。その他の適する標識は、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に誘発されたジオキセタン）、酵素、抗体、およびその同等物を含むが、それらに限定されない。
差異的な遺伝子発現分析を実行するために、異なるＲＮＡサンプルから生成されたｃＤＮＡは、Ｃｙ(登録商標)３を用いて標識化される。結果として生じる標識されたｃＤＮＡは、組み込まれていないヌクレオチド、染色されていない残存ＲＮＡを除去するために精製される。精製に続いて、標識されたｃＤＮＡサンプルは、マイクロアレイにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの厳重さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミド濃度を含む、ハイブリダイゼーション中、および洗浄手順中の多数の要因により決定される。これらの要因は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．、１９８９）に概説される。マイクロアレイは、蛍光マイクロアレイスキャナーを使用して、ハイブリダイゼーション後、スキャンされる。各スポットの蛍光強度は、ぼんやりしたスポットは弱い発現を示すが、明るいスポットは強く発現した遺伝子に対応するその遺伝子の発現レベルを示す。
画像が取得されると、原データを分析しなければならない。初めに、蛍光のバックグラウンドを各スポットの蛍光から削除しなければならない。その後、データは、外から加えられたＲＮＡなどの制御配列、またはアレイ設定、ｃＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーションまたは洗浄における非特異的ハイブリダイゼーション、アレイ不完全性または変動性から成るハウスキーピング遺伝子パネルに標準化する。データ標準化は、比較される多数のアレイの結果を与える。
本発明は、患者から得たサンプルの前記遺伝子配列によりコード化されたポリペプチドの存在の検出のための方法をさらに提供する。
表１１による遺伝子および／またはゲノム領域によりコード化されたポリペプチド（特に、配列番号：３５、配列番号：６３、ＧＰＲ７および最も好ましくは、ＰＩＴＸ２）のポリペプチド発現の異常レベルは、前立腺癌および腫瘍の予後および／または治療結果に関連する。
ポリペプチドを検出するための技術分野で公知のいずれの方法を使用することができる。当該の方法は、質量分析法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学的方法、結合リガンドアッセイ、免疫組織化学的方法、凝集および補体アッセイ（例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照、Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ、ｅｄｓ．、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．ｐｐ２１７−２６２、１９９１、参照により組み込まれる）を含むが、それらに限定されない。１つのまたは複数のエピトープを有する抗体に反応し、標識されたポリペプチドおよびその誘導体を競合的に置換することを含む、結合リガンド免疫測定法が好ましい。
本発明のある実施例は、表１１による遺伝子および／またはゲノム領域によりコード化されたポリペプチド（特に、配列番号：３５、配列番号：６３、ＧＰＲ７および最も好ましくは、ＰＩＴＸ２）の特異的抗体の使用を備える。
当該の抗体は、前立腺癌予後および／または予測用途のために役立つ。ある実施例において、単クローン抗体またはポリクローナル抗体の生成は、抗遺伝子としてコード化されたポリペプチドの使用により誘発することができる。言い換えると、当該の抗体は、前立腺癌予後のためのマーカーとして発現したポリペプチドを検出するために使用することができる。当該のポリペプチドが示すレベルは、従来の方法により定量化することができる。抗体−ポリペプチド結合は、蛍光または放射性リガンドを用いた標識のような技術分野で公知の様々な手段により検出および定量化することができる。本発明は、上記に述べられた手順を実行するキットをさらに備えるものであって、当該キットは、ポリペプチドを詳しく調べるための特異的な抗体を含む。
多数の競合的および非競合的なポリペプチド結合免疫測定法は、技術分野において公知である。当該の測定法に使用される抗体は、例えば、凝集試験に使用されるような非標識であっても、多種多様の測定方法に使用される標識であってもよい。使用できる標識は、放射性核種、酵素、蛍光基質、化学発光基質、酵素基質または共同因子、酵素阻害薬、粒子、染料およびその同等物を含む。好ましいアッセイは、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法およびその同等物を含むが、それらに限定されない。ポリクローナル抗体または単クローン抗体またはそのエピトープは、技術分野における公知の多数の方法のいずれにより、免疫学的検定で使用することができる。
前記方法のほかの実施例において、タンパク質は、ウエスタンブロット分析を用いて検出することができる。前記分析は、技術分野における標準であり、つまり、タンパク質は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動を用いて分離される。その後、分離されたタンパク質は、例えば、ニトロセルロースのような適切な細胞膜（または紙）に転写され、電気泳動により達成される特別分離を保持する。その後、細胞膜は、細胞膜上の粘着場所に保持し結合するために、一般的タンパク質（例えば、乳タンパク質）を用いて培養される。その後、該当するタンパク質に特異的な抗体は添加され、前記抗体は、染色または酵素手段（例えば、アルカリ性ホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ）により検出可能な程度に標識される。その後、細胞膜上の抗体の位置が、検出される。
前記方法のほかの実施例において、前記タンパク質は、免疫組織化学（サンプルの特異的抗原プローブへの抗体の使用）を用いて検出することができる。前記分析は、技術分野における標準であり、組織の抗原の検出は、培養された細胞が一般に免疫組織化学と称するが、免疫組織化学として公知である。つまり、一次抗体は、その特異的抗原を結合することにより検出される。その後、抗体抗原複合体は、二次酵素合成抗原により結合される。必要な基質および色原体の存在下において、結合酵素は、抗体抗原結合部位で着色された沈殿物により検出される。広範な敵するサンプルタイプ、抗体抗原親和性、抗体タイプ、および検出促進法がある。従って、免疫組織化学、または免疫細胞化学的検出の最適条件は、各個々の症例に対して当業者により決定されなければならない。
ポリペプチドへの抗体を調製するための１つの方法は、全てまたは一部のポリペプチドのアミノ酸配列選択または調製であり、アミノ酸配列を科学的に合成し、それを適切な動物、たいていはウサギまたはネズミに注射する方法である（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５；Ｇｕｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７３：１−４６、Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｂａｎａｔｉｓ ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８１、参照により組み込まれる）。ポリペプチドまたはそのエピトープの調製方法は、化学合成、遺伝子組み換え技術または生体試料からの分離を含むが、それらに限定されない。
前記方法の最終ステップにおいて、患者の予後が決定され、過剰発現が陰性予後を示す。過剰発現という用語は、平均、中央値または最適化閾値から成る群から選択できる事前決定されるカットオフよりも検出レベルが大きい場合、発現を意味すると解釈されるべきである。
本発明の他の態様は、前立腺癌を患う対象の予後を提供する際に使用するキットを提供し、表１１による遺伝子またはゲノム領域のポリペプチドを検出する手段を備える（特に、配列番号：３５、配列番号：６３およびＧＰＲ７および最も好ましくはＰＩＴＸ２）。ポリペプチドを検出する手段は、好ましくは、抗体、抗体誘導体、または抗体断片を備える。ポリペプチドは、標識抗体を使用してウェスタンブロット分析を用いて検出されることが最も好ましい。本発明のほかの実施例において、前記キットは、患者の生体サンプルを摂取するための手段をさらに備える。患者の生体試料のポリペプチドを検出するための手段を得るために適した容器を備える、キットであることが好ましく、そのキットの使用説明書および結果の解釈の説明書をさらに含むことが最も好ましい。好ましい実施例において、前立腺癌または腫瘍を患う患者のための治療戦略を決定するステップに使用するキットは、（ａ）表１１による遺伝子またはゲノム領域のポリペプチドを検出する手段（特に、配列番号：３５、配列番号：６３およびＧＰＲ７および最も好ましくはＰＩＴＸ２）、（ｂ）ポリペプチドを有する複合体を形成できる手段およびポリペプチドを含む患者の生体サンプルを含むために適する容器、（ｃ）（ｂ）の複合体を検出する手段、および選択的に（ｄ）そのキット使用説明書および結果の解釈の説明書を備える。
前記キットはまた、別容器で梱包されるブロッキング、洗浄またはコーティングに適するバッファまたは溶液などのその他の構成要素を含むことができる。
前立腺癌を患う対象の予後を提供する際に使用されるキットに関連する本発明のほかの実施例において、前記キットは、表１１による遺伝子（特に、配列番号：３５、配列番号：６３およびＧＰＲ７および最も好ましくはＰＩＴＸ２）またはゲノム領域の転写レベルを測定する手段を備える。好ましい実施例において、転写レベルを測定する手段は、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、表１１による遺伝子またはゲノム領域の転写生成物（特に、配列番号：３５、配列番号：６３およびＧＰＲ７および最も好ましくはＰＩＴＸ２）に、ハイブリダイズできる、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを備える。最も好ましい実施例において、転写レベルは、ノーザンブロット分析、逆転写酵素ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイ、およびマイクロアレイの群から選択される技法により決定される。本発明のその他の実施例において、前記キットは、患者の生体試料を摂取するための手段をさらに備える。転写レベルおよび患者の生体試料を測定するための手段を含むために適する容器を含むことがさらに好ましく、そのキット使用説明書および結果の解釈の説明書をさらに備えることが最も好ましい。
好ましい実施例において、前立腺癌を患う患者に対する治療戦略を決定するステップに使用するキットは、（ａ）適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、表１１による遺伝子またはゲノム領域の転写生成物（特に、配列番号：３５、配列番号：６３およびＧＰＲ７および最も好ましくはＰＩＴＸ２）に、ハイブリダイズできる、複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび前記転写生成物を含む患者の生体サンプルを含むために適する容器であって、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件のもとで、前記転写生成物にハイブリダイズでき、（ｃ）（ｂ）のハイブリダイゼーションを検出するための手段、および選択的に、（ｄ）そのキット使用説明書および結果の解釈の説明書を備える。
前記キットはまた、別容器で梱包されるハイブリダイゼーションバッファ（オリゴヌクレオチドがプローブとして使用される）のようなその他の構成要素を含むことができる。あるいは、別容器で梱包される、オリゴヌクレオチドが標的部位を増幅するために使用される前記キットは、ＰＣＲのようなポリメラーゼにより媒介されるプライマー拡張のために最適化されるポリメラーゼおよび反応バッファを含むことができる。
本発明の実施例によれば、キットは、本発明のその他の態様による方法の発現ステップの決定ためのに使用されることが最も好ましい。
さらなる態様において、本発明は、以下のステップを備えて前立腺癌を患う対象の予後を提供するためのさらなる方法を提供する。前記方法の初期ステップにおいて、サンプルを対象から摂取する。適切なサンプルタイプは、腫瘍細胞または細胞株、組織スライド、パラフィン包埋組織、生検、パラフィンに包埋した組織、体液（前立腺マッサージ流体および尿などに限定されない）またはいずれの他の適切な生体試料およびその全ての可能な組み合わせを含む。本発明に使用するのに適する一般的な技法は、ｉｎ ｓｉｔｕ（その場）ハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、ノーザン解析、リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイおよび定量的ＰＣＲおよび差次的発現ＰＣＲまたはその他の核酸検出方法などのＰＣＲベースの技法を含む。
逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用が特に好ましい。ＲＴ−ＰＣＲ法は、技術的分野で公知である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｎｇ、上記参照）。
ＲＴ−ＰＣＲ法は、以下のように実行することができる。例えば、トータル細胞ＲＮＡは、標準グアニジウム・イソチオシアネート法により分離され、トータルＲＮＡは、逆転写される。逆転写法は、逆転写酵素酵素および３’エンドオリゴｄＴプライマーおよび／またはランダムヘキサマープライマーを使用して、テンプレートＲＮＡにＤＮＡ合成を生じる。従って、ｃＤＮＡは、その後、ＰＣＲを用いて増幅される（Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７：２９１９−２９３２、１９８９；Ｋｒｕｇ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｖｏｌ．１５２、ｐｐ．３１６−３２５、１９８７は、参照することにより組み込まれる）。ＲＴ−ＰＣＲ法の「実時間」変形型がさらに好ましく、ＰＣＲ生成物は、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ＆Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）またはＳＹＢＲグリーンを用いて検出される。前記プローブまたはＳＹＢＲグリーンからの検出信号は、その後、標準曲線を参照することによるか、較正基準の曲線のＣｔ値を比較することによるどちらかで定量される。ハウスキーピング遺伝子分析は、頻繁に結果を標準化するために使用される。
ノーザンブロット分析において、トータルまたはｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、変性アガロースゲルを継続し、乾燥ゲル自身の、または細胞膜にある標識プローブへのハイブリダイゼーションにより検出される。結果を示す信号は、ＲＮＡ集団の標的ＲＮＡの量に比例する。
２つ以上の細胞集団または組織からの信号の比較は、遺伝子発現レベルの相対的差異を示す。絶対量測定は、標的ＲＮＡに対応するインビトロ転写の既知量を使用して、生成した標準曲線への信号を比較することにより実行することができる。発現レベルが状態に関わらず相対的に一定であることを期待される遺伝子である、ハウスキーピング遺伝子分析は、頻繁に結果を標準化するために使用され、細胞膜での不均一な運搬ＲＮＡ、またはゲルでＲＮＡの不均一荷重により起こる見かけの差異を削除する。
ノーザンブロット分析における最初のステップは、該当する細胞または組織から純粋な、損なわれていないＲＮＡを分離することである。ノーザンブロット分析は、大きさによりＲＮＡを識別するため、サンプルの完全性は、信号が単一バンドに局部集中する程度に影響を及ぼす。部分的に劣化したＲＮＡサンプルは、感度の総合損失、あるいはデータの誤った解釈を用いていくつかのバンドがなすりつけたように尾を引いたり、または当該のバンドを分布させる信号を生じる。ノーザンブロット分析において、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブを使用することができ、好ましくは、これらのプローブを標識化する（例えば、放射性標識、ｍａｓｓａ標識または蛍光標識）。前記プローブではなく、前記標的ＲＮＡの大きさは、検出バンドの大きさで決定するため、可変長プローブを生成するランダムプライムド法などの方法では、プローブ合成に適している。前記プローブの特異的活性は、感度のレベルを決定するためであり、高特異性活性を有するプローブを使用することが好ましい。
リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイにおいて、定義された長さの標的ＲＮＡおよびＲＮＡプローブは、溶解してハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに続き、前記ＲＮＡは、いずれの非ハイブリダイズされた一本鎖ＲＮＡおよびプローブを除去するために、一本鎖核酸に対して特異的なリボヌクレアーゼを用いて消化される。リボヌクレアーゼを不活性化し、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を変性することにより、ＲＮＡを分離する。損なわれてないＲＮＡプローブの量は、ＲＮＡ集団の標的ＲＮＡの量に比例する。ＲＰＡは、遺伝子発現の相対的および絶対量測定、およびイントロン／エクソン境界および転写開始部位などのＲＮＡ構造のマッピングにも使用することができる。リボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイは、一般に低い限度の検出を有する場合、ノーザンブロット分析に好ましい。
ＲＰＡに使用されるアンチセンスＲＮＡプローブは、定義されたエンドポイントを用いて、ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写により生成され、それは、一般的に５０〜６００の範囲のヌクレオチドである。標的ＲＮＡに相同ではない追加配列を含むＲＮＡプローブの使用は、保護された断片を等身大プローブから識別させる。ＲＮＡプローブは、一本鎖ＲＮＡプローブ、ＲＮＡの再現性および信頼性：リボヌクレアーゼを有するＲＮＡ二重消化を生成する容易さにより、一般的にＤＮＡプローブの代わりに使用され（Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３）、高特異性活性を有するプローブを使用することが特に好ましい。
マイクロアレイの使用が特に好ましい。マイクロアレイ解析処理は、２つの主要な部分に分けることができる。第一は、スライド・ガラス上に固定化された既知遺伝子に蛍光標識されたｃＤＮＡ（問合せされた配列を含む）のハイブリダイゼーションすることにより続いて、スライド・ガラス上、またはその他の固体サポート上に既知遺伝子配列の固定化する処理である。ハイブリダイゼーション後、アレイは、蛍光マイクロアレイスキャナーを使用してスキャンされる。異なる遺伝子の相対的蛍光強度の分析は、遺伝子発現における差異の測定を提供する。
ＤＮＡアレイは、準備されたスライド・ガラス上に事前合成されたオリゴヌクレオチドを固定化することにより生成することができる。この場合において、代表的な遺伝子配列は、標準オリゴヌクレオチド合成および精製方法を使用して、製造され、準備される。これらの合成された遺伝子配列は、該当する遺伝子（最もこのましくは、ＰＩＴＸ２）に相補的であり、２５から７０の範囲のヌクレオチドにおいて、短い配列になりがちである。あるいは、固定化されたオリゴは、科学的にスライドの表面にｉｎ−ｓｉｔｕに合成することができる。Ｉｎ ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成は、マイクロアレイ上のスポットに逐次添加の適切なヌクレオチドを含み、ヌクレオチドを受け取らないスポットは、物理的または仮想マスクを使用して、各ステージの処理中、保護される。
マイクロアレイ試験をプロファイリングする発現において、使用されるＲＮＡテンプレートは、検査のもとで、細胞または組織の転写分析結果の代表である。初めに、ＲＮＡは、比較される細胞集団または組織から分離される。各ＲＮＡサンプルは、その後、逆転写反応を介して、蛍光標識されたｃＤＮＡを生成するためにテンプレートとして使用される。ｃＤＮＡの蛍光標識は、直接標識するか、間接標識するかのどちらかにより、達成することができる。直接標識する間、蛍光修飾ヌクレオチド（例えば、Ｃｙ(登録商標)３−またはＣｙ(登録商標)５−ｄＣＴＰ）は、逆転写の間、ｃＤＮＡに直接組み込まれる。あるいは、間接標識は、ｃＤＮＡ合成中、アミノアリル修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、達成することができ、逆転写反応完了後、アミノアリル修飾ｃＤＮＡにＮ−ハイドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）−エステル色素を結合することができる。あるいは、前記プローブは、非標識化することができるが、直接または間接的のどちらかで、標識化するリガンドを用いて特異結合することにより検出可能である。リガンド（およびプローブ）を標識化するのに適する標識および方法は、技術分野において公知であり、例えば、既知の方法により組み込むことができる放射性標識（例えば、ニック翻訳法またはｋｉｎａｓｉｎｇ法）を含む。その他の適する標識は、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に誘発されたジオキセタン）、酵素、抗体、およびその同等物を含むが、それらに限定されない。
差異的な遺伝子発現分析を実行するために、異なるＲＮＡサンプルから生成されたｃＤＮＡは、Ｃｙ(登録商標)３を用いて標識化される。結果として生じる標識されたｃＤＮＡは、組み込まれていないヌクレオチド、染色されていない残存ＲＮＡを除去するために精製される。精製に続いて、標識されたｃＤＮＡサンプルは、マイクロアレイにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの厳重さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミド濃度を含む、ハイブリダイゼーション中、および洗浄手順中の多数の要因により決定される。これらの要因は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．、１９８９）に概説される。マイクロアレイは、蛍光マイクロアレイスキャナーを使用して、ハイブリダイゼーション後、スキャンされる。各スポットの蛍光強度は、ぼんやりしたスポットは弱い発現を示すが、明るいスポットは強く発現した遺伝子に対応するその遺伝子の発現レベルを示す。
画像が取得されると、原データを分析しなければならない。初めに、蛍光のバックグラウンドを各スポットの蛍光から削除しなければならない。その後、データは、外から加えられたＲＮＡなどの制御配列、またはアレイ設定、ｃＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーションまたは洗浄における非特異的ハイブリダイゼーション、アレイ不完全性または変動性から成るハウスキーピング遺伝子パネルに標準化する。データ標準化は、比較される多数のアレイの結果を与える。
本発明は、患者から得たサンプルの前記遺伝子配列によりコード化されたポリペプチドの存在の検出のための方法をさらに提供する。
表１１による遺伝子および／またはゲノム領域によりコード化されたポリペプチド（特に、ＦＯＸＬ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦおよびＧＰＲ７、および最も好ましくは、ＰＩＴＸ２）のポリペプチド発現の異常レベルは、前立腺癌および腫瘍の予後および／または治療結果に関連する。
ポリペプチドを検出するための技術分野で公知のいずれの方法を使用することができる。当該の方法は、質量分析法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学的方法、結合リガンドアッセイ、免疫組織化学的方法、凝集および補体アッセイ（例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照、Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ、ｅｄｓ．、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．ｐｐ２１７−２６２、１９９１、参照により組み込まれる）を含むが、それらに限定されない。１つのまたは複数のエピトープを有する抗体に反応し、標識されたポリペプチドおよびその誘導体を競合的に置換することを含む、結合リガンド免疫測定法が好ましい。
本発明のある実施例は、表１１から選択される遺伝子、好ましくは、ＦＯＸＬ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦまたはＧＰＲ７および最も好ましくは、ＰＩＴＸ２によりコード化されたポリペプチドの特異的抗体の使用を備える。
当該の抗体は、前立腺癌予後および／または予測用途のために役立つ。ある実施例において、単クローン抗体またはポリクローナル抗体の生成は、抗遺伝子としてコード化されたポリペプチドの使用により誘発することができる。言い換えると、当該の抗体は、前立腺癌予後のためのマーカーとして発現したポリペプチドを検出するために使用することができる。当該のポリペプチドが示すレベルは、従来の方法により定量化することができる。抗体−ポリペプチド結合は、蛍光または放射性リガンドを用いた標識のような技術分野で公知の様々な手段により検出および定量化することができる。本発明は、上記に述べられた手順を実行するキットをさらに備えるものであって、当該キットは、ポリペプチドを詳しく調べるための特異的な抗体を含む。
多数の競合的および非競合的なポリペプチド結合免疫測定法は、技術分野において公知である。当該の測定法に使用される抗体は、例えば、凝集試験に使用されるような非標識であっても、多種多様の測定方法に使用される標識であってもよい。使用できる標識は、放射性核種、酵素、蛍光基質、化学発光基質、酵素基質または共同因子、酵素阻害薬、粒子、染料およびその同等物を含む。好ましいアッセイは、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法およびその同等物を含むが、それらに限定されない。ポリクローナル抗体または単クローン抗体またはそのエピトープは、技術分野における公知の多数の方法のいずれにより、免疫学的検定で使用することができる。
前記方法の別の実施例において、前記タンパク質は、ウエスタンブロット分析を用いて検出することができる。前記分析は、技術分野における標準であり、つまり、タンパク質は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動を用いて分離される。その後、分離されたタンパク質は、例えば、ニトロセルロースのような適切な細胞膜（または紙）に転写され、電気泳動により達成される特別分離を保持する。その後、細胞膜は、細胞膜上の粘着場所に保持し結合するために、一般的タンパク質（例えば、乳タンパク質）を用いて培養される。その後、該当するタンパク質に特異的な抗体は添加され、前記抗体は、染色または酵素手段（例えば、アルカリ性ホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ）により検出可能な程度に標識される。その後、細胞膜上の抗体の位置が、検出される。
前記方法の別の実施例において、前記タンパク質は、免疫組織化学（サンプルの特異的抗原プローブへの抗体の使用）を用いて検出することができる。前記分析は、技術分野における標準であり、組織の抗原の検出は、培養された細胞が一般に免疫組織化学と称するが、免疫組織化学として公知である。つまり、一次抗体は、その特異的抗原を結合することにより検出される。その後、抗体抗原複合体は、二次酵素合成抗原により結合される。必要な基質および色原体の存在下において、結合酵素は、抗体抗原結合部位で着色された沈殿物により検出される。広範な敵するサンプルタイプ、抗体抗原親和性、抗体タイプ、および検出促進法がある。従って、免疫組織化学、または免疫細胞化学的検出の最適条件は、各個々の症例に対して当業者により決定されなければならない。
ポリペプチドへの抗体を調製するための１つの方法は、全てまたは一部のポリペプチドのアミノ酸配列選択または調製であり、アミノ酸配列を科学的に合成し、それを適切な動物、たいていはウサギまたはネズミに注射する方法である（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５；Ｇｕｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７３：１−４６、Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｂａｎａｔｉｓ ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８１、参照により組み込まれる）。ポリペプチドまたはそのエピトープの調製方法は、化学合成、遺伝子組み換え技術または生体試料からの分離を含むが、それらに限定されない。
特に好ましい実施例において、表１１による遺伝子、ゲノム配列および／または調節領域の発現レベルは、前記遺伝子、ゲノム配列および／またはその調節領域のメチル化レベルを分析することにより決定される。前記遺伝子、ゲノム配列および／またはその調節領域のメチル化レベルは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを決定することにより決定されることが好ましい。前記遺伝子、ゲノム配列および／またはその調節領域のメチル化レベルは、複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを決定することにより決定されることがさらに好ましい。前記遺伝子、ゲノム配列および／または調節領域は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。前記遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。前記分析は、
ｉ）前記対象から得たゲノムＤＮＡを、前記ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的部位内で、メチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを識別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬に接触させるステップを含み、前記隣接するヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を備え、
ii）ｉ）で分析された前記標的部位のメチル化状態から決定する場合、その予後による前立腺細胞増殖障害を分類するステップと、を備える。
ゲノムＤＮＡは、市販のキットを含む、技術分野においていずれの標準手段により分離することができる。つまり、それに該当するＤＮＡは細胞膜により封入され、生体サンプルを酵素的、科学的または機械的手段により分離および溶解しなければならない。その後、ＤＮＡ溶液は、例えば、プロテイナーゼＫを用いて消化することにより、タンパク質およびその他の汚染物質を除去することができる。その後、ゲノムＤＮＡは溶液から回復する。これは、塩析、有機抽出または固相担体へのＤＮＡの結合を含む、様々な方法を用いて実行することができる。方法の選択は、時間、費用、およびＤＮＡの所要数量を含む、いろいろな要因の影響を受ける。好ましくは、ＤＮＡサンプルのソースは、細胞または細胞株、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、精液、尿、血液、およびその組み合わせから選択される。好ましくは、前記ソースは、生検、体液、精液、尿、または血液である。その後、ゲノムＤＮＡサンプルは、５’位で非メチル化されるシトシン塩基がウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーションの挙動においてシトシンとは異なるその他の塩基に変換されるような方法において、処理される。これは、ここで「治療」として理解される。
ゲノムＤＮＡの上記に記載される治療は、塩基対合の挙動において、重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、二硫酸塩）およびウラシルまたはシトシンとは異なるその他の塩基に非メチル化シトシン核酸塩基をを変換することにより生じるアルカリ加水分解を用いて実行されることが好ましい。
その後、処置されたＤＮＡは、前立腺癌の発展に関連する１つ以上の標的遺伝子配列（前記処置よりも前に）のメチル化状態を決定するために分析される。前記標的部位は、表１１に記載されるように、遺伝子またはゲノム配列から成る群から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子またはゲノム配列の少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを備え、または当該ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズされることが特に好ましい。前記遺伝子またはゲノム配列は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。添付の配列リストに記載されるように、前記遺伝子の配列が分析されることがさらに好ましい。分析方法は、ここに記載されるものを含む、技術分野における既知の遺伝子から選択することができる。ここに記載されるように、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM、ＭＳＰTMおよびオリゴヌクレオチドをブロッキングするための使用が特に好ましい。当該の分析（プライマー、オリゴヌクレオチドのブリッキングおよびプローブの検出を含む）で使用されるいずれのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５およびそれに相補的な配列の塩基配列の少なくとも１６塩基対合の長いセグメントに逆相補的で、同一であり、またはストリンジェントな、または極めてストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズするべきであることがさらに好ましい。当該の分析（プライマー、オリゴヌクレオチドのブリッキングおよびプローブの検出を含む）で使用されるいずれのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、および最も好ましくは、配列番号：９６２から９６５およびそれに相補的な配列の塩基配列の少なくとも１６塩基対合の長いセグメントに逆相補的で、同一であり、またはストリンジェントな、または極めてストリンジェントな条件のもとで、ハイブリダイズするべきであることが好ましい。
表１１に記載されるものから得られる１つ以上の遺伝子またはゲノム配列、さらに好ましくは、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５による遺伝子またはゲノム配列の異常メチル化は、前立腺細胞増殖障害の予後に関連する。１つまたは複数の配列の分析は、前立腺細胞増殖障害の予後分類することができる。１つ以上の遺伝子またはゲノム配列の高メチル化が不良な予後に関連することがさらに好ましい。高メチル化は、一般にｍＲＮＡの発現のもとで、その結果ポリペプチドに関連する。
ある実施例において、前記方法は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供するためのマーカーとして、表１１による遺伝子から成る群から選択される１つ以上の遺伝子またはゲノム配列の使用を公開する。前記遺伝子またはゲノム配列は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。前記遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。
前記遺伝子および／または配列の前記使用は、ｍＲＮＡ発現分析またはタンパク質発現分析を用いて、遺伝子発現のいずれの分析を用いて可能である。しかしながら、本発明の最も好ましい実施例において、前立腺細胞増殖障害の検出が前記遺伝子またはゲノム配列のメチル化状態の分析およびそのプロモーターまたは調節要素を用いて可能である。遺伝子のメチル化分析の方法は、ここに記載される。
ある実施例において、前記方法は、前立腺細胞増殖障害の予後を提供するためのマーカーとして、表１１による遺伝子から成る群から選択される１つ以上の遺伝子またはゲノム配列の使用を公開する。前記遺伝子またはゲノム配列は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。前記遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。
前記遺伝子および／または配列の前記使用は、ｍＲＮＡ発現分析またはタンパク質発現分析を用いて、遺伝子発現のいずれの分析を用いて可能である。しかしながら、本発明の最も好ましい実施例において、前立腺細胞増殖障害の検出が前記遺伝子またはゲノム配列のメチル化状態の分析およびそのプロモーターまたは調節要素を用いて可能である。遺伝子のメチル化分析の方法は、ここに記載される。
遺伝子、ゲノム配列または表１１によるゲノム配列により規制される遺伝子のｍＲＮＡ発現の異常レベルは、前立腺細胞増殖障害の予後に関連する。従って、前記遺伝子または配列の発現レベルの増加または減少は、前立腺細胞増殖障害の予後に関連する要因と共に関連付けられ、疾患の攻撃性および進行を含むが、それらに限定されない。前記遺伝子またはゲノム配列は、ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５から成る群から選択されることが特に好ましい。前記遺伝子ＰＩＴＸ２であることがさらに好ましい。
前立腺細胞増殖障害の予後分類において、遺伝子またはゲノム配列をコード化するｍＲＮＡの存在を検出するために、サンプルを患者から摂取する。好ましくは、サンプルのソースは、細胞または細胞株、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、精液、尿、血液、その組み合わせから成る群から選択する。好ましくは、ソースは生検、体液、精液、尿、または血液である。サンプルは、そこに含まれる核酸を抽出するために処理することができる。サンプルから結果として生じる核酸は、ゲル電気泳動またはその他の分離法による。検出は、核酸、特に、ハイブリッド二本鎖を形成するためのプローブとして役割を果たすＤＮＡ配列を有するサンプルのｍＲＮＡに接触することを含む。ハイブリダイゼーションの厳重さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミド濃度を含む、ハイブリダイゼーション中、および洗浄手順中の多数の要因により決定される。これらの要因は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．、１９８９）に概説される。結果として生じる二本鎖の検出は、通常、標識プローブの使用により達成される。あるいは、前記プローブは、非標識化することができるが、直接または間接的のどちらかで、標識化するリガンドを用いて特異結合することにより検出可能である。プローブおよびリガンドを標識化するのに適する標識および方法は、技術分野において公知であり、例えば、既知の方法により組み込むことができる放射性標識（例えば、ニック翻訳法またはｋｉｎａｓｉｎｇ法）、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に誘発されたジオキセタン）、酵素、抗体、およびその同等物を含む。
前記遺伝子およびゲノム配列から転写されるｍＲＮＡのサンプルで検出の感度を増加するために、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応法がｍＲＮＡから転写されるｃＤＮＡを増幅するために使用することができる。逆転写／ＰＣＲ法は、技術的分野で公知である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｎｇ、上記参照）。
逆転写／ＰＣＲ法は、以下のように実行することができる。例えば、トータル細胞ＲＮＡは、標準グアニジウム・イソチオシアネート法により分離され、トータルＲＮＡは、逆転写される。逆転写法は、逆転写酵素酵素および３’エンドプライマーを使用して、テンプレートＲＮＡにＤＮＡ合成を生じる。一般的には、前記プライマーは、オリゴ（ｄＴ）配列を含む。従って、生成されたｃＤＮＡは、その後、ＰＣＲ法およびＥＹＡ４特異的プライマーを用いて増幅される（Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７：２９１９−２９３２、１９８９；Ｋｒｕｇ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｖｏｌ．１５２、ｐｐ．３１６−３２５、１９８７は、参照することにより組み込まれる）。
本発明はまた、ある実施例において、生体試料のテストを通じて、前立腺細胞増殖障害状態の予後を提供するために使用されるキットを説明することができる。代表するキットは、ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸セグメントおよび各１つ以上の核酸セグメントのための容器を備えることができる。ある実施例において、核酸セグメントは、単一チューブ内に合成することができる。さらに実施例において、核酸セグメントはまた、標的ｍＲＮＡを増幅するための１組のプライマーを含むことができる。当該のキットはまた、いずれのバッファ、溶液、溶媒、酵素、ヌクレオチド、またはハイブリダイゼーション、増幅、または検出反応に対する他の構成要素を含むことができる。キットの構成要素には、逆転写−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンアッセイおよび／またはＲＰＡのための試薬を含むことが好ましい。
本発明の特定の実施例は、予後分類およびそれにより改善された前立腺細胞増殖障害の治療を可能にする前記配列内のメチル化レベルおよび／またはパターンの分析の新規の用途を提供する。前立腺細胞増殖障害の治療は、特定の悪性度において疾患予後に直接関連し、それにより公開される方法は、医師および患者がよりよい、さらに情報に通じた治療決定をすることが可能になる。
さらなる改善
本発明は、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９および最も好ましくは、配列番号：９６１）から成る群から選択されるゲノム配列に対する新規の使用を提供する。さらに、実施例は、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９および最も好ましくは、配列番号：９６１）から成る群のシトシンメチル化パターンの分析のためのヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーと同様に、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１の修飾変形型を提供する。
本発明の対象は、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１から成る群から選択される少なくとも１つのゲノム配列およびそれに相補的な配列内で、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の分析を備える。好ましくは、前記群は、配列番号：３５、６３、１９から成り、最も好ましくは、前記配列は、配列番号：９６１である。
公開される発明は、ゲノム配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは、配列番号：３５、６３、１９および最も好ましくは、配列番号：９６１）から生じる処置された核酸を提供するものであって、前記処置は、ウラシル、またはハイブリダイゼーションにおいてシトシンとは検出可能な程度に異なるその他の塩基に、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの非メチル化シトシン塩基を変換することに適するものである。当該のゲノム配列は、１つ以上の連続する、またはランダムなメチル化ＣｐＧ位置を備えることができる。好ましくは、前記処置は、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二硫酸塩、およびその組み合わせから成る群から選択される試薬の使用を備える。本発明の好ましい実施例において、前記対象は、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２〜９６５（好ましくは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０から成る前記群、および最も好ましくは、配列番号：９６２〜９６５から成る前記群）から成る群から選択される配列の長さにおいて、少なくとも１６の隣接するヌクレオチド塩基の配列を含む不自然に起こる核酸の分析を含む。配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５から成る群から選択される配列の長さにおいて、少なくとも１６の隣接するヌクレオチド塩基の配列を含む不自然に起こる核酸であることが特に好ましく、それは、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１またはその他のヒトゲノムＤＮＡに同一ではなく、相補的でもない。配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、９６２から９６５から成る群から選択される配列の長さにおいて、少なくとも１６の隣接するヌクレオチド塩基の配列を含む不自然に起こる核酸であることがさらに好ましく、それは、配列番号：９６１、３５、６３および１９またはその他のヒトゲノムＤＮＡに同一ではなく、相補的でもない。
前記配列は、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＡまたはＣｐＡジヌクレオチドおよびそれに相補的な配列を備えることがさらに好ましい。配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５の配列は、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１による不自然に起こる核酸の修飾版でを提供するものであって、各ゲノム配列の修飾は、以下のような前記ゲノム配列とは異なり、独自の配列を有する核酸の合成をもたらす。例えば、配列番号：１のような各センス鎖ゲノムＤＮＡに関して、４つの変換型版が公開される。初期版では、「Ｃ」は「Ｔ」に変換されるが、「ＣｐＧ」は、「ＣｐＧ」を維持し（すなわち、ゲノム配列に関しては、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基は、メチル化され、従って変換されない事例に対応する）、第ニ版は、公開されたゲノムＤＮＡ配列の補体を公開するものであって（すなわち、アンチセンスストランド）、「Ｃ」は「Ｔ」に変換されるが、「ＣｐＧ」は、「ＣｐＧ」を維持する（すなわち、ゲノム配列に関しては、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基は、メチル化され、従って変換されない事例に対応する）。配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１の「高メチル化」変換型配列は、配列番号：６５から配列番号：７２８に対応する。第三の化学的変換版は、各ゲノム配列を提供するものであって、「Ｃ」は、全ての「Ｃ」残基に対して「Ｔ」に変換され、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のＣ残基を含み（すなわち、ゲノム配列に関しては、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基は、高メチル化され、事例に対応する）、最終の科学的変換版では、各配列は、公開されたゲノムＤＮＡ配列の補体を公開するものであって（すなわち、アンチセンスストランド）、「Ｃ」は、全ての「Ｃ」残基に対して「Ｔ」に変換され、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のＣ残基を含む（すなわち、各ゲノム配列の補体（アンチセンスストランド）に関しては、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基が高メチル化される場合に対応する）。配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１の「低メチル化」変換型配列は、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５に対応する。
別の好ましい実施例において、当該分析は、配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から配列番号：９６５によるゲノムまたは処理された（科学的に修飾された）ＤＮＡ内で、シトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、適度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件下（上記に定義されているような）でハイブリダイズする、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する核酸配列を備えるものであって、配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から配列番号：９６５による処置された核酸配列および／またはそれに相補的な配列、または配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１および／またはそれに相補的な配列によるゲノム配列にハイブリダイズする。
従って、本発明は核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡ−オリゴマー））を含むものであって、適度にストリンジェントな、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から９６５の配列の全て、または一部に、またはその補体にハイブリダイズする核酸分子を含む。核酸分子は、適度にストリンジェントな、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から９６５の配列の全て、または一部に、ハイブリダイズする核酸分子であることが特に好ましく、それは、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１またはその他のヒトゲノムＤＮＡに同一ではなく、相補的でもない。核酸分子は、適度にストリンジェントな、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、９６２〜９６５の配列の全て、または一部に、ハイブリダイズする核酸分子であることがさらに好ましく、それは、配列番号：９６１、３５、６３および１９またはその他のヒトゲノムＤＮＡに同一ではなく、相補的でもない。
ハイブリダイズされる核酸のハイブリダイズされる部分の長さは、一般的に少なくとも９、１５、２０、２５、３０または３５ヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子が発明の効用性を有し、従って本発明の範囲内である。
好ましくは、発明のハイブリダイズされる核酸のハイブリダイズされる部分は、前記配列に、または配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から９６５の一部に、またはその補体に、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または１００％同一である。
ここに記載されるハイブリダイズされる核酸は、例えば、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、または診断用および／または予後プローブまたはプライマーとして、使用することができる。好ましくは、核酸サンプルへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実行され、前記プローブは、標的配列に１００％同一である。二本鎖核酸またはハイブリッド安定性は、融解温度またはＴｍとして言い表され、それはプローブが標的ＤＮＡから分離する温度である。この融解温度は、要求されるストリンジェントな条件を定義するために使用される。
標的配列に関しては、同一であるよりむしろ、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１に対応する配列（対立遺伝子多型およびＳＮＰなど）に関連し、実質的には同一であり、唯一相同ハイブリダイゼーションが特定塩分濃度（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）で起こる最低温度を初めに固定するために役立つ。その後、１％の不適合がＴｍで１℃の低下を生じると仮定すれば、ハイブリダイゼーション反応での最終洗浄温度は、それに応じて低下する（例えば、前記プローブで９５％より大きい同一である配列が追求される場合、最終洗浄温度は、５℃低下する）。実際のところは、Ｔｍの変化は、１％の不適合につき、０．５℃から１．５℃の間である。
発明のオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド内）の長さＸの実施例は、例えば、配列番号：１に関連してポリヌクレオチドの位置により示されるように、連続的に重複するオリゴヌクレオチドの長さＸのセット（センスおよびアンチセンスセット）に対応する配列を含み、各連続的に重複するセット（与えられたＸ値に対応する）内でオリゴヌクレオチドは、以下のヌクレオチドの位置からのＺオリゴヌクレオチドとして定義される。
ｎから（ｎ＋（Ｘ−１））；
式中、ｎ＝１、２、３，…（Ｙ−（Ｘ−１））であり；
Ｙは、配列番号：１（７５７２）の長さ（ヌクレオチドまたは塩基対合）を表し；
Ｘは、セット内（例えば、連続的に重複する２０ｍｅｒのセットに対しては、Ｘ＝２０）の各オリゴヌクレオチドの長さ（ヌクレオチド内）を表し；および
任意の配列番号の長さＹの連続的に重複するオリゴマーの長さＸの数（Ｚ）は、Ｙ−（Ｘ−１）で表す。例えば、Ｘ＝２０である場合、配列番号：１のセンスまたはアンチセンスセットのどちらかに対して、Ｚ＝７５７２−１９＝７５５３である。
好ましくは、前記セットは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを備えるオリゴマーに限定される。
発明の２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの実施例は、オリゴマーのセット（およびその補体へのアンチセンスセット）を含み、配列番号：１に関連してポリヌクレオチドの位置により、
１〜２０、２〜２１、３〜２２、４〜２３、５〜２４、……７５５３〜７５７２で示される。
好ましくは、前記セットは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを備えるオリゴマーに限定される。
同様に、発明の２５ｍｅｒオリゴヌクレオチドの実施例は、２，２５６のオリゴマーのセット（およびその補体へのアンチセンスセット）を含み、配列番号：１に関連してポリヌクレオチドの位置により、
１〜２５、２〜２６、３〜２７、４〜２８、５〜２９、……７５５３〜７５７２で示される。
好ましくは、前記セットは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを備えるオリゴマーに限定される。
本発明は、各配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から配列番号：９６５（センスおよびアンチセンス）に関して、複数の連続的に重複するオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの長さＸのセットを含み、それは、例えば、Ｘ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０または３５ヌクレオチドである。
本発明によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１に対応するゲノム配列の遺伝的およびエピジェネティックパラメータを解明するために役立つ効果的なツールとなる。当該オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの長さＸの好ましいセットは、配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から配列番号：９６５に（およびその補体に）対応するオリゴマーの連続的に重複するセットである。前記オリゴマーは、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチド（または対応する変換されたＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチド）配列のシトシンがオリゴヌクレオチドの中部３分の１内にある、すなわち、例えば、オリゴヌクレオチドが長さで１３塩基である場合、ＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドが５’−末端から第５と第９の間のヌクレオチドに位置するものである。
化学的にオリゴヌクレオチドを１つ以上の部分または複合体に連結させることによって、本発明のオリゴヌクレオチドを修飾することもでき、オリゴヌクレオチドの活性、安定性または検出を向上させる。かかる部分または複合体は、例えば、米国特許５，５１４，７５８号、５，５６５，５５２号、５，５６７，８１０号、５，５７４，１４２号、５，５８５，４８１号、５，５８７，３７１号、５，５９７，６９６号および５，９５８，７７３号で開示されるように、コレステロール、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、その他などの、発色団、蛍光体、脂質を含む。プローブはまた、特に好ましい対特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形でも存在することもある。このように、オリゴヌクレオチドはペプチドなどの他の相補群を含むこともあり、ハイブリダイゼーショントリガーされた切断剤（Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６、１９８８）または挿入剤（Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９、１９８８）を含むこともある。このために、オリゴヌクレオチドは別の分子、例えば、発色団、蛍光体、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガーされた架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショントリガーされた切断剤などと結合することもある。
オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの技術的に認識された修飾糖および／または塩基部分を含むこともあり、または修飾骨格または非自然ヌクレオシド間リンケージを含むこともある。
本発明の特定の実施形態によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは通常「組」で使用され、ゲノム配列配列番号：１から配列番号：６４、および配列番号：９６１ならびにそれらの相補的な配列、または配列番号：６５から配列番号：３２０、および配列番号：９６２から配列番号：９６５ならびにそれらの相補的な配列により、一連の処理した核酸の範囲内の対応するＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドの、ＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つの分析用の少なくとも１つのオリゴマーを含む。しかしながら、経済上または他の要因のために、前記配列内のＣｐＧジヌクレオチドを限定して選択し、分析することが好ましい場合があることが予想され、オリゴヌクレオチドの組の内容はそれに応じて変えられる。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、処理したゲノムＤＮＡ（配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５）、またはゲノムＤＮＡ（配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１ならびにそれらの相補的な配列）において、シトシンメチル化状態を検出するのに役立つ一組の少なくとも二（２）つの（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー）を提供する。これらのプローブは、前立腺細胞増殖性障害の遺伝子およびエピジェネティックのパラメータの診断および／または分類を可能にする。オリゴマーの組もまた、処理したゲノムＤＮＡ（配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５）、またはゲノムＤＮＡ（配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１ならびにそれらの相補的な配列）において、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するのに使用されることもある。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドの組の少なくとも１つ、より好ましくはすべてのメンバーが固相に結合する。
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：１から配列番号：３２０および配列番号：９６１から配列番号：９６５ならびにそれらの相補的な配列、またはそれらのセグメントのうちの１つのＤＮＡ配列を増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用される、一組の少なくとも二（２）つのオリゴヌクレオチドを提供する。
オリゴヌクレオチドが「アレイ」または「ＤＮＡチップ」（すなわち、異なるオリゴヌクレオチドの配列および／または固相に結合されるＰＮＡオリゴマー）の全部または一部を構成してもよいことが予想される。かかる異なるオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレイは、例えば、長方形または六方格子の形で固相に配列されることを特徴とする。固相面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から成ってもよい。ペレットの形で、または樹脂基体としても存在することが可能な、ナイロンなどのプラスチックと同様にニトロセルロースを使用してもよい。オリゴマーアレイ製造の従来の技術の概要は、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、第２１巻、１９９９年１月、およびその中で引用された文献から）の特別版から収集できる。固定化したＤＮＡアレイを走査するために、蛍光性ラベル化されたプローブを時折使用する。特定のプローブの５’−ＯＨへＣｙ３およびＣｙ５染料を単に添加することは、蛍光ラベルに特に適している。ハイブリダイズされたプローブの蛍光性の検出を、例えば、共焦点顕微鏡によって行うこともある。他の多くのものに加えて、Ｃｙ３およびＣｙ５染料は市販されている。
オリゴヌクレオチド、またはその特定の配列が、「仮想アレイ」の全部または一部を構成してもよいこともまた予想され、そこではオリゴヌクレオチド、またはその特定の配列が、例えば、検体の複合混合物を分析するために、固有にラベル化されたプローブの多様性のある集団の一部として、またはそれと組み合わせて「指示子」として使用される。かかる方法は、例えば、米国の２００３／００１３０９１（２００３年１月１６日に公開された、米国出願番号０９／８９８７４３）で説明されている。かかる方法では、複合混合物（すなわち、それぞれの検体）のそれぞれの核酸が、固有のラベルによって固有に結合でき、したがって検出できるように（それぞれのラベルは直ちに数えられ、混合物中のそれぞれの分子種のデジタル読み出しができる）、十分なラベルを作成する。
前立腺細胞増殖性障害の予後、治療、監視、ならびに治療および監視のうち少なくとも１つに対して、本発明によるオリゴマーを活用することは特に好ましい。これは患者から分離された生体サンプルの予後を提供するために、前記組を使用することによって可能となる。以下のオリゴヌクレオチドの組のうちの１つから選択される、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから成るオリゴマーのそれらの組が、特に好ましい。
前記方法の一実施形態では、これは、ストリンジェントな条件下で、表１１による遺伝子および配列ならびにそれらの相補体から成る群から選択される遺伝子または配列の少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを含む、またはハイブリダイズする、少なくとも１つ標的配列のメチル化状態を分析することによって達成される。前記遺伝子またはゲノム配列がＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５ならびに添付の配列リストに記載のそれらの配列からなる群から選択されることが特に好ましい。さらに好ましいのは、遺伝子ＰＩＴＸ２である。
本発明は、シトシンメチル化および単一のヌクレオチド多型を分析することによって、対象内の配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１によるゲノム配列の遺伝子および／またはエピジェネティックなパラメータを解明するための方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、本発明は、シトシンメチル化および単一のヌクレオチド多型を分析することによって、対象内の配列番号：３５、６３、１９、最も好ましくは配列番号：９６１よるゲノム配列の遺伝子および／またはエピジェネティックなパラメータを解明するための方法をさらに提供する。前記方法は、前記対象から取得される生体サンプルにおける配列番号：１から配列番号６４および配列番号９６１（好ましくは配列番号３５、６３、１９および最も好ましくは配列番号９６１のうちの１つ以上）のうちの１つ以上を含む核酸を、少なくと１つの試薬または一連の試薬に接触させるステップを含み、ここで前記試薬または一連の試薬は、標的核酸内でメチル化されたおよび非メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを識別する。
好ましくは、前記方法は以下のステップから成る。第１のステップでは、分析される組織のサンプルを得る。ソースは適切などんなソースであってもよい。好ましくは、ＤＮＡサンプルのソースは、細胞または細胞株、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、精液、尿、血液およびその組み合わせから成る群から選択される。好ましくは、ソースは生検、体液、精液、尿である。
その後、ゲノムＤＮＡをサンプルから分離する。市販のキットの使用を含む当技術分野の標準的な任意の手段により、ゲノムＤＮＡを分離してもよい。端的に言えば、該当のＤＮＡが細胞膜によってカプセル化される場合には、酵素的、化学的または機構的方法によって、生体サンプルを分裂および溶解する必要がある。その後、ＤＮＡ溶液から、例えば、プロテイナーゼＫで温浸することによって、タンパク質および他の汚染物質を除去してもよい。次に、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。これは、塩析、有機物抽出、または固相担体へのＤＮＡの結合を含み、多様な方法を用いて実行してもよい。方法の選択は、時間、経費およびＤＮＡの所要数量を含むいくつかの要因に影響を受ける。
核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖ＤＮＡを分析に使用する。
前記方法の第２のステップでは、５’位で非メチル化されるシトシン塩基を、ハイブリダイゼーションの挙動という点でシトシンと異なる、ウラシル、チミンまたは他の塩基に変換するような方法によって、ゲノムＤＮＡサンプルを処理する。これは、本明細書では、「前処理」または「処理」として理解されるであろう。
好ましくは、バイサルファイト（ハイドロジェンサルファイト、ジサルファイト）、および塩基対合の挙動という点でシトシンと異なる、ウラシルまたは別の塩基への、非メチル化されたシトシン核酸塩基の変換をもたらす、続くアルカリ加水分解によって、上述のゲノムＤＮＡの処理を実行する。
前記方法の第３のステップでは、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドおよび増幅酵素の組を使用して、処理したＤＮＡの断片を増幅する。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅は、１つの、および同一の反応槽の中で同時に行うことができる。一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅を行う。プライマーオリゴヌクレオチドの組は、配列番号６５から配列番号３２０および配列番号９６２から配列番号９６５（好ましくは、配列番号１３３，１３４，２６１，２６２、１８９，１９０，３１７，３１８、１０１，１０２，２２９，２３０のうちの１つおよび最も好ましくは配列番号９６２〜９６５のうちの１つ）ならびにそれらの相補的な配列のうちの１つの塩基配列の、少なくとも１６の塩基対の長いセグメントに対して、配列がそれぞれ逆相補または同一、またはストリンジェントまたは非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
前記方法の代替の実施形態では、１つ以上の配列番号：１から６４および配列番号：９６１（好ましくは１つ以上の配列番号：３５、６３、１９および最も好ましくは配列番号：９６１）から成る核酸配列内のあらかじめ選択されたＣｐＧ位のメチル化状態は、メチル化に特異のプライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出してもよい。この技術（ＭＳＰ）は、Ｈｅｒｍａｎによる米国特許第６，２６５，１７１号で説明されている。バイサルファイト処理したＤＮＡの増幅のためのメチル化状態に特異なプライマーを使用することにより、メチル化または非メチル化された核酸との間の差別化を可能にする。ＭＳＰプライマー対は、バイサルファイト処理をしたＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、前記プライマーの配列は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化されたＤＮＡに特異のＭＳＰプライマーは、ＣｐＧのＣ位の位置にある「Ｔ」を含む。したがって好ましくは、前記プライマーの塩基配列は、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６１から９６５（好ましくは配列番号：１３３，１３４，２６１，２６２、１８９，１９０，３１７，３１８、１０１，１０２，２２９，２３０、および最も好ましくは配列番号：９６２〜９６５）のうちの１つ、ならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズする、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含むを要求され、そこでは前記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドから成る。
前記方法のさらに好ましい実施形態は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を含む。かかるブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Ｙｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：７１４−７２０、１９９７によって説明されている。ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーと同時に、バイサルファイト処理された核酸にハイブリダイズされる。核酸のＰＣＲ増幅は、ブロッキングのプローブの５’位で終了するので、ブロッキングのプローブへの相補的な配列が存在するところで、核酸の増幅を抑制できる。メチル化状態に特異な方法で、バイサルファイト処理された核酸にハイブリダイズするようにプローブを設計してもよい。例えば、非メチル化された核酸の集団内のメチル化された核酸を検出するためには、問題の位置での非メチル化された核酸の増幅の抑制は、メチル化された核酸の増幅の抑制が要求される場合の「ＣｐＧ」と対照的に、問題の位置の「ＣｐＡ」または「ＴｐＡ」から成るブロッキングプローブを使用して行われる可能性がある。
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ方法では、ポリメラーゼ媒介性の増幅を効果的に途絶するには、ポリメラーゼによってブロッカーオリゴヌクレオチドを伸長しないことが必要となる。好ましくは、「遊離」ヒドロキシル基以外の３’位で誘導体化される、３’−デオキシオリゴヌクレオチド、またオリゴヌクレオチドであるブロッカーを用いることによりこれを達成する。例えば、３’−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドは、ブロッカー分子の好ましい種類の代表である。
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性の分解を防止しなけらばならない。好ましくは、かかる防止は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が不足しているポリメラーゼを使用、または、例えば、ブロッカー分子をヌクレアーゼ耐性状態にする、その５’−末端のチオアート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用のどちらかを含む。特定の適用では、ブロッカーのかかる５’修飾を必要としない場合もある。例えば、ブロッカー結合部位およびプライマー結合部位が重なり、それによってプライマーの結合を防止する場合（例えば、過剰なブロッカーにより）、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解はかなり防止される。これは、ポリメラーゼがプライマーをブロッカーに向けて、またブロッカーを通して（５’〜３’の方向）伸張させず、通常ハイブリダイズされたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解をもたらすプロセスのためである。
特に好ましいブロッカー／ＰＣＲ実施形態は、本発明の目的上、また本明細書で実施されるように、ブロッキングオリゴヌクレオチドとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用を含む。かかるＰＮＡブロッカーオリゴマーは、ポリメラーゼにもよって分解も伸長もされないので、理想的に適合している。
したがって好ましくは、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５のうちの１つならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズされる、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含むことを要求され、そこでは前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。より好ましくは、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、好ましくは配列番号：１３３，１３４，２６１，２６２、１８９，１９０，３１７，３１８、１０１，１０２，２２９，２３０、さらに好ましくは配列番号：９６２〜９６５のうちの１つならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズされる、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含むことが要求され、そこでは前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
増幅を用いて取得された断片は、直接または間接的に検出できるラベルを有することができる。質量分析計で検出できる典型的な質量を有する蛍光ラベル、放射性核種または分離可能な分子断片の形のラベルが好ましい。前記ラベルが質量ラベルである場合には、ラベル化された増幅産物は、単一の陽性または陰性正味電荷を有し、質量分析計でより優れた検出能が可能となることが好ましい。検出は、例えば、マトリクス支援レーザ離脱／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）を用いて、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して実行および視覚化してもよい。
マトリクス支援レーザ離脱／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の分析には非常に効果的な成果である（Ｋａｒａｓ＆Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．、６０：２２９９−３０１、１９８８）。検体を光吸収マトリクスに埋め込む。マトリクスは短レーザパルスによって蒸発し、したがって、断片化しないよう気相で検体分子が輸送される。マトリクス分子との衝突によって検体をイオン化する。印加電圧は、フィールドフリー飛行管の中にイオンを加速する。それらの異なる質量のために、異なる程度でイオンは加速する。比較的小さなイオンは、比較的大きいイオンより早く検出器に達する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析は、ペプチドおよびタンパク質の分析に、うまく適している。核酸の分析は、いくぶんより難しい（Ｇｕｔ＆Ｂｅｃｋ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ、１：１４７−５７、１９９５）。核酸分析に関する感度は、ペプチドに関するより約１００倍少なく、断片サイズを増大することで、不相応に減少する。さらに、負の多価バックボーンを有する核酸には、マトリクスによるイオン化プロセスは、かなり効率が悪い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析では、マトリクスを選択することは、きわめて重要な役割である。ペプチドの脱着には、非常に純度の高い結晶を生産する、いくつかの非常に効率的なマトリクスが発見されてきた。今ではＤＮＡにはいくつかの反応のよいマトリクスがあるが、しかし、ペプチドおよび核酸との間の感度における差異は減少していない。しかしながら、ＤＮＡがペプチドとより類似するような方法で、感度におけるこの差異は、化学的にＤＮＡを修飾することによって減少できる。例えば、バックボーンの常在リン酸塩がチオリン酸エステルと置換される、ホスホロチオアート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して、電荷中性のＤＮＡに変換できる（Ｇｕｔ＆Ｂｅｃｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７−７３、１９９５）。この修飾ＤＮＡへの電荷タグを結合することは、ペプチドに発見されたのと同じレベルまで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ感度における増加をもたらす。電荷タグ付けのさらなる利点は、不純物に対する分析の安定性の増加であり、それは非修飾基質の検出を、相当より困難にする。
前記方法の第４のステップでは、前記方法の第３のステップの間に取得された増幅産物を、処置に先立ってＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を確実にするために分析する。
増幅産物がＭＳＰ増幅を用いて取得された実施形態において、前記プライマーの塩基配列に従い、増幅産物の有無は、プライマーで覆われるＣｐＧ位のメチル化状態をそれ自体示す。
シークエンシングおよびテンプレートによる伸長法などの技術を用いると同様に、限定はされないが、アレイ技術およびプローブに基づく技術などのハイブリダイゼーションに基づく方法を用いて、標準およびメチル化特異ＰＣＲを用いて取得された増幅産物をさらに分析してもよい。
前記方法の一実施形態では、ステップ３で合成された増幅産物を、アレイまたは一組のオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブに、続いてハイブリダイズする。このような状況において、ハイブリダイゼーションは以下の方法で行われる。ハイブリダイゼーションの間に使用される一組のプローブは好ましくは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ-オリゴマーから成り；そのプロセスでは、増幅産物はすでに固相に結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして役立ち；続いて非ハイブリダイズされる断片を取り出し；前記オリゴヌクレオチドは少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含み、それは本配列リストで特異の塩基配列のセグメントと逆相補的または同一であり；セグメントは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態では、前記ジヌクレオチドは、オリゴマーの中央部全長３分の１に存在する。例えば、そこで、オリゴマーが１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む場合には、前記ジヌクレオチドは好ましくは、１３−ｍｅｒの５’末端から第５から第９のヌクレオチドである。１つのオリゴヌクレオチドは、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１による配列内のそれぞれのＣｐＧジヌクレオチド、および配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５内の相当する位置を分析するために存在する。前記オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸の形でも存在してもよい。次に、非ハイブリダイズされた増幅産物を取り出す。その後、ハイブリダイズされた増幅産物を検出する。このような状況において、増幅産物に付けられたラベルが、オリゴヌクレオチド配列が位置する固相のそれぞれの位置で特定可能であることが好ましい。
前記方法のさらなる実施形態では、ＣｐＧ位のゲノムメチル化状態は、ＰＣＲ増幅プライマーと同時にバイサルファイト処理したＤＮＡにハイブリダイズされる、オリゴヌクレオチドプローブを用いて確実にしてもよい（そこでは前記プライマーは、特異または標準のどちらかのメチル化である可能性がある）。
この方法の特に好ましい実施形態は、蛍光に基づく実時間定量ＰＣＲ（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９９４、１９９６；米国特許６，３３１，３９３号もまた参照されたし）を使用し、二重ラベルが付いた蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カルフォルニア州、フォスターシティを使用した、ＴａｑＭａｎTM ＰＣＲ）を用いる。ＴａｑＭａｎTMＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎTMプローブと呼ばれる、非伸長可能な問い合わせオリゴヌクレオチドの使用を用い、好ましい実施形態において、前方増幅プライマーと逆増幅プライマーとの間に位置するＧｐＣを、豊富な配列にハイブリダイズするよう設計する。ＴａｑＭａｎTMプローブは、ＴａｑＭａｎTMオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに付着しているリンカー部分（例えば、ホスホラミダイト）に共有結合している蛍光性の「リポーター部分」および「クエンチャー部分」さらに含む。バイサルファイト処置後の核酸内のメチル化の分析には、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔTMアッセイとしても知られている、米国特許第６，３３１，３９３号（その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる）で説明されるように、プローブが特異のメチル化であることが要求される。説明された発明にも使用するのに適当であるＴａｑＭａｎTM検出方法論のバリエーションは、二重プローブ技術（ＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒTM）または蛍光性増幅プライマー（ＳｕｎｒｉｓｅTM技術）の使用を含む。バイサルファイト処理されたＤＮＡの使用、さらにＣｐＧジヌクレオチド内のメチル化分析に適切な方法で、これら両技術を適合させることもある。
バイサルファイト処理された核酸の分析によるメチル化の評価のためのプローブオリゴヌクレオチドを使用するためのさらに適当な方法。前記方法のさらに好ましい実施形態では、前記方法の第５のステップは、Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１、１９９７により説明されるように、ＭＳ−ＳＮｕＰＥなどの、テンプレートによるオリゴヌクレオチド伸長の使用を含む。
前記方法のさらなる実施形態では、前記方法の第４のステップは、前記方法の第３のステップで生産された増幅産物のシークエンシングおよび続く配列分析を含む（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７、１９７７）。
最良の形態
前記方法の最も好ましい実施形態では、上記に概略を説明した方法の最初の３つのステップにより、ゲノム核酸を分離し処理する。すなわち、
ａ）対象から、対象のゲノムＤＮＡを有する生体サンプルを取得するステップと、
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出するか、あるいは分離するステップと、
ｃ）シトシン塩基の５位で非メチル化されるシトシン塩基を、ハイブリダイゼーション性質という点で、検出可能的にシトシンと異なるウラシルまたは他の塩基に変換するために、１つ以上の試薬によって、ｂ）のゲノムＤＮＡまたはその断片を処理するステップであり、ここで、
ｄ）メチル化特異の方法、すなわちメチル化特異プライマーまたはブロッキングオリゴヌクレオチドの使用によって、ｃ）での処置後に増幅するステップを実行し、さらに、
ｅ）上述のように、実時間検出プローブを用いて、増幅産物の検出を実行する。
好ましくは、上述のように、メチル化特異プライマーを用いて、続くｄ）の増幅を実行する場合には、前記メチル化特異プライマーは、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６２から配列番号：９６５のうちの１つならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズされる、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含み、そこでは前記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。より好ましくは、上述のように、メチル化特異プライマーを用いて、続くｄ）の増幅を実行する場合には、前記メチル化特異プライマーは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、さらに好ましくは配列番号：９６２〜９６５のうちの１つならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズされる、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含み、そこでは前記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。
前記方法の他の最も好ましい代替の実施形態では、上述のように、ブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下で、続くｄ）の増幅を実行する。前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号：６５から配列番号：３２０および配列番号：９６１から配列番号：９６５のうちの１つならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズされる、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含み、そこでは前記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。より好ましくは、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号：１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、さらに好ましくは配列番号：９６２〜９６５のうちの１つならびにそれらの相補的な配列により、処理された核酸配列にハイブリダイズされる、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する配列を含み、そこでは前記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
前記方法のステップｅ）、すなわち、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは配列番号３５、６３、１９、さらに好ましくは配列番号：９６１）による、１つ以上のＣｐＧ位のメチル化状態を示す特異増幅産物の検出は、上述のように、実時間検出方法を用いて実行する。
本発明のさらなる実施形態は、本発明の配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１（好ましくは配列番号３５、６３、１９、さらに好ましくは配列番号：９６１）ならびにそれらの相補的な配列により、ゲノムＤＮＡのメチル化状態を前処理の必要なく分析する方法を提供する。
かかるさらなる実施形態の第１のステップでは、組織または細胞源からゲノムＤＮＡサンプルを分離する。好ましくは、かかる細胞源は、細胞系、組織学的スライド、体液またはパラフィンに埋め込まれた組織を含む。第２のステップでは、ゲノムＤＮＡを抽出する。抽出には、洗浄剤溶解物、可聴化およびガラス玉によるボルテックスの使用を含むがこれらに限定されない、当業者に標準的な手段を使用してもよい。核酸を抽出するとすぐに、ゲノム二本鎖ＤＮＡを分析に使用する。
好ましい実施形態において、処置に先立ってＤＮＡを開裂することもあり、これは特にメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼにより、最先端技術で標準の任意の手段により行ってもよい。
第３のステップでは、その後、１つ以上のメチル化感受性制限酵素によりＤＮＡを消化する。制限部位のＤＮＡの加水分解が、特異のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態で有益となるように、前記消化を行う。
任意であるが好ましい実施形態である、第４のステップでは、制限断片を増幅する。好ましくは、これはポリメラーゼ連鎖反応を使用して実行し、前記増幅産物は、上述した適切な検出可能なラベル、すなわち、フルオロフォアラベル、放射性核種および質量ラベルを有することもある。
第５のステップでは、増幅産物を検出する。例えば、ゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、ＰＣＲ製品内の検出可能なタグの取り込み、ＤＮＡアッセイ分析、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ分析に限定しないが、当技術分野における任意の標準的手段により検出を行う。
ゲノム核酸のメチル化状態を決定した後、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、ならびに、配列番号：１から配列番号：６４および配列番号：９６１の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均値または値に基づいて、前立腺ガンの予後を推測する。前記予後は好ましくは、遺伝子ＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５（配列番号：３５、６３、１９、最も好ましくは配列番号：９６１）の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、ならびに、配列番号：３５、６３、１９、最も好ましくは配列番号：９６１の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均値または値に基づく。前記ＣｐＧ位の低メチル化は良好な予後に関連し、また高メチル化は不良な予後に関連する。一般的に、ｍＲＮＡの発現のもと、およびポリペプチドにより、高メチル化は関連する。低メチル化および高メチル化を決定するカットオフポイントは、所定の集団の平均メチル化レベルであってもよく、好ましくは最適化されたカットオフのレベルである。配列番号：３５の分析には、カットオフは３０％と４０％との間のメチル化であることが好ましく、最も好ましくは３６．４２％である。配列番号：６３の分析には、カットオフは２％と１０％との間のメチル化であることが好ましく、最も好ましくは５．９６％である。ＧＰＲ７の分析には、カットオフは２０％と１０％との間のメチル化であることが好ましく、最も好ましくは１６．６５％である。ＰＩＴＸ２の分析には、カットオフは２０％と１０％との間のメチル化であることが好ましく、最も好ましくは１４．２７％である。
発現分析（最も好ましくはメチル化分析を用いる）の、本明細書に説明されるマーカー（好ましくはＰＩＴＸ２、配列番号：６３、ＧＰＲ７および配列番号：３５）の本発明による方法を、前立腺ガンの予後を決定するのに使用する場合に、最も好ましくはグリーソンスコアだが、ノモグラムスコアおよびＰＳＡレベルを含み、予後を決定するのに使用される他の臨床的予後変数と組み合わせて、好ましくは前記方法を使用する（すなわち、前記変数を計算に入れる、または考慮に入れる）。本発明の好ましい実施形態では、本明細書で説明される、マーカーＰＩＴＸ２および配列番号：３５のそれぞれの予後発現分析が、局限性臓器（Ｔ２）前立腺ガンを示す患者に行われる。ＰＩＴＸ２および配列番号：３５にはＴ２前立腺ガンを決定する際にはっきりと異なる利点を有する一方で、現在の臨床的実践では、Ｔ２前立腺ガンを示しているすべての患者が良好の予後を有すると見なされる。本発明によると、不良な予後（高メチル化）を有する前記Ｔ２患者は、Ｔ３（非局限性臓器）前立腺ガンを示している患者より典型的な予後を有するであろうし、また適切に治療される可能性がある。さらに、マーカーＰＩＴＸ２および配列番号：６３のそれぞれの予後発現は、高いグリーソンスコア（８以上）を表している患者の分析において、さらなる有用性を有する。前記患者は、不良な予後を有すると現在考えられるが、しかし、ＰＩＴＸ２および配列番号：６３の発現分析の、本明細書に説明されている方法を用いて、不良な予後（高メチル化）を有するグリーソンスコアの高い患者と、良好な予後を有する患者を識別することは、初めて可能となる。現在グリーソンスコアの高い患者のすべては、手術後のアジュバント治療の候補と考えられ、したがって、発明による方法は前記患者の過剰治療の防止を可能にする。加えて、マーカー配列番号：６３の予後発現分析は、ノモグラムスコアに基づく不良な予後を示している患者の分析においてさらに有用である。
キット
さらに、本発明のさらなる側面は、例えば、バイサルファイトを含有する試薬；それぞれの症例で対応するか、相補的であるか、または、ストリンジェントもしくは非常にストリンジェントな条件下で、配列番号：１から配列番号：３２０もしくは配列番号：９６１から９６５の配列の１６ベースの長いセグメントにハイブリダイズする配列の、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでいる一組のプライマーオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー；その上、説明した方法を実行および評価するための説明書を備えるキットである。さらに好ましい実施形態では、前記キットは、ＣｐＧ位特異メチル化分析を実行するための標準的試薬をさらに備えてもよく、そこでは前記分析は以下の技術のうち１つ以上を含む。ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM、ＣＯＢＲＡ、および核酸シークエンシング。しかしながら、本発明の方向に沿ったキットは、前述の要素の一部だけを含むこともできる。
前記キットは好ましくは、バイサルファイトを含有する試薬；それぞれの症例で対応するか、相補的であるか、または、ストリンジェントもしくは非常にストリンジェントな条件下で、配列番号：１３３，１３４，２６１，２６２、１８９，１９０，３１７，３１８、１０１，１０２，２２９，２３０、さらに好ましくは配列番号：９６２〜９６５の配列の１６ベースの長いセグメントにハイブリダイズする配列の、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでいる一組のプライマーオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー；その上、説明した方法を実行および評価するための説明書を備える。さらに好ましい実施形態において、前記キットはＣｐＧ位特異的メチル化分析を実行するために標準的な試薬をさらに含むこともあり、そこでは前記分析は以下の技術のうちの１つ以上を含む。ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM、ＣＯＢＲＡおよび核酸シークエンシング。しかしながら、本発明の方向に沿うキットはまた、前述の構成要素の一部だけを含むこともできる。
説明された発明は、前立腺ガン患者の予後を予測するのに役立つ組成物をさらに提供する。前記組成物は、配列番号１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、９６２〜９６５から成る群から選択される核酸配列のセグメントの長さにおいて少なくとも１つの核酸１８塩基対、および塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、タックポリメラーゼ、ウシ血清アルブミン、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーにあるオリゴマーを含む群から採取される１つ以上の物質を含み、前記オリゴマーは、いずれの場合も、配列番号１３３、１３４、２６１、２６２、１８９、１９０、３１７、３１８、１０１、１０２、２２９、２３０、９６２〜９６５およびそれらの相補的な配列により、前処理されたゲノムＤＮＡに相補的、または適度にストリンジェントもしくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも９つのヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を有する。前記組成物が水溶液中で前記核酸の安定化に適切な緩衝液を含み、また前記溶液内でポリメラーゼに基づく反応を可能にすることが好ましい。適切な緩衝液は当技術分野において知られていて、市販されている。
一実施形態において、本発明は、対象における前立腺癌または前立腺腫瘍の診断を下すための方法を提供する。前記方法は、以下のステップを含む。
ｉ）ＣＤＲＮ２Ａ、ＥＬＫ１、ＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＳＳＦ１、ＥＳＲ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＢＴＧ４、ＳＬＣ３５Ｆ２、ＨＯＸＢ５、ＬＩＭＫ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、配列番号：３５、ＥＰＡＳ１、ＮＯＴＣＨ１、配列番号：５５、ＰＴＰＲＮ２、Ｑ９ＮＰ７３、ＭＸ１、ＤＯＣＫ１０、ＣＣＮＤ２、ＩＳＬ１、ＳＮＡＰＣ２、ＧＲＮ、Ｈ２ＡＦＹ２、ＷＤＦＹ３、ＦＯＳ、ＦＡＴ、Ｑ８６ＳＰ６、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＮＲＰＮ、ＧＰＲＫ５、ＦＢＮ２、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＲＨＯＣ、ＫＢＴＢＤ６、ＮＲ２Ｅ１、ＰＳＤ、ＤＲＧ１、Ｑ８Ｎ３６５、配列番号：４４、Ｑ９６Ｓ０１、ＣＤ３７、ＣＭＹＡ３、配列番号：６１、Ｑ８ＮＣＸ８およびＺＮＦ５６６および／またはそれらの制御領域のうちの、または前記配列番号による１つ以上の遺伝子または遺伝子配列の発現レベルを決定するステップと、
ii）前記表現レベルにより、前記前立腺癌または前立腺腫瘍の有無を決定するステップ。
前記発現レベルは、メチル化分析、ヘテロ接合性の消失（以下、ＬＯＨとも称する）、ＲＮＡ表現レベルおよびタンパク質の表現レベルを含むがこれに限定されない、当技術分野において任意の標準手段によって決定してもよい。
したがって、前記方法は、転写されるＲＮＡ、または前記ＲＮＡから翻訳されるポリペプチドもしくはタンパク質の発現の任意の分析を用いて、好ましくは、ｍＲＮＡ発現分析およびポリペプチド発現分析を用いて可能となる。
したがって、ＣＤＲＮ２Ａ、ＥＬＫ１、ＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＳＳＦ１、ＥＳＲ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＢＴＧ４、ＳＬＣ３５Ｆ２、ＨＯＸＢ５、ＬＩＭＫ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、配列番号：３５、ＥＰＡＳ１、ＮＯＴＣＨ１、配列番号：５５、ＰＴＰＲＮ２、Ｑ９ＮＰ７３、ＭＸ１、ＤＯＣＫ１０、ＣＣＮＤ２、ＩＳＬ１、ＳＮＡＰＣ２、ＧＲＮ、Ｈ２ＡＦＹ２、ＷＤＦＹ３、ＦＯＳ、ＦＡＴ、Ｑ８６ＳＰ６、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＮＲＰＮ、ＧＰＲＫ５、ＦＢＮ２、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＲＨＯＣ、ＫＢＴＢＤ６、ＮＲ２Ｅ１、ＰＳＤ、ＤＲＧ１、Ｑ８Ｎ３６５、配列番号：４４、Ｑ９６Ｓ０１、ＣＤ３７、ＣＭＹＡ３、配列番号：６１、Ｑ８ＮＣＸ８およびＺＮＦ５６６に適用されるように、表１１により遺伝子、ゲノム配列および／または制御領域の発現を検出するための定量的および質的の両方の予後アッセイおよび方法は、前記診断目的のために適切である。さらに、表１１による上述の遺伝子および配列の分析用の、上述の組成物、キットおよび核酸はまた、ＣＤＲＮ２Ａ、ＥＬＫ１、ＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＳＳＦ１、ＥＳＲ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＢＴＧ４、ＳＬＣ３５Ｆ２、ＨＯＸＢ５、ＬＩＭＫ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、配列番号：３５、ＥＰＡＳ１、ＮＯＴＣＨ１、配列番号：５５、ＰＴＰＲＮ２、Ｑ９ＮＰ７３、ＭＸ１、ＤＯＣＫ１０、ＣＣＮＤ２、ＩＳＬ１、ＳＮＡＰＣ２、ＧＲＮ、Ｈ２ＡＦＹ２、ＷＤＦＹ３、ＦＯＳ、ＦＡＴ、Ｑ８６ＳＰ６、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＮＲＰＮ、ＧＰＲＫ５、ＦＢＮ２、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＲＨＯＣ、ＫＢＴＢＤ６、ＮＲ２Ｅ１、ＰＳＤ、ＤＲＧ１、Ｑ８Ｎ３６５、配列番号：４４、Ｑ９６Ｓ０１、ＣＤ３７、ＣＭＹＡ３、配列番号：６１、Ｑ８ＮＣＸ８およびＺＮＦ５６６の分析に有用であり、したがって、前立腺癌または前立腺腫瘍の検出に適用できる。
本発明をある好ましい実施形態により特異性を持って説明してきたが、以下の実施例および表は、本発明を説明するためだけに役立ち、最も広範囲の解釈の原理および範囲、ならびにそれらに相当する形態に本発明を限定することは意図されない。
表１〜１２
実施例
調査概要
本調査の目的は、転移能を有する浸潤性腫瘍を患う、前立腺癌患者を特定できる、遺伝子マーカーを開発することである。異なった形で発現されるゲノムマーカーを特定するために、メチル化分析を使用することとした。
新規のマーカーを発見するために、ゲノム規模でのスクリーニングステップから調査を始めた。このアプローチは、患者サンプルの所定の群間での差別的なメチル化を決定するための、分子生物学的方法を利用する。前記ゲノムスクリーニング方法を使用して特定される差別的にメチル化された配列は、本明細書ではメチル化配列タグ(ＭｅＳＴとも称する）と称される。ゲノム規模でのスクリーニングステップは、差別的にメチル化されたＣｐＧ部位を特定する。特定されたＣｐＧ部位を囲んでいる領域に関する追加情報は、スクリーニングステップ(ＭｅＳＴまたはメチル化配列タグ）およびヒトゲノムのマッピングで見つかる配列のＢＬＡＳＴ分析によって得られる。
ゲノム規模でのスクリーニングによる候補の特定に続いて、有望な候補のサブセットのためにＭＳＰ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイが開発された。これらのアッセイは、臨床転帰情報により５６の前立腺摘除術サンプルでメチル化を分析するのに使用された。ＭＳＰ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイは敏感で定量的であり、またＣｐＧコメチル化を利用しており、したがって、このアッセイフォーマットは、ＤＮＡ配列技術に補完的なデータを提供する。
その後、すべての有望なＭｅＳＴ候補およびいくつかの追加候補を、以下にさらに詳細に説明する、出願者が独自に開発したチップ技術を使用したメチル化オリゴヌクレオチド配列によって分析した。適当なサンプルセットが使用されれば、このプロセスはＭｅＳＴまたは候補遺伝子の予備性能に関する情報を提供する。候補マーカーは、チップデータ分析から得たデータに基づいて選択される。選択は主に、望ましいクラス間の区別に対するマーカーのＡＵＣに基づいている。
開発プロセスを完了するために、アッセイ開発のためにチップ研究から選択された補マーカーを、可能性のある診断または予後テスト(パラフィン包埋組織）に対して使用される標的集団およびサンプル物質でのさらなる検証のために、実時間のＰＣＲアッセイで検定した。

実施例１：ＭｅＳＴスクリーニング
実験計画
腫瘍の浸潤性と関連するマーカーのゲノム規模でのスクリーニングに、前立腺癌サンプルからのプールゲノムＤＮＡを使用した。２つの異なる方法、メチル化特異性任意配列プライマーポリメラーゼ連鎖反応(ＭＳ−ＡＰＰＣＲ）(Ｌｉａｎｇら、１９９８）およびメチル化ＣｐＧ島増幅(ＭＣＡ）(Ｔｏｙｏｔａら、１９９９）が適用された。これらの技術は、メチル化感受性酵素ｎ概要を用いてメチル化されたＣｐＧ部位と非メチル化されたＣｐＧ部位を区別し、ゲノムＤＮＡはメチル化感受性制限酵素で切断される。非メチル化された部位での分裂は非メチル化された標的の増幅を防止するので、メチル化された断片は選択的に増幅される。これらの技術を使用して得られるメチル化された配列タグ(ＭｅＳＴ）断片は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース(ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）のＢＬＡＳＴユーティリティを利用して配列が決定され、ヒトゲノムにマッピングされる。
スクリーニング段階の腫瘍の浸潤性の主要な定義は、根治的前立腺摘除術の後のＰＳＡの再現に基づいた。浸潤性腫瘍は、２４ヵ月未満で再発したものと定義された。非浸潤性腫瘍は、ＰＳＡ定期テストのフォローアップで最低４８ヵ月後にも再発しなかったものと定義された。それぞれのカテゴリーで５つのサンプルがプールされ、それぞれのカテゴリーに対して３つのプールがある。浸潤性腫瘍患者のＰＳＡの再現までの期間の平均値は、５．１ヵ月であった。再発しなかった患者のフォローアップ期間の平均値は、６０．３ヵ月であった。ＰＳＡの再現の前に、ネオアジュバントまたはアジュバント療法を受けた患者はなかった。
我々は、浸潤性の代替指標による他の４つの比較もまた含めた。グリーソン悪性度４および５のサンプルを、グリーソン悪性度１、２および３のサンプルと比較した。末期腫瘍(IIIおよびIV)を、初期腫瘍(ＩおよびII）と比較した。辺縁領域腫瘍を移行領域腫瘍と比較した。最後に、早期にＰＳＡを再発(２年未満）した患者の腫瘍に隣接している正常組織を、ＰＳＡを再発(４年以降のフォローアップ）しなかった患者の腫瘍に隣接している正常組織と比較した。
スクリーニング
通常、ＭｅＳＴスクリーニングプロセスにより、可能性のあるマーカーを表す多数の配列が得られる。それらのうちのいくつかは、冗長であるか、またはゲノムと一致できない。残りの配列は、評価手順採点法を使用して選択される。
多角的な方法を使用した状況
同一タイプの多角的なプール比較における状況
ＣｐＧ島での位置
プロモーター領域における位置
遺伝子配列の近くまたは内部の位置
癌のある近隣遺伝子の関連性
遺伝子のクラス(転写因子、増殖因子など）
反復要素(負のスコア）
このスコアスキームでは、ＭｅＳＴ配列はそれぞれの正の基準(最初の７つの基準）に対して１ポイントを得て、５０％を超える反復配列内容を有すると、８を引いたスコアを得る(負のスコア）。後者の場合、ＭｅＳＴは常に全体的に負のスコアを有する。ＭｅＳＴスクリーニング実験の結果を表２および表３に集約した。
スコア基準および可能性のある遺伝子機能の文献に基づいた調査を使用して、チップ単位複製配列計画法のために８０の遺伝子を選択した。ＰＳＡの再現に基づく比較からのＭｅＳＴを優先するが、他の比較からの多くのＭｅＳＴを単位複製配列計画法リストに含めた。
実施例２：実時間ＰＣＲ研究
実験計画
前立腺癌浸潤性のマーカーとしてのＭｅＳＴの性能に関する初期データを得るために、ＭｅＳＴスクリーニングから有力な候補のためのＴａｑｍａｎTM７９００でＭＳＰアッセイを開発した。
本明細書で使用するように、用語ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔとは、メチル化特異プライマーを用いてバイサルファイト処理をした配列の増幅、およびＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ検出オリゴヌクレオチドを用いて得られた増幅産物の検出を含むアッセイを指すと解釈されるべきである(「プローブ」とも称される）。
多数のＭｅＳＴのために、ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを開発した(表１２を参照）。アッセイの性能を確実にするために、非メチル化されたＤＮＡで、人工的にメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されたＤＮＡの希釈物でアッセイを検定した。すべてのアッセイでは、２０〜１００ナノグラムの非メチル化されたＤＮＡの有無で、わずか１００ピコグラムのメチル化されたＤＮＡを増幅できた。ほとんどのアッセイでは、０．１％から１００％の間のメチル化で定量的であった。
３６のアッセイのうち、前立腺腫瘍ＤＮＡのプールで２１をメチル化した。スクリーニングプロセスからの４６のサンプルで、これら２１のアッセイを最初に検定した。これら４６のサンプルは、２４ヵ月未満に再発した患者からの１４の前立腺摘除術、および最低４８ヵ月後にも再発しなかった患者からの１８の前立腺摘除術を含んだ。さらに、フォローアップ情報のない患者が１４人いて、９人は高いグリーソン(スコア８〜１０)であり、５人は低いＧｌｅａｓｏｎ(スコア２〜６）であった。この実験のデータは、単独のサンプルセットとして７つのアッセイを選ぶのに使用された。
第２のサンプルセットは、ＰＳＡの再現までの平均期間が６ヵ月で、早期にＰＳＡを再発した患者からの２６の根治的前立腺摘除術の冷凍サンプルと、最低４８ヵ月(平均フォローアップ期間は６０ヶ月であった）後にもＰＳＡを再発しなかった患者からの３０のサンプルから構成された。閾値サイクル(Ｃｔ）とメチル化されたＤＮＡの標準曲線を比較することによって、それぞれの遺伝子座でメチル化されたＤＮＡの量を測定するのに、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイを使用した。ＤＮＡの総量を測定するのにコントロールアッセイを使用した。すべてのアッセイに対してすべてのサンプルを３回検定した。プライマーとプローブを表１２に記載する。ＤＮＡの総量に対するメチル化されたＤＮＡの比率が、それぞれのサンプルでのそれぞれの候補のメチル化状態を示すのに使用された。
結果
ＲＯＣカーブ(図２〜図８）を作図し、感度、特異性およびｐ値を計算するのに、それぞれのアッセイに対するメチル化値を使用した。表４にデータを集約した。いくつかの候補に対するＡＵＣ値は、マーカーのメチル化が予後値を有することができたことを示唆する。６つの候補で、０．６８以上のＡＵＣがあった。最も有力な候補、配列番号：１９(ＧＰＲ７）および配列番号：３５(ＦＯＸＬ２の下流のゲノム領域）は、ボンフェローニの補正後、ウィルコクソン検定で顕著であった。特異性がこれら２つのアッセイに対して８７％に設定される場合、感度はそれぞれに対して約５０％である。(配列番号は、表１１の遺伝子名と相関性がある。）
実施例３：チップ研究
チップ研究では、候補遺伝子および選択したＭｅＳＴｓから成る遺伝子パネルを、出願者のマイクロアレイ技術を使用して、３２９のサンプルで分析した。
サンプルセット
サンプルセットは、根治的前立腺摘除術から得た３２９の冷凍サンプルを含む。腫瘍の推定パーセントが少なくとも７０％であるサンプルのみを使用し、腫瘍の平均推定パーセント(容量で）は９０％であった。一部のサンプル提供者は、腫瘍を含むことが分かっている冷凍前立腺の部分除芯、または腫瘍から離れている正常組織の切除のどちらかによって、高いパーセントの腫瘍を得た。ネオアジュバント療法を受けた患者も、研究から除外されなかった。無病生存率に関する臨床情報は、疾病再発より前にアジュバント療法を受けている患者には使用しなかった。
グリーソンスコアは、ほとんどすべての前立腺摘除術に利用可能である。一部のサンプルでは、出願者に提供された腫瘍の一部のグリーソンスコアもまた、利用可能である。サンプルセットは、２つの極端なグリーソンカテゴリー(高いまたは低い）のうちの１つに適格なサンプル、２つの再発カテゴリー(早期または非再発）に適格な、患者からのサンプル、または複数のカテゴリー(例えば、高いグリーソンと早期の再発）に該当するサンプルから成る。サンプルセットの中で、１３５のサンプルが、低いグリーソンスコア(１＋２、２＋１、２＋２、２＋３、３＋２および３＋３）であった。９９のサンプルが、高いグリーソンスコア(３＋５、５＋３、４＋４、４＋５、５＋４および５＋５）であった。いくつかのサンプルでは、臨床フォローアップ情報が利用可能である。６５人の患者が２年未満でＰＳＡの再現を経験し、８８人の患者が最低４年のフォローアップの後にも再発しなかった。
管理目的のために、追加サンプルを含めた。オリゴの品質と機能性を管理するために、非メチル化された(ｐｈｉ−２９ＤＮＡ）および人工的にメチル化されたＤＮＡ(プロメガ）を使用した。さらに、リンパ球からの１６のＤＮＡサンプルを、テストサンプルと平行して処理した。
アレイ
アレイは６２の異なる候補を表すオリゴを含めた。候補のうちの５１は、ＭｅＳＴであった。１つのＭｅＳＴ、配列番号：３２を、両方とも遺伝子のエクソン１に近い、２つの非重複の単位複製配列によって表した。すべてのＭｅＳＴに対して、単位複製配列が、ＣｐＧの多くある領域で出来る限りＭｅＳＴ配列と近くなるように設計した。男性および女性の制御リンパ球サンプルの分析のために、Ｘ染色体遺伝子ＥＬＫ１の単位複製配列を含めた。
分析された他の遺伝子には、ＣＣＮＤ２(Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ２ Ｐａｄａｒら、２００３)、ＣＤ４４(Ｗｏｏｄｓｏｎら、２００４)、ＥＤＮＲＢ１(エンドセリン受容体Ｂ；Ｗｏｏｄｓｏｎら、２００４；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９７)、ＧＳＴＰ１(グルタチオンＳ−転移酵素ｐｉ；Ｍａｒｕｙａｍａら、２００２)、ＲＡＲＢ(レチノイン酸受容体、ベータ；Ｓｉｎｇａｌら、２００４）、ＰＴＧＳ２(プロスタグランジン−エンドペロキシドシンターゼ２；Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、２００４）、ＲＡＳＳＦ１(Ｒａｓ関連ドメインファミリー１；Ｌｉｕら、２００２）、ＥＳＲ２(エストロゲン受容体２；Ｚｈｕら、２００４）、ＤＲＧ１(発生学的に調節されているＧＴＰ結合タンパク質１；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、２００３）、およびＣＤＫＮ２Ａ(ｐ１６；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら、２０００）を含めた。２つの単位複製配列でＤＲＧ１を表した。すべての場合において、プロモーターまたはエクソン１の近くのＣｐＧが多くある領域が標的となる。ｐ１６のために、比較的高いメチル化率が文献(Ｎｇｕｙｅｎら、２０００）に言及されていたので、エクソン２を包囲するＣｐＧが多くある領域を使用した。
分析したすべての遺伝子の全概要を表１１に示した。
統計方法；チップデータの分析
未処理のハイブリダイゼーション強度からメチル化率まで
それぞれのＣｐＧ位のログメチル化率(ログ(ＣＧ／ＴＧ））を、以下のステップを含む標準前処理パイプラインによって決定した。
‐それぞれのスポットで、平均前景ピクセル強度から平均背景ピクセル強度を差し引く。これにより、背景が修正されたハイブリダイゼーション強度のよい推定が得られる。
‐それぞれのＣｐＧ位のＣＧおよびＴＧ検出オリゴヌクレオチドの両方に対して、４つの冗長なスポット強度の、背景が修正された平均値を取った。
‐それぞれのチップおよびそれぞれのＣＧ／ＴＧオリゴ対に対して、ログ(ＣＧ／ＴＧ）比率を計算した。
‐それぞれのサンプルに対して、冗長なチップ反復を超えているログ(ＣＧ／ＴＧ）強度の平均値を取った。
このログ比率は、ハイブリダイゼーションノイズはあらゆる可能性のメチル化率(Ｈｕｂｅｒら、２００２）を超えてほぼ一定の分散を有する、という性質を有する。
主成分分析
主成分分析(ＰＣＡ）は、測定ベクトル(例えば、チップデータ、いくつかのＣｐＧ部位などのメチル化プロフィール）を新しい座標に投影する。新しい座標軸は主成分と称される。第１の主成分は、データのうちで最も大きな分散の方向に及ぶ。次の成分は、分散を減少させることによって整理され、直交して、お互いに無相関となる。異なるＣｐＧ位は、異なる要素に沿うデータ集団の拡張に、異なる重量を提供する。ＰＣＡは非管理の技術であり、すなわち、データポイントのいかなる群またはラベルの情報も取り入れない(さらに詳しくは、例えば、Ｒｉｐｌｅｙ、１９９６を参照）。
典型的にＰＣＡは、データから高分散を有する特長を視覚化または抽出するために、高次元のデータ(本事例では、メチル化アレイデータ）を下の次元の部分空間に投影するのに使用される。本報告書では、データの統計品質管理のために、二次元投影を使用した。我々は、チップデータで異なるプロセスパラメータの結果を調査し、測定値に大きな変更を引き起こす、変化するそのプロセスパラメータを除外した。
異常値の単一チップを検出し、さらなる分析から除外するのに、ＰＣＡの堅調なバージョンを使用した(Ｍｏｄｅｌら、２００２）。
Ｔ2管理図
チップの製造プロセスの一般的な安定性を管理するために、我々は、多変量統計プロセス管理(ＭＶＳＰＣ）の分野からの方法を使用した。我々の主なツールはＴ2管理図であり、これは通常の作業環境からのチッププロセスの大幅な偏差を検出するのに使用される(Ｍｏｄｅｌら、２００２）。
Ｔ2図は、以下のように作図される。
１．プロセスパラメータに関するチップデータを整理する(例えば、ハイブリダイゼーションの日付またはスポッティングロボット）。
２．通常の作業環境のもとでチッププロセスを説明する、履歴データの組を定義する(例えば、最初の７５のハイブリッドチップ）。図では、履歴データの組からのデータは、特別なプロットシンボルによって表示される。
３．履歴データの組までのすべての新しいチップの距離を計算する。いくつかの連続的なチップの距離が所定の管理限界を超過する場合、プロセスは管理不能と見なされなければならない。
チップ製造プロセスを監視するＴ2図を使用することにより、ほとんどの系統的誤差原因を効率的に検出して除外できる。
仮説検証
主な課題は、サンプルのクラス予測へ重要な貢献ができるマーカーを特定することである。マーカーを含む予測モデルがマーカーのないモデルよりも分類性能を向上させない帰無仮説が、ｐ＜０．０５で棄却できる場合、重要な貢献が見出される。我々は、このテストを可能性のあるマーカーの全体集合に適用するので、複数の検証のためにｐ値を修正しなければならない。我々は、可能性のあるテストしたマーカーの数で単一のマーカーｐ値を単に乗じる、保守的なボンフェローニの補正を適用することによってこれを行う。我々は、これほど保守的はでない偽スクリーニング率(ＦＤＲ）方法によっても結果を得る(Ｄｕｄｏｉｔら、２００２）。
この報告書全体にわたり、マーカー(時として単に遺伝子または単位複製配列と称される）は該当するゲノム領域である(ＲＯＩ）。それは通常、それぞれの領域のいくつかのＣｐＧ位から成る。マーカーに予測力のない帰無仮説を検証するために、我々は、群と比較するウィルコクソンの順位和検定を使用する。有意な検証結果(ｐ＜０．０５）は、それぞれのメチル化ログ率、すなわち、ｌｎ(ＣＧ／ＴＧ）の分布の間のシフトを示す。ウィルコクソン統計値を生成する前に、それぞれのマーカーのすべてのオリゴの平均値を、ＣｐＧを結合するのに使用した。このアプローチは、コメチル化を示すマーカーに有利に働くという利点を有する。
マーカーの有意なｐ値は、このＲＯＩのメチル化には、２つのクラスによって与えられる、該当する問題になんらかの系統的相関があることを意味する。一般に、ウィルコクソンの順位和検定を使用した有意なｐ値もまた、優良な分類性能を暗示する。
ＲＯＣ分析によるクラス予測
選択したマーカーのＣｐＧアンサンブルが、いかにうまく異なる組織クラスを区別できるかについて推定するのに、受信者動作特性(ＲＯＣ）分析を使用した。ＲＯＣ曲線は、マーカー全体にわたって可能性のある検証閾値のための、真の陽性率(感度）対偽陽性率(１特異性）のプロットである。ＲＯＣ曲線の曲線下面積(ＡＵＣ）は、無作為のサンプルを適切に分類する確率を与え、したがって、全体的なマーカー性能を評価するのに使用できる。ＡＵＣはウィルコクソン検定統計値に関連があり、ＡＵＣまたはウィルコクソンｐ値によるマーカーの比較ランキングは相当する。それぞれのマーカーのすべてのオリゴの平均値を、ＲＯＣ分析の前にＣｐＧを結合するのに使用した。このアプローチは、コメチル化を示すマーカーに有利に働くという利点を有する。
実験の成績
ＤＮＡ抽出
外部の協力者から冷凍組織または抽出されたゲノムＤＮＡのどちらかのサンプルを受け取った。組織サンプルからのＤＮＡを、キアゲンＤＮＡミニキットを使用して、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓベルリンで分離した。
配達され、抽出されたすべてのサンプルＤＮＡの品質を、光度測定によって最初に評価した。Ａ２６０／２８０比率と同様に２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光を決定し、得られた濃度を計算した。使用した大部分のＤＮＡに対して、１．６と１．９との間のＡ２６０／２８０比率が、十分な純度を示して測定された。一部のサンプルのために、１．２〜１．５の範囲の比率を計算した。いずれにしても、これらのＤＮＡも同様に処理した。
光度測定の後、２００ｎｇのゲノムＤＮＡを０．８％のアガロースゲルに加え、ゲル電気泳動を実行した。図８は、典型的なゲルイメージを示す。減成の徴候は観察されないか、またはわずかな減成の徴候だけが観察され、使用したＤＮＡ全体に優良な品質を示した。

バイサルファイト処理および多重ＰＣＲ
管理ＤＮＡと同様に選択したすべてのサンプルからの全ゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理し、非メチル化されたシトシンをウラシルに変えた。メチル化されたシトシンは保存する。Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓのジオキサンバイサルファイト処理プロセスを使用して、バイサルファイト処理を実行した。後のデータに可能性のあるプロセスバイアスをもたらす、同じ生物学的背景を有する、すべてのサンプルの合同処理を回避するために、サンプルを処理バッチに無作為に群化した。グリーソンスコアとＰＳＡ結果のために、５０のサンプルのバッチを無作為に選んだ。ＤＮＡサンプルごとに、単独の２つのバイサルファイト反応を実行した。バイサルファイト化の後、それぞれ８つのプライマー対を含む、続く８つの多重ＰＣＲ(ｍＰＣＲ）反応で、１１．２５ｎｇのそれぞれのサンプルを使用した。
ｍＰＣＲ結果を監視するために、すべてのＰＣＲ製品対して、ゲル電気泳動を実行した。ｍＰＣＲ−組において、８つのプライマー対のうちで最良の組成を検出するために、ＡＬＦ分析を使用して、単一のＰＣＲ製品の混合体とｍＰＣＲ−組の異なる変異体とを比較した。
ＡＬＦ発現の分析：
拡大された断片の評価をするために、ＡＬＦ発現技術を使用して、プロメガＤＮＡのｍＰＣＲ製品を分析した。それらのｍＰＣＲの結果を、単一のＰＣＲ製品の混成体と比較した。図９に８プレックスＰＣＲの結果を例示する。研究用に選択された全部で６４の断片(８つの８プレックスＰＣＲ）を、実行されたｍＰＣＲ実験で増幅することもできる。場合によっては、望まれない副生物が得られる。
アガロースゲル電気泳動：
上述のように、ＤＮＡサンプルごとに、単独の２つのバイサルファイト反応およびＰＣＲを実行し、得られたＰＣＲ製品に２％のアガロースゲルを加えた。図１０に、典型的ゲルイメージを示し、１０のサンプルのｍＰＣＲ性能を例示する。可視的なＰＣＲ製品は、バイサルファイト処理またはＰＣＲ増幅の失敗を暗示しない。その後、２倍の量のＤＮＡ(２２．５ｎｇ）でＰＣＲを繰り返した。再度失敗したバイサルファイト処理をしたＤＮＡは、研究から除外した。我々がサンプルからただ１つのハイブリダイゼーションプローブ(プールされた６４のＰＣＲ製品）を得た場合は、この単一のプローブを使用して、４つのチップをハイブリダイゼーションした。サンプルから単独の２つのバイサルファイト処理からのプローブがうまく増幅した場合は、それぞれ２つのチップに両方のブロープをハイブリダイゼーションした。
数回の試みにもかかわらず、処理された３３１のサンプル(管理サンプルを含む)のうち四(４)つは、増幅できなかった。これらのサンプルは、それ以上処理しなかった。
チップ研究の結果
我々の主な分析は、高いグリーソンスコア(８〜１０）と低いグリーソンスコア(悪性度４または悪性度５の要素のない２〜６）とのサンプルの比較であった。これらのクラスは、表５のカテゴリーＡおよびＣである。第２の比較のために、我々は、手術の後、早期にＰＳＡの再現(２年未満）をした患者からと、再発しなかった群(４年のフォローアップ以降）からのサンプルの群を使用した。これらのクラスは、非再発の群用のＡ１、Ｂ１、Ｃ１およびＤ１、ならびに再発の群用のＡ２、Ｂ２およびＣ２である(表５を参照）。これらの２つのサンプルセット(グリーソンおよび臨床転帰）は、若干重なる。我々の３回目の比較は、中間のグリーソン(３＋４、４＋３、２＋５、５＋２、２＋４、４＋２）を有する患者だけを分析し、我々の候補配列のメチル化がこれらの患者の早期再発と相関するかどうか決定した。したがって、カテゴリーＢ１およびＢ２のみを含めた。
腫瘍組織対リンパ球
チップの診断値を評価するために、１６のリンパ球サンプルを研究に含めた。ウィルコクソンの順位和検定を使用して、前立腺癌組織とリンパ球を比較した。上位１０の増幅産物の順位を図１２に表示する。リンパ球群が若干均一であるのに対して、図は前立腺癌サンプルの比較的大きな変動を示す。群間の差異は、ＣＤＲＮ２Ａ、ＥＬＫ１、ＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＳＳＦ１、ＥＳＲ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＢＴＧ４、ＳＬＣ３５Ｆ２、ＨＯＸＢ５、ＬＩＭＫ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、配列番号：３５、ＥＰＡＳ１、ＮＯＴＣＨ１、配列番号：５５、ＰＴＰＲＮ２、Ｑ９ＮＰ７３、ＭＸ１、ＤＯＣＫ１０、ＣＣＮＤ２、ＩＳＬ１、ＳＮＡＰＣ２、ＧＲＮ、Ｈ２ＡＦＹ２、ＷＤＦＹ３、ＦＯＳ、ＦＡＴ、Ｑ８６ＳＰ６、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＮＲＰＮ、ＧＰＲＫ５、ＦＢＮ２、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＲＨＯＣ、ＫＢＴＢＤ６、ＮＲ２Ｅ１、ＰＳＤ、ＤＲＧ１、Ｑ８Ｎ３６５、配列番号：４４、Ｑ９６Ｓ０１、ＣＤ３７、ＣＭＹＡ３、配列番号：６１、Ｑ８ＮＣＸ８およびＺＮＦ５６６の増幅産物では、０．０５レベル(５％の偽発見率補正後）と有意である。
グリーソンの候補マーカー
高いグリーソン対低いグリーソンの比較
高いグリーソン(スコア８〜１０)と低いグリーソン(悪性度４または悪性度５の要素のないスコア２〜６)として分類された患者のメチル化プロフィールの差異を分析するのに、ウィルコクソンの順位検定を使用した。高いグリーソンクラスは９８のサンプルから成り、また低いグリーソンクラスは１３５のサンプルから成る。図１２は、この分析結果を示す。
２５の増幅産物では、ウィルコクソン検定のボンフェローニの補正をされたｐ値は、０．０５より下である。生物学的関連性の考察については、以下の項を参照されたし。図１３は、上位１０のマーカーのメチル化マトリクスを示す。
候補マーカー増幅産物のＡＵＣ／感度／特異性を表６に示す。
図１３は、最高のＡＵＣを有する１０のマーカーの高グリーソン対低いグリーソンメチル化マトリクスを示す。それぞれの列は１つのサンプルを、それぞれの行は１つのオリゴヌクレオチド(それぞれ１つ、２つ、または３つのＣｐＧ位)を表す。オリゴヌクレオチドはマーカー候補ごとに群化する。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加とともに、上部から下部まで整理される。それぞれのマーカーの右側では、ボンフェローニの補正をされたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを得る。０．７５以下の特異性のＡＵＣ感度を括弧で囲む。メチル化データを主な対象として、個々のオリゴヌクレオチドに対して１つの標準偏差に正規化する。色は平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を表す。淡灰色はオリゴヌクレオチドの範囲内で低メチル化されたＣｐＧを表し、一方で濃灰色はオリゴヌクレオチドの範囲内で高メチル化されたＣｐＧを示す。
ＰＳＡの再現の候補マーカー
早期再発対非再発との比較
次に我々は、早期再発(２４ヵ月未満のＰＳＡの再現）と非再発(最低４年後でもＰＳＡ非再発）として分類された患者のメチル化プロフィールの差異を分析した。
三つ(３）の増幅産物では、ボンフェローニの補正がされた尤度比(ＬＲ）検定のｐ値は、０．０５より下である。生物学的関連性に関する考察は、以下を参照されたし。
上部のマーカー増幅産物のＡＵＣ／感度／特異性を表７に示す。
図１５は、最高のＡＵＣを有する１０のマーカーの早期再発対非再発のメチル化マトリクスを示す。それぞれの列は１つのサンプルを、それぞれの行は１つのオリゴヌクレオチド(１つ、２つまたは、３つのＣｐＧ部位)を表す。オリゴヌクレオチドはマーカー候補ごとに群化する。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加とともに、上部から下部まで整理される。それぞれのマーカーの右側では、ボンフェローニの補正をされたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを得る。０．７５以下の特異性のＡＵＣ感度を括弧で囲む。メチル化データを主な対象として、個々のオリゴヌクレオチドに対して１つの標準偏差に正規化する。色は平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を表す。淡灰色はオリゴヌクレオチドの範囲内で低メチル化されたＣｐＧを表し、一方で濃灰色はオリゴヌクレオチドの範囲内で高メチル化されたＣｐＧを示す。
中間グリーソンスコアを有する患者におけるＰＳＡの再現の候補マーカー
早期再発対非再発との比較
最後に我々は、早期再発(２４ヵ月未満のＰＳＡの再現）と非再発(最低４年後でもＰＳＡ非再発）として分類された患者から、中間グリーソンサンプルのメチル化プロフィールの差異を分析した。中間グリーソンは、スコア２＋５、５＋２、３＋４、４＋３、２＋４、４＋２、１＋５、５＋１を有する患者をすべて含め、またこれらの患者はセクション６．６．２で使用される群のサブセットである。その大多数は、グリーソン３＋４または４＋３であった。増幅産物は０．０５より下のボンフェローニの補正をされたｐ値を示さなかったが、いくつかのマーカーは有望なＡＵＣ(表８を参照）を示した。この比較が小規模のサンプルセットであったため、この比較は検出力不足であった可能性はある。
生物学的関連性に関する考察は、以下を参照されたい。
マイクロアレイ分析によって明らかにされたコメチル化
最新のチップ研究の設計によって、我々は、コメチル化されたマーカー断片の範囲内で領域を決めることができた。この設計では、１つ、２つまたは３つのＣｐＧ部位を含む、少なくとも２つのオリゴ対を、分析されるそれぞれのマーカー断片に含めた。図１６以降にアレイ分析で標的とされるＣｐＧ部位の詳細を示す。コメチル化の証拠は、順位化されたマトリクス図で明白となる。マイクロアレイ分析からの順位化されたマトリクス図では、それぞれのマーカー断片は、水平に群化する。それぞれのマーカー断片が１つから３つの単位複製配列および最低４つから最高３０までの個々のＣｐＧ部位を表すので、断片のメチル化状態に関する広範囲な情報を決定できる。垂直方向の断片の群化の範囲内での連続的な濃灰色の箱は、オリゴヌクレオチド(およびそのオリゴ内部のＣｐＧ）のコメチル化を示す。断片内で最も差別的な領域のために、これらのデータをさらに分析し、また実時間ＰＣＲアッセイ設計のために、この情報を利用する。

結果概要
非常に保守的な統計的方法論を使用する、主なアッセイ、高いおよび低いグリーソンサンプルの比較では、２５のマーカーが統計的有意性の基準を満たした。この比較は浸潤性の代用指標としてグリーソンを信頼しているが、グリーソン情報がほぼすべての腫瘍に利用できたので、主分析として使用した。ＰＳＡの再現まで時間に基づいて、より少ないサンプルが追加分析のために利用可能となるが、それでもまだ２つのマーカーは統計的有意性に達した。
考察
生物学的側面
ＭｅＳＴスクリーニング
ＭｅＳＴ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇプロセスは非常に成功し、４００の候補が生まれた。実時間ＰＣＲおよびチップ研究において、ＭｅＳＴ候補はうまく機能した。実時間ＰＣＲの研究において、３つのＭｅＳＴｓが、ＧＳＴＰ１より優れていた。チップ研究において、グリーソン比較の上位５つの候補は、すべてのＭｅＳＴである。したがって、スクリーニングプロセスは、浸潤性と非浸潤性腫瘍を識別するための有益な候補マーカーを提供する。
さらに、すべてのスクリーニング比較からのＭｅＳＴを、上位スコア候補のリストで表した。グリーソン比較、ＧＰＲ７での上位候補マーカーが、２つの結果の比較、グリーソン比較および病期に基づく比較で発見された。別の上位パフォーマー、ＤＯＣＫ１０が、前立腺領域に基づく比較において発見された。上位マーカーのうちで、ＡＢＨＤ９だけが、２つの結果のカテゴリーにいる患者の腫瘍に隣接している正常組織の比較において発見された。我々は、ゲノム規模でのスクリーニング比較のスクリーニング化のすべてが重要な候補マーカーを生むと結論付けた。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔによる候補の評価
サンプルがチップ研究のために収集される間に、実時間ＰＣＲアッセイ開発のために、多くの候補ＭｅＳＴｓを選んだ。多くの前立腺腫瘍サンプルからの、プールされたＤＮＡサンプルで、アッセイを事前に選別した。このステップにより、有益となる可能性があるそれらアッセイのみを事前に識別できる。３分の１を超えるアッセイがこのステップで除外された。次に、アッセイの優先順位を付けるために、スクリーニングサンプルからのＤＮＡで残りのアッセイを検定した。その後、単独の５６のサンプルの最終組で、優先順位を付けられた７つのうちの６つのアッセイがうまく機能した。
実時間ＰＣＲ実験の成功は、これらのマーカーに顕著なコメチル化があることを示唆する。したがって、すべてある程度のコメチル化を必要とする、実時間ＰＣＲアッセイは、最終的なアッセイの選択に適切な候補となるであろう。実時間ＰＣＲ実験は、メチル化差異の定量化に大きく依存する。ほぼすべてのアッセイでは、早期再発群と非再発群との間の差異は、定量的メチル化差異であった。最終的なアッセイタイプは、強い定量的能力が必要となるであろう。
メチル化アレイによる候補評価
チップ実験は非常に成功し、多くの候補配列のマーカー可能性を示す。高いまたは低いグリーソンサンプルの比較において、２５の単位複製配列は著しく異なる。これらの圧倒的多数は、高いグリーソンサンプルで高メチル化される。実時間ＰＣＲによって分析される３つの候補は、このグリーソン比較において上位６つのマーカーの中にあった。したがって、メチル化を測定する２つの方法の間に一貫性がある。
ＰＳＡの再現患者の特徴に基づく比較は、低いサンプル番号を有する。これらの低い番号にもかかわらず、我々は、我々の候補マーカーのうち少なくとも三(３）つが、再発を経験していない患者から早期の再発を経験している患者をかなり識別できるということをやはり証明できた。一般に、メチル化は早期再発を経験している患者でより高くなる。この比較において、実時間ＰＣＲ研究の上位３つの候補は、チップ分析において上位３つの最も重要なマーカーであった。ＧＰＲ７、配列番号：３５(ＦＯＸＬ２の下流）、およびＡＢＨＤ９のＡＵＣは、チップ臨床転帰データでそれぞれ０．７２、０．７２、および０．６６であり、また実時間ＰＣＲ臨床転帰データでそれぞれ０．７６、０．７５および０．７０であった。
低いまたは高いグリーソンを有する患者の治療は時に明快である。高いグリーソンを有する任意の患者は、決定的治療(手術または放射線）および場合によりアジュバント治療を含む、積極的治療が推薦される。低いグリーソンを有する患者は、決定的治療を延期する選択の余地がある。若干の不確実性がまだこれらの患者にあると同時に、中間グリーソンレベルを有する患者には、最良の選択肢はそれほどまだ明快ではない。さらに、今日前立腺癌と診断されている患者の大多数は、６または７の中間グリーソンスコアを有する。これらは、分子分類検定が最も役立つ患者である。臨床転帰に基づく比較で最も高いＡＵＣを有する単位複製配列は、ＧＰＲ７(ＡＵＣ＝０．７２）および配列番号：３５(ＡＵＣ＝０．７２）であった。この比較が中間グリーソンスコア(１＋５、５＋１、２＋４、４＋２、３＋４、４＋３、２＋５、５＋２）を有する患者に限定されるとき、これら両方のマーカーのＡＵＣはその場合でもまだ０．７２以上であった。これらの結果は、メチル化に基づくアッセイが中央範囲のグリーソンスコアを有する患者にさえも情報を提供することを示唆するであろう。

マーカー遺伝子の生物学
いくつかの興味深いマーカーが実時間ＰＣＲおよびチップ研究によって特定された。実時間ＰＣＲマーカーのうちの１つは、Ｇタンパク質複合体型の受容体(ＧＰＲ７；配列番号：１９)であるが、しかし遺伝子産物についてほとんど知られていない。実時間研究からの第２のマーカーは、９(ＡＢＨＤ９；配列番号：３７)を含んでいる遺伝子Ａｂｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＤｏｍａｉｎのプロモーターのＣｐＧ島に位置する。配列番号：３５に最も近い遺伝子はＦＯＸＬ２である。ＭｅＳＴは、この遺伝子の数キロベース下流のＣｐＧ島にある。配列番号：６３は、いくつかのヒストン遺伝子の領域内にある。
追加のマーカーがチップ研究で出現した。ＮＯＴＣＨ１(配列番号：４１）は、隣接している細胞との間の相互作用を調節するシグナル経路を管理する。多くの研究室では、発癌と転移におけるこの遺伝子の役割を研究している。ＤＯＣＫ１０(配列番号：１６）、Ｋｅｌｃｈ反復およびＢＴＢ(ＰＯＺ）ドメインを含む６と称される遺伝子のプロモーターにある配列番号：５１、ならびにＥＳＴとＢ細胞転座遺伝子４との間に位置する配列番号：１７を含む、多くの候補についてあまり知られていない。ＢＴＧ４は、増殖抑制性質を有することが示されている(Ｂｕａｎｎｅら、２０００)。
ＰＴＧＳ２(配列番号：９)は、前立腺摘除術後間もなく再発した患者の前立腺腫瘍で、よりメチル化されることが既に文献で示されている、唯一の遺伝子である(Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、２００４)。ＰＴＧＳ２、別名シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ２)は、それぞれ０．６９および０．６５のＡＵＣを有する、グリーソンおよび臨床転帰分析でさらに有望な候補である。ＧＳＴＰ１は、前立腺癌で最も旺盛に研究されているメチル化マーカーであり、その予後値を直接示している既報のデータがない一方で、そのメチル化がグリーソン悪性度と相関するというある程度の証拠がある(Ｍａｒｕｙａｍａら、２００２)。しかしながら、この相互関係は、別の研究(Ｗｏｏｄｓｏｎら、２００４）では確認されなかった。即時データでは、ＧＳＴＰ１メチル化はグリーソン悪性度と著しく相関するが、臨床転帰比較のＡＵＣはわずか０．５８である。
医学的側面
我々のグリーソン比較から出現したメチル化候補は、有益な予後マーカーである。中間グリーソンスコアを有する患者にさえおいて、我々はグリーソンカテゴリーと相関するこれら候補のうちの一部が、ＰＳＡの再現を予測することもできることを示してきた。したがって、グリーソンに基づく我々の分析が、グリーソンに追加情報を提供するマーカーを提供することは起こり得る。
個々のマーカーとして、特異性が７５％に設定される場合、チップ候補は４０〜６０％の感度に達する。実時間研究において、マーカーのうち３つの感度は比較的高く、８５％の特異性で５０〜６０％に達した。実時間での向上された性能は、ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔの定量的能力による可能性がある。約２０％の患者は、手術後に５〜１０年以内に再発を経験する。これが根治的前立腺摘除術集団での浸潤性腫瘍の有病率として設定される場合、ひいては、５０％の感度および８５％の特異性を有する我々のマーカーなどは、０．８７の陰性予測値および０．４５の陽性予測値を持つであろう。したがって、この性能を有するマーカーは、手術後の再発がたった１３％の可能性を有する患者群および再発の可能性が４５％の患者群を定義する。第１の群はＰＳＡの上昇を単に監視するだけの可能性があり、第２の群はアジュバント療法の候補となるであろう。
これらの候補が前立腺摘除術サンプルで研究されてきたと同時に、それらは生検の分析にも役立つ。前立腺摘除術の後、結果を予測するマーカーは腫瘍の浸潤性および転移の可能性と相関し、これらの性質は生検においても存在する。生検および病期検定の後、患者は静観、決定的な治療的療法、または治療の組み合わせ(手術に加えて放射線またはアンドロゲン除去など）を選ぶ。高い陰性予測値による分子検定により、より多くの患者が静観を選ぶことができる。十分に高い陽性予測値による分子検定は、単に放射線または手術のみならず受けるべき患者のサブセットを選択するであろう。このように、これら候補のメチル化マーカーには、前立腺癌の治療中および治療後の両方で軽減する可能性を有する。
実施例４：実時間定量的メチル化分析
バイサルファイト変換の後、実時間ＰＣＲ技術を使用して、ゲノムＤＮＡを分析した。
ＱＭアッセイ(＝定量的メチル化アッセイ）は、定量的ＤＮＡメチル化検出のための実時間ＰＣＲに基づく方法である。アッセイ原理は、標的領域の非メチル化の特異的増幅、およびＣＧまたはＴＧ状態それぞれに特異な２つの異なるプローブの競合ハイブリダイゼーションによるメチル化の特異的検出に基づく。本研究では、２つの異なる蛍光色素(ＣＧ特異的プローブのための「ＦＡＭ」、ＴＧ特異的プローブのための「ＶＩＣ」）で標識化され、また抑制分子(「ＴＡＭＲＡ」または「副溝結合／非蛍光抑制」によってさらに修正されたＴａｑＭａｎのプローブを使用した。
ＱＭアッセイの未加工データの評価は、２つの異なる方法で可能である。
１．増幅の対数期における絶対蛍光強度(ＦＩ）の測定
ＣＧおよびＴＧ特異的プローブの閾値サイクル(ｃｔ）における差異。
以下の一連の定量的メチル化アッセイでは、入力ＤＮＡのために正常化遺伝子ＧＳＴＰ１を参照することによって、増幅されたサンプルＤＮＡの量を定量化する。標準化のために、ＧＳＴＰ１遺伝子の分析のためのプライマーおよびプローブは、ＣｐＧジヌクレオチドが不足するので、メチル化のレベルにかかわらず増幅が可能となる。メチル化の可変位がないので、１つのプローブのオリゴヌクレオチドだけが必要となる。
サンプル内のメチル化のレベルを定量化するために、ＤＮＡ標準の知られているメチル化のレベルを参照することによって反応を調整する。バイサルファイト処理されたｐｈｉ２９の増幅されたゲノムＤＮＡ(すなわち、非メチル化される）および／またはＳｓｓ１メチル化酵素で処理された(これにより、サンプルのそれぞれのＣｐＧ位をメチル化する）ｐｈｉ２９の増幅されたゲノムＤＮＡからＤＮＡ標準を構成し、その後、バイサルファイト溶液で処理した。０％(すなわち、ｐｈｉ２９の増幅されたゲノムＤＮＡのみ）５％、１０％、２５％、５０％、７５％および１００％(すなわち、ｐｈｉ２９のＳｓｓ１処理されたゲノムのみ）の７つの異なる参照標準を使用した。
バイサルファイト処理
Ｏｌｅｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６ Ｄｅｃ １５；２４(２４）：５０６４−６により開示されている方法に基づきバイサルファイト処理を実行し、出願者の研究室のワークフロー向けに最適化された。
定量化標準
サンプル内のメチル化のレベルを定量化するために、ＤＮＡ標準の知られているメチル化のレベルを参照することによって反応を調整する。バイサルファイト処理されたｐｈｉ２９の増幅されたヒトゲノムＤＮＡ(プロメガ)(すなわち、非メチル化される)、および／またはＳｓｓ１メチル化酵素で処理された(これにより、サンプルのそれぞれのＣｐＧ位をメチル化する)ｐｈｉ２９の増幅されたゲノムＤＮＡからＤＮＡ標準を構成し、その後、バイサルファイト溶液で処理した。０％(すなわち、ｐｈｉ２９の増幅されたゲノムＤＮＡのみ)５％、１０％、２５％、５０％、７５％および１００％(すなわち、ｐｈｉ２９のＳｓｓ１処理されたゲノムのみ)の７つの異なる参照標準を使用した。２０００ｎｇバッチのヒトゲノムＤＮＡ(プロメガ)をバイサルファイトで処理した。メチル化ＭＤＡＤＮＡを生成するために、４．５μｇのＭＤＡ−ＤＮＡ(７００ｎｇ／μｌ）の１３の管をＳｓｓ１で処理した。
コントロールアッセイ
ＧＳＴＰ１−Ｃ３アッセイの設計は、異なるソースからのＤＮＡを定量化するのに適切にさせ、新鮮／冷凍サンプル、血漿または血清などのリモートサンプル、およびパラフィンの埋め込まれた材料などのアーカイブ見本から得られるＤＮＡを含む。管理増幅産物を増幅する反応に、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
コントロールプライマー１：ＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＴ(配列番号：９６６）
コントロールプライマー２：ＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＡＡＣ(配列番号：９６７）
コントロールプローブ：ＦＡＭ−ＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＧＧＴＴ−ＴＡＭＲＡ(配列番号：９６８）
サイクルプログラム(４０サイクル）：９５℃、１０分
９５℃、１５秒
５８℃、１分
アッセイ設計および反応状態
遺伝子ＰＩＴＸ２(配列番号：９６１）の分析のために、２つのアッセイを開発した。
アッセイ１：
プライマー：ＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＡＧＡＴＧＴＴ(配列番号：９６９)
ＴＴＣＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＡ(配列番号：９７０）

プローブ：ＦＡＭ−ＡＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ(配列番号：９７１）
ＶＩＣ−ＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ(配列番号：９７２）
単位複製配列(配列番号：９７３）：
断片の長さ：１４３ｂｐ
プライマー位、プローブ位およびＣｐＧジヌクレオチド位を強調表示する。
ＰＣＲ要素(Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって供給される）：３ｍＭのＭｇＣｌ２緩衝液、１０×緩衝液、ＨｏｔｓｔａｒｔＴＡＱ、２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ６２５ｎＭプライマー、それぞれ２００ｎＭのプローブ
サイクルプログラム(４５サイクル)：９５℃、１０分
９５℃、１５秒
６２℃、１分
アッセイ２：
プライマー：ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＡＣ(配列番号：９７４）
ＧＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＴ(配列番号：９７５）
プローブ：ＦＡＭ−ＴＴＣＧＧＴＴＧＣＧＣＧＧＴ−ＭＧＢＮＱＦ(配列番号：９７６）
ＶＩＣ−ＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＧ−ＭＧＢＮＱＦ‖(配列番号：９７７）
単位複製配列(配列番号：９７８）：
断片の長さ：１６４ｂｐ
プローブ位、プライマー位およびＣｐＧ位を強調表示する。
プローブは、３つのコメチル化されたＣｐＧ位に及ぶ。
ＰＣＲ要素(Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって供給される)：２、５ｍＭのＭｇＣｌ２緩衝液、１０×緩衝液、ＨｏｔｓｔａｒｔＴＡＱ、２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ６２５ｎＭのプライマー、それぞれ２００ｎＭのプローブ
プログラム(４５サイクル）：９５℃、１０分
９５℃、１５秒
６０℃、１分
特定遺伝子座のメチル化の範囲は、以下の式により決定した。
絶対蛍光強度によって：メチル化速度＝１００＊Ｉ(ＣＧ）／(Ｉ(ＣＧ）＋Ｉ(ＴＧ））
(Ｉ＝ＣＧプローブまたはＴＧプローブの蛍光強度）
閾値サイクルＣｔによって：メチル化速度＝１００*ＣＧ／(ＣＧ＋ＴＧ）＝１００／(１＋ＴＧ／ＣＧ）＝１００／(１＋２＾差分(ｃｔ））
(ＰＣＲ効率Ｅ＝２と仮定すれば、差分(ｃｔ）＝Ｃｔ(メチル化された）−ｃｔ(非メチル化された））
実施例５：検証
本調査のこの段階の主なゴールは、先に特定されたマーカー候補の重要性を確認し、またメチル化のカットオフを最適化することであった。マーカーは、前立腺摘除術を受ける患者を２つの群、ＰＳＡの再現の可能性が高い患者およびＰＳＡの再現の可能性が低い患者に分割するのに適切なはずである。さらに、マーカーはグリーソン悪性度分析に追加情報を提供するはずである。これらの基準を満たしているマーカーには、アジュバント療法の前立腺摘除術患者を選択する際に、重要な臨床役割があるであろう。
出願者は、ＰＳＡの再現を経験しなかった患者と比較して、手術の２４ヵ月以内にＰＳＡの再現を経験した患者で、より著しく高いメチル化レベルを有するいくつかのマーカーを先に特定している(上記の実施例１〜４を参照）。実時間のプラットホーム(ＱＭアッセイ）へこれらマーカーのうちの６つを移動させた。３つの機関からのノード陰性患者のコホートから６１２のパラフィンの埋め込まれた前立腺摘除術サンプルのメチル化レベルを分析するために、これらのアッセイを使用した。
本発明の主な狙いは、手術後にＰＳＡの再現の可能性が低い患者およびＰＳＡの再現の可能性が高い患者を区別できるマーカーを提供することであった。グリーソン悪性度化および病期情報などの従来の予後指標と比較したこれらのマーカーの性能もまた提供する。
マーカーが現在の臨床的予後評価に関してどんな点で最も有益であるかを決定し、その結果、本発明の特に好ましい使用実施形態を提供することが、本発明のさらなる狙いである。本発明による分子検定が、特にグリーソン悪性度化において、公式または非公式に、他の予後ソースからの情報を組み合わせることは特に好ましい。
方法：ＱＭアッセイの説明
今後に向けた多重化を可能にするために、大幅に標準状態を変えることなく性能を向上させるＱＭアッセイをそれぞれ開発した。一定の緩衝液およびポリメラーゼ状態のもとで、プライマーおよびプローブの濃度、ＭｇＣｌ2濃度およびアニーリング温度を最適化した。１０と１００パーセントのメチル化の間でそれぞれのマーカーの定量的メチル化分析を確実にするために、アッセイを設計し、最適化した。アガロースゲルでアッセイ製品を検査し、望まれない製品は検出されなかった。以下の表に最適化手順の結果を示す。
サンプルセット
６０５人の患者からのパラフィンの埋め込まれた前立腺摘除術組織のサンプルを分析する。サンプルは、ベイラー医科大学ＳＰＯＲＥ、スタンフォード大学泌尿器科およびシアトルのバージニアメーソン病院によって提供された。最高のパーセントの腫瘍を有する外科的ブロックを最初に発見し、それからそのブロックを区分化することにより、スタンフォードおよびバージニアメーソンからのサンプルを調製した。それぞれが厚さ１０ミクロンの３つの区分を有する、３本の管を調整した。手順はベイラーとわずかに異なった。前立腺摘除術ブロック内の腫瘍から組織の核を取り除き、その後、１０ミクロンの区分にこの核を切断した。３本の管のそれぞれに１０の区分を含めた。
組織学的分析のために隣接した区分をスライドに取り付け、Ｈ＆Ｅ染色をした。病理学者は、グリーソン悪性度化およびパーセント腫瘍を単独に決定するために、これらのスライドを検査した。この報告書ですべての分析のためにグリーソン結果を使用した。最初の提供者グリーソン値は利用可能であるが、提供者の間で知られている仮言的なバイアスのために分析には使用しなかった。例えば、スタンフォードが悪性度を報告するためにパーセンテージグリーソン４／５を使用する一方で、他の２つの提供者は従来のシステムを使用する。グリーソン測定値は、単独の均一な測定値を提供した。
２、３のサンプルにはＨ＆Ｅスライド上で腫瘍細胞がないことが分かり、これらの患者は分析から除外された。さらに、我々は手術後にＰＳＡの絶望状態になっていない２、３の患者を見つけた。これらの患者もまた、研究から除外された。全部で６１２人の患者がデータ分析に含まれた。
コアリング技術のために、ベイラーによって提供されたサンプルのパーセント腫瘍は、他の提供者より高かった。
ネオアジュバントまたはアジュバント療法(ＰＳＡが上昇する前に）を受けた患者および手術の時点で陽性ノードのある患者を除いて、一定の年数の間、３つの機関で手術を受けたすべての患者、４０〜８０歳を本研究に含めた。ベイラーの期間は１９９３年〜１９９８年、バージニアメーソンは１９９６年〜２０００年、またスタンフォードは１９９６年〜１９９９年であった。
全体的なコホートは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃａｔａｌｏｎａによって収集され、２００４年(Ｒｏｅｈｌら）に説明されたコホートなどの文献に説明される、他の前立腺摘除術コホートと類似している。それぞれの提供者からの患者コホートは、ほぼすべての臨床的パラメータにわたり同様である。１つの例外は、再発のタイプである。他の機関が、患者のＰＳＡが手術後０．２ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上上昇するまで通常待つのに対して、スタンフォード大学泌尿器科は、ＰＳＡが０．０５まで上昇したとき、多くの患者を治療する。したがって、スタンフォードは、基準を治療するという決定に基づく比較的高い再発率、およびＰＳＡレベル(０．２ｎｇ／ｍｌ）基準に基づく比較的低い再発率を有する。事象定義基準の概要については、第６．１項を参照されたし。
図８９は、患者コホート(３つの提供者をすべて含む）のフォローアップ期間のヒストグラムを示す。白い棒は検閲を受ける前に再発のなかった患者から構成され、また陰付き棒は再発を経験した患者から構成されている。１９９３年〜２０００年に手術を受けた患者を選ぶことによって、我々はコホート(６６ヵ月）の平均フォローアップ期間が、かなりの数の再発した患者を有するのに十分長いことを確実にしてきた。
脱パラフィンのために、提供者によって配達された管で、６２７の提供されたＰＥＴサンプルを直接処理した。リモネンの１ｍｌ(バージニアメーソンおよびベイラー）または１．８ｍｌ(スタンフォード）をそれぞれの管に加えて、時折ボルテックスしてサーモミキサー内で室温で１０分間インキュベートした。サンプルは、１６，０００の×ｇで５分間、サンプルを遠心分離機にかけた。リモネン浮遊物を取り除き、沈殿物が検出されなければ、遠心分離をより高速で繰り返し、残りのリモネンを取り除いた。スタンフォードからサンプルでは、脱パラフィンプロセスは、残留するパラフィンを取り除くために、１．６ｍｌのリモネンで一度繰り返される。
組織溶解のために、脱パラフィンしたそれぞれのサンプルに１９０μｌの溶解緩衝液および２０μｌのプロテイナーゼＫを加えた。スタンフォードサンプルには、５７０μｌの溶解緩衝液および６０μｌのプロテイナーゼＫを使用した。ボルテックスした後、サンプルを短時間遠心分離機にかけ、６０℃で４０時間、サーモシェーカー上でインキュベートした。インキュベーションの後、溶解が完了したことを確実にするためにサンプルを検査し、その後９５℃で１０分の間、プロテイナーゼを不活性化した。ＤＮＡ抽出用の溶解したサンプルを直ちに使用しないときは、−２０℃に保存した。
サンプル提供者およびＰＳＡの再現に基づいて溶解物を無作為化した。２、３の修正をしたＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用してＤＮＡを分離した。４００μｌの緩衝液ＡＬ／Ｅを収集管に分配し、２００μｌの溶解物を加えた。１５秒間シェークしてサンプルを混ぜ合わせた。９６ウェルのＤＮｅａｓｙプレートの列に溶解物／緩衝液混合物を加えた。プレートを密封し、１０分間５７９０×ｇで遠心分離機にかけた。５００μｌのＡＷ１で列を１回洗浄し、その後５００μｌのＡＷ２で洗浄した。１２０μｌの緩衝液ＡＥでＤＮＡを溶出した。その結果、抽出されたＤＮＡの最終的な容量は約１２０μｌとなった。ＤＮＡを−２０℃で保存した。
バイサルファイト処理
抽出の後、サンプルのＤＮＡ濃度を定量化するために、ＣＦＦ実時間ＰＣＲアッセイを使用した。
ＣＦＦ配列：
ＴＡＡＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧ(８４ｂｐ）(配列番号：９７９）
ＣＦＦ−前方プライマー ＴＡＡＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ(配列番号：９８０）
ＣＦＦ−逆プライマー ＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣ(配列番号：９８１）
ＣＦＦＴａｑＭａｎプローブ ＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴ(配列番号：９８２)
我々はそれぞれのゲノムＤＮＡサンプルの濃度を調節したので、１ｕｇのＣＦＦ１の測定されたＤＮＡが４４μｌに存在した。パラフィンの埋め込まれた組織から抽出されたゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理を、９６ウェルのプロトコルを使用して実行した。４４μｌのゲノムＤＮＡ(約１μｇの増幅可能なＤＮＡで）、８３μｌの４．９Ｍのバイサルファイト溶液(ｐＨ５．４５〜５．５）、および１３μＬのＤＭＥ溶液を、プレートのウェルの中へピペットで移した。サンプルを完全に混ぜ合わせ、以下のプログラムによりサーモサイクラーに入れた。
・９９℃でＤＮＡの５：００分の変性
・６０℃で２２：００分のインキュベーション
・９９℃でＤＮＡの３：００分変性
・６０℃で１：２７：００時間のインキュベーション
・９９℃でＤＮＡの３：００分の変性
・６０℃で２：５７：００時間のインキュベーション
・２０℃で冷却
インキュベーションの後、それぞれのサンプルを２つの７０μＬのアリコートに分割した。それぞれのアリコートを、２８０μＬの調製された緩衝液ＡＶＬ／ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡおよび２８０μＬのエタノールと混合した。ウェルを密封し、１５秒間サンプルを激しく混ぜ合わせた。１０分間室温でプレートをインキュベートした。ＱＩＡａｍｐ９６のプレートに最初のアリコートを加え、４分間５７９０×ｇでプレートを遠心分離機にかけた。前記プロセスを第２のアリコートで繰り返し、それにより両方のアリコートが同一の結合列に加えることができた。列を５００μＬの緩衝液ＡＷ１で洗浄し、次に５００μＬの０．２ＭのＮａＯＨで洗浄し、その後５００μＬの緩衝液ＡＷ２で２回洗浄した。７０℃まで予熱した１００μＬの溶出緩衝液(Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡを溶出した。ＤＮＡビスを−２０℃で保存した。
バイサルファイト処理したＤＮＡサンプルを８×９６のウェルプレート(プレート０１〜０８）に保存した。それぞれのＱＭアッセイ用の、２枚の３８４ウェルＰＣＲ反応プレート上へサンプルおよび対照を混合した。それぞれのＱＭアッセイプレートは、標準的なＤＮＡ(検定ＤＮＡおよびテンプレート対照ＰＣＲ反応をなくすための水の７つの混合物）により、４×９６ウェルプレート(プレートごとに実際に使用される８５のウェル）および１ｘ９６ウェルプレートのサンプルを含む。ＱＭアッセイプレートを３回行った。
ＴＥＣＡＮワークステーションで、３８４ウェルＰＣＲプレートをピペットで取った。ピペット化プログラムにより、マスター混合の最初の１０μｌ、その後それぞれのＤＮＡの１０μｌを指定のウェルの中に移動させた。ファルコン管にマスター混合をピペットで取り、ＴＥＣＡＮワークステーションで自動的にピペットで取るために、８×５００μｌのねじ口バイアルに分配した。
２０μｌの反応体積を有するＡＢＩ ＴＡＱＭＡＮ ７９００ＨＴ実時間装置(ＳＤＳ２．２ソフトウェア）で、すべてのＱＭアッセイを行った。９６００エミュレーションでＰＩＴＸ２およびＣＣＮＤ２アッセイを行い、他のアッセイは行わなかった。正確なサンプル名と検出器／レポーター染料をＴＡＱＭＡＮソフトウェアへ転送するために、自動サンプルセットアップを使用した。サイクリング状態を手動で調節し、受動基準染料としてＲＯＸを使用した。それぞれを実行する結果ファイルを個別に生成するために、手動の分析セッティング(始まりおよび停止の値を有する基礎セッティングおよび手動閾値）を使用して、ＳＤＳ２．２ソフトウェアで、３８４すべてのウェルＰＣＲプレートを分析した。
方法：マーカー性能の評価
事象の定義
非転移性疾病患者の前立腺摘除術が成功した後は、身体に前立腺細胞が残っていないはずであり、したがって、ＰＳＡレベルはゼロまで下降するはずである。患者のＰＳＡレベルは通常、患者に前立腺癌がないままであることを確実にするために、手術後６〜１２ヵ月ごと測定される。ＰＳＡが発見できるようになり、特定のレベルまで上昇する場合は、医者および患者は追加的な治療を決定してもよい。したがって、ＰＳＡレベルの復帰および上昇は、疾病再発の主な兆候となる。
術後のＰＳＡの再現は、一連の逐次検定以降、レベルの段階的上昇または急速な上昇のどちらかによって典型的に示される。患者の臨床的特徴または機関のアプローチによって、ＰＳＡが見つけられるとすぐに、特定の閾値に達したとき、あるいは、臨床症状がＰＳＡの上昇に伴って起こるときに患者は治療されてもよい。大部分の機関は０．２ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルは顕著であると考え、患者のＰＳＡがこのレベルに達して、続くテストで上昇していることが確認されると、追加的な治療が提案される。サンプル提供者のうちの１つである、スタンフォード大学泌尿器科は、０．０５ｎｇ／ｍｌはＰＳＡの再現であると考え、ＰＳＡがこのレベルに達すると、患者の治療を検討する。
本研究の事象は、すべてのＰＳＡに基づく再発を含む。続くテストで確認された、０．２ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルは、再発の検出に最高の感度および特異性を提供するために示されてきた(Ｆｒｅｅｄｌａｎｄら、２００３）。このレベルへのＰＳＡの上昇は通常、臨床再発のどんな進行にも先行し、したがって、本研究のほぼ全員の患者は、ＰＳＡの再現の時点で臨床再発のないままである。この０．２ｎｇ／ｍｌのカットオフに達する前に、スタンフォードはしばしばＰＳＡの再現により患者を治療するので、０．２ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルだけが考えられた事象であるならば、再発患者の多くは本研究において検閲を受けるであろう。したがって、ＰＳＡレベルのために治療を受ける３つの機関のいずれかからの患者もまた、本研究では事象と考えられる。
要約すると、事象は、本研究において、ＰＳＡにおける０．２ｎｇ／ｍｌまでのいかなる上昇(続くテストで確認される）、またはＰＳＡ基準に基づいて患者を治療するという決定として定義される。
未加工ＱＭデータ処理
本報告書のすべての分析は、ＣＴ評価に基づく。最適実時間ＰＣＲ状態が指数関数増幅段階にあると仮定すると、メチル化されたＤＮＡ(Ｃmeth）の濃度は以下によって決定できる。
ここでは、
ＣＴCGはＣＧリポーター(ＦＡＭチャネル）の閾値サイクルを意味し、
ＣＴTGはＴＧリポーター(ＶＩＣチャネル)の閾値サイクルを意味する。
増幅プロット(ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ）の外観検査によって、サイクルの閾値を決定した。ＡＢＩ７９００ソフトウェアによってこれらの閾値でサイクルの値(ＣＴCGおよびＣＴTG）を計算した。増幅曲線が閾値を超えないときはいつでも、サイクルの値は最大サイクル、例えば５０に設定される。
統計分析のためにＲソフトウェアパッケージ、バージョン２．２．(ＧｅｎｔｌｅｍａｎおよびＩｈａｋａ、１９９７)を使用した。
さらに、我々は生存率分析のために、「ｓｕｒｖｉｖａｌ」パッケージ、バージョン２．１１−５(ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ａｔ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｓｒｃ／ｃｏｎｔｒｉｂ／Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ／ｓｕｒｖｉｖａｌ．ｈｔｍｌ）を使用した。
ｋ−倍クロス確認、ＲＯＣ分析およびプロット機能のために、独自に開発したコードを使用した。
「Ａｎｎｏｔａｔｅｄ Ｄａｔａ Ｍａｔｒｉｘ」(ＡＤＭ）と呼ばれる、独自に開発したデータオブジェクトに、それぞれのデータセットを表す。このデータオブジェクトは、サンプルおよびアッセイのための必要なすべての注釈と同様に、品質管理および平均化の後の測定を含む。
ＱＭアッセイ検定曲線
０から１００パーセントのメチル化に及ぶ、メチル化されたＭＤＡ−ＤＮＡおよび非メチル化されたＭＤＡ−ＤＮＡの一連の混合物を、３組のそれぞれのＱＭ ＰＣＲプレートに含めた。すべてのＰＣＲプレートで均一なＱＭアッセイの性能を確実にするために、これらのＤＮＡを使用した。すべてのアッセイは１０％と１００％との間で強い定量的能力を示し、一部のアッセイは５％メチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを一貫して識別できた。
統計方法
品質管理の後、それぞれのアッセイを統計学的に分析した。
コックス回帰
コックスの比例ハザードモデル(ＣｏｘおよびＯａｔｅｓ、１９８４；Ｈａｒｒｅｌ、２００１）を使用して、再発のない生存期間(ＲＦＳ）と共変量との関係を分析した。
ハザード、すなわち、再発の瞬間リスクは、一変量および重回帰分析のために、
ｈ(ｔ｜ｘ)＝ｈ0(ｔ)ｅｘｐ(βｘ) (３)
および
ｈ(ｔ｜ｘ1，…，ｘk)＝ｈ0(ｔ)ｅｘｐ(β1ｘ1＋…＋βkｘk） (４）
として形に表され、それぞれ、ｋは１０であり、ｍは１００、ｔは手術後何ヶ月も測定される時間であり、ｈ0(ｔ）は(特定されていない）基線ハザードであり、ｘiは共変量(例えば、アッセイの測定）であり、βiは回帰係数(モデルのパラメータ）である。βiは、コックスの比例ハザードモデルの部分尤度を最大化することによって予測されるであろう。
メチル化がハザードに関連しているかどうか検定するために、尤度比検定を実行した。フルモデルとヌルモデルの２Ｌｏｇ(尤度)との差異は、帰無仮説β1＝…＝βk＝０のもとで、自由度ｋで約X2−分散する。
計測されたＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄの残渣(ＴｈｅｒｎａｕおよびＧｒａｍｂｓｃｈ、２０００）によって、比例ハザードの仮説を評価した。コックスの比例ハザードモデルの計算、分析および診断のために、「ｓｕｒｖｉｖａｌ」パッケージのＲ関数「ｃｏｘｐｈ」および「ｃｏｘｐｈ．ｚｐｈ」を使用した。
段階的な回帰分析
複数のコックス回帰モデルでは、関連変量のみを含むサブモデルを発見するために、段階的な手順(ＶｅｎａｂｌｅｓおよびＲｉｐｌｅｙ、１９９９；Ｈａｒｒｅｌ、２００１）を使用した。２つの効果は、通常これらの手順によって達成される。
・関連した情報をモデルに加えないので、基本的に従属変数(ＤＦＳ／ＭＦＳ）とは無関係である変数(メチル化率）は除外される。
・大いに相関性のある一組の変数の中から、従属変数と最良の関係を有するものだけを保持する。
両タイプの変数を含めることにより、数値的不安定およびと検出力の損失に通じる可能性がある。さらに、予測の機能が、オーバーフィッティングのために低くなることもある。
応用アルゴリズムは、Ａｋａｉｋｅ情報量基準(ＡＩＣ）を最小化することを目指す。
ＡＩＣはモデルの性能に関連があり、より低い値ほどより良い性能を約束する。追加の変数を含めることにより、モデルフィットが常に改善され、したがって尤度が増加するのに対して、第２の期間は追加のパラメータの推定を不利にする。最良のモデルは、優れたフィット、また通常少ないまたは適度な数の変数を有する妥協モデルを提示する。ＡＩＣによる段階的な回帰計算を、Ｒ関数「ｓｔｅｐ」で行う。
カプランマイヤー生存曲線およびログランク検定
生存者のためにカプランマイヤー推定量を使用して、ＲＦＳデータから生存曲線を推定した(ＫａｐｌａｎおよびＭｅｉｅｒ、１９５８)。２本の生存曲線、例えば高メチル化群対低メチル化群の差異を検定するために、ログランク検定(ＣｏｘおよびＯａｔｅｓ、１９８４)を使用した。さらに、一般化ウィルコクソン検定と通常称されるログランク検定の変形を適用した(説明には、ＨｏｓｍｅｒおよびＬｅｍｅｓｈｏｗ、１９９９を参照）。カプランマイヤー分析では、「ｓｕｒｖｉｖａｌ」パッケージの関数「ｓｕｒｖｆｉｔ」と「ｓｕｒｖｄｉｆｆ」を使用した。
他の共変量からの単一マーカーおよびマーカーパネルの非依存性
本マーカーが追加および独立情報を伝えるかどうかを検査するために、コックスの比例ハザードモデルに他の関連した臨床要因を含め、あらゆる要因のための重量のためのｐ値を計算した(Ｗａｌｄ−Ｔｅｓｔ）(Ｔｈｅｒｎａｕら、２０００）。コックスの比例ハザードモデルにおける更なる要因の分析には、Ｒ関数「ｃｏｘｐｈ」を使用した。
複数の検定修正
複数の検定のための修正は行わなかった。
密度推定
数値変数には、ガウシアンカーネルおよび可変的な帯域幅により、カーネル密度推定を実行した。シルバーマンの「経験則」(Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、１９８６）を使用して、帯域幅を決定した。密度の計算には、Ｒ関数「ｄｅｎｓｉｔｙ」を使用した。
感度と特異性の分析
ベイズ公式を用いて感度および特異性を計算する方法は、所定の時間ＴThresholdのマーカー陽性群およびマーカー陰性群で、生存確率のカプランマイヤー推定量(Ｈｅａｇｅｒｔｙら、２０００）に基づいている。異なる基準期間ＴThreshold(３年、４年、５年、６年）のためにＲＯＣを計算した。
ｋ倍クロス確認
モデルの選択およびモデルのロバスト性の分析には、ｋ倍クロス確認(Ｈａｓｔｉｅら、２００１）を使用した。一連の観察をｋ塊に無作為に分けた。言い換えると、すべての塊を検定組として使用するのに対して、残りのｋ−１塊は訓練組を構成する。この手順を、ｍ回繰り返す。
結果
上述のように、６０５のサンプルを処理した。３つの複製を有する６つのマーカーＱＭアッセイで、すべてのサンプルを分析した。品質管理のためにデータをフィルタにかけて、方法の項で説明したように分析した。それぞれのマーカーの臨床性能を以下に要約し、カプランマイヤー生存曲線およびＲＯＣ曲線は図９０から図９５に一致している。グラフ中で報告された生存曲線の比較のためのｐ値は、普通のログランク検定に基づいている。一般化ウィルコクソン検定を使用した結果も、基本的に同様である(データを図示せず）。
カットオフとして平均値メチル化レベルを使用して、マーカーの性能を最初に吟味した。データを見る前にこのカットオフを決定したので、マーカーの性能を判断するのにｐ値を使用できる。カットオフとして平均値メチル化を使用している大幅なｐ値を有するどんなマーカーでも、有効であると考えられる。平均値メチル化レベルがすべてのマーカーに最良のカットオフであるとは限らず、これらのマーカーのために、予後分離は、最も低いｐ値をもたらすメチル化カットオフを選ぶことによってさらに最適化できる。カットオフがｐ値に特に最適化されるので、ｐ値はもはや統計的有意性を示すのに使用できない。
カットオフとして平均値メチル化を使用しているマーカーの性能の重要性を判断するために、我々は０．００５(６つの比較のための修正を仮定する）のｐ値を使った。ｐ値(０．００８未満）および事象分離に基づいて、ＰＩＴＸ２は最有力な候補となる。配列番号：３５を有するＧＰＲ７。したがって、これらの２つのマーカーは、術後前立腺癌予後の有効なマーカーと考えられる。カットオフ(ｐ値０．０１８および０．００５９）として平均値メチル化レベルを使用する配列番号：６３は顕著ではなかったが、メチル化のカットオフが最適化されるとき、うまく機能する。結果については表１７を参照されたし。
図９０Ａは、最適化されたメチル化カットオフ値(１３．５％）を使用している品質管理フィルタを通過した、５８５の患者サンプルのＰＩＴＸ２マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示す。９０Ｂは、カットオフとして所定の平均値メチル化値を使用しているＰＩＴＸ２マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示し、ｐ値は０．００００１７であった。図９０Ｃは、５年のフォローアップ後の、、ＰＩＴＸ２マーカーのＲＯＣ曲線分析を示す。平均値メチル化カットオフを三角形でマークし、最適化されたメチル化カットオフをダイヤモンドで示す。ＡＵＣは、０．６４であった。
図９１Ａは、最適化されたメチル化カットオフ値(１８．０６％）を使用している品質管理フィルタを通過した、５９６の患者サンプルのＧＰＲ７マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示す。図９１Ｂは、カットオフとして所定の平均値メチル化値を使用している前記マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示し、ｐ値は０．００１６であった。図９１Ｃは、５年のフォローアップ後の、前記マーカーのＲＯＣ曲線分析を示す。平均値メチル化カットオフを三角形でマークし、最適化されたメチル化カットオフはダイヤモンドで示す。ＡＵＣは、０．６４であった。
図９２Ａは、最適化されたメチル化カットオフ値(５．７９％)を使用している品質管理フィルタを通過した、５９９の患者サンプルの配列番号：６３のマーカーのカプランマイヤー生存率分析を示す。
図９２Ｂは、カットオフとして所定の平均値メチル化値を使用している前記マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示し、ｐ値は０．０１８であった。図９２Ｃは、５年のフォローアップ後の、前記マーカーのＲＯＣ曲線分析を示す。平均値メチル化カットオフを三角形でマークし、最適化されたメチル化カットオフをダイヤモンドで示す。ＡＵＣは、０．６０であった。
図９３Ａは、最適化されたメチル化カットオフ値(３６．７７％)を使用している品質管理フィルタを通過した、５９８の患者サンプルの配列番号：３５のマーカーのカプランマイヤー生存率分析を示す。
図９３Ｂは、カットオフとして所定の平均値メチル化値を使用している前記マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示し、ｐ値は０．０５９であった。図９３Ｃは、５年のフォローアップ後の、前記マーカーのＲＯＣ曲線分析を示す。平均値メチル化カットオフを三角形でマークし、最適化されたメチル化カットオフをダイヤモンドで示す。ＡＵＣは、０．６１であった。
図９４Ａは、最適化されたメチル化カットオフ値(２８．４１％）を使用している品質管理フィルタを通過した、５９２の患者サンプルのＡＢＨＤ９マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示す。図９４Ｂは、カットオフとして所定の平均値メチル化値を使用している前記マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示し、ｐ値は０．０１８であった。図９４Ｃは、５年のフォローアップ後の、前記マーカーのＲＯＣ曲線分析を示す。平均値メチル化カットオフを三角形でマークし、最適化されたメチル化カットオフをダイヤモンドで示す。ＡＵＣは、０．５８であった。
図９５Ａは、最適化されたメチル化カットオフ値(２．２２％）を使用している品質管理フィルタを通過した、６０４の患者サンプルのＣＣＮＤ２マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示す。図９５Ｂは、カットオフとして所定の平均値メチル化値を使用している前記マーカーのカプランマイヤー生存率分析を示し、ｐ値は０．２２であった。図９５Ｃは、５年のフォローアップ後の、前記マーカーのＲＯＣ曲線分析を示す。平均値メチル化カットオフを三角形でマークし、最適化されたメチル化カットオフをダイヤモンドで示す。ＡＵＣは、０．６１であった。
患者の臨床サブセットにおけるマーカーの評価
前立腺癌を評価するために、いくつかの臨床予後因子を普通に使用した。グリーソン悪性度化システムを使用している腫瘍分化状態の定量化による腫瘍の組織学的分析は、現在の臨床診療において特に重要な予後指標である。マーカーがグリーソンカテゴリー内で患者を再分割することによって、グリーソン分析を改善できるかどうか決定することにより分析を継続した。我々は、マーカーがノモグラムリスク推定(Ｈａｎら、２００３）および疾病期など、他の予後指標に情報を加えることができるかどうかも調査した。
これらの分析には、我々は、我々のマーカーが集団サブ群でまだ有益かどうか決定するカプランマイヤー分析、および、前記マーカーが予後の臨床的変数と無関係である情報を提供するかどうか決定するコックスの回帰分析を使用した。グリーソンスコア(Ｃｈａｒｉｔｅ Ｇｌｅａｓｏｎ判定を使用）を３群(６以下、７、および８から１０）に分類し、病期を２群(Ｔ２／局限性臓器およびＴ３／非局限性臓器）に分類し、ＰＳＡを４群(０から４ｎｇ／ｍｌ、４から１０ｎｇ／ｍｌ、１０から２０ｎｇ／ｍｌ、および２０ｎｇ／ｍｌより大きい）に分類し、５年間ＰＳＡのない生存者のノモグラム推定を２群(９０から１００％および０から８９％）に分類した。
ＰＩＴＸ２
コックスの回帰モデル化では、ＰＩＴＸ２は他の臨床的予後情報と無関係である有用な予後マーカーとなる(表１８）。言い換えると、ＰＩＴＸ２メチル化により、ＰＳＡまたは疾病期より多くの情報がグリーソンに追加される。ＰＩＴＸ２に対するハザード率は２．２である。サブ群の生存率分析において、ＰＩＴＸ２は、すべての前立腺癌患者の重要なマーカーとなるべき可能性を有する。
局限性臓器疾病を有する患者サブ群内で激しい分離が見られることは、とりわけ興味深い(図９６）。局限性臓器疾病(Ｔ２）を有する患者は、手術によって治療されるべきである。手術によって治療されていない患者は、手術前に前立腺を残す細胞を多少有していたはずであり、したがって、進行の初期段階に、浸潤性特徴を有する腫瘍細胞を有していたはずである。ＰＩＴＸ２は、Ｔ２群を、非常にわずかな再発の可能性(〜５％）を有する低メチル化された群、および、むしろＴ３患者に近い予後を有する高メチル化された群に分類できる。
図９６は、病期に基づくサブ集団で、ＰＩＴＸ２性能の生存率分析を示す。左上プロットは、予後マーカーで疾病期の性能を示す。右上プロットは、ｐＴ２患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。左下プロットは、ｐＴ３患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。
ＰＩＴＸ２はまた、グリーソンサブカテゴリ内で患者を階層化することができる。図９７は、低いグリーソン患者(スコア５または６）および高いグリーソン患者(スコア８、９または１０）の生存率分析が低いｐ値をもたらすことを示す。高いグリーソンスコアを有する患者は現在のところ、術後アジュバント療法に関する臨床試験の候補である。しかし、ＰＩＴＸ２値は、これが均一な群でないことを示唆する。ＰＩＴＸ２の低メチル化では、高いグリーソン患者は１０年で無病生存が８５％の確率を有する一方で、高メチル化では、高いグリーソン患者は非常に低い可能性(〜３５％）を有する。疾病再発の高い尤度を有するこれらの患者は、アジュバント療法または臨床試験に選ばれるべき患者である。
図９７は、グリーソンスコアカテゴリーに基づくサブ集団で、ＰＩＴＸ２性能の生存率分析を示す。左上プロットは、予後マーカーでグリーソンスコアの性能を示す。グリーソン５または６の患者をＡとマークし、グリーソン７の患者をＢとマークし、グリーソン８、９および１０の患者をＣとマークする。右上プロットは、グリーソン５および６の患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。左下プロットは、グリーソン７の患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。右下プロットは、グリーソン８、９および１０の患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。
患者の大きなコホートに基づいて、前立腺癌ノモグラムを作成する。それらは、病期、グリーソンおよび手術前のＰＳＡレベルからの情報を１つの予後指標に数学的に組み合わせる。図９８が示すように、ノモグラム自体は非常に強力である。しかし、ＰＩＴＸ２はさらに患者を再分割することができる。
図９８は、ノモグラムリスク推定に基づくサブ集団で、ＰＩＴＸ２性能の生存率分析を示す。左上プロットは、予後マーカーでノモグラムの性能を示す。右上プロットは、ノモグラムに準じて５年でＰＳＡのない生存の可能性が９０％の患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。左下プロットは、ノモグラムに準じて５年でＰＳＡのない生存の可能性が９０％未満の患者でのＰＩＴＸ２の性能を示す。
配列番号：６３
コックスの回帰分析では、配列番号：６３は、他の臨床的予後情報と無関係である有用な予後マーカーとなる(表１９）。ハザード率は２．９である。サブ群の生存率分析において、配列番号：６３は、高いグリーソン患者(図９９）およびモノグラムに基づく芳しくない予後を有する患者(図１００）など、一部のサブ群の重要なマーカーとなるべき可能性を有しているように見える。
図９９は、グリーソンスコア８、９および１０の患者での配列番号：６３の性能の生存率分析を示す。
図１００は、ノモグラムに準じて５年でＰＳＡのない生存の可能性が９０％未満の患者での配列番号：６３の性能の生存率分析を示す。
配列番号：３５は、ｐＴ２患者などの一部のサブ群用のマーカーである(図１０１）。
考察
ＰＩＴＸ２、配列番号：３５、およびＧＰＲ７はすべて、中央値メチル化レベルがカットオフとして使用されるとき、重要な予後情報を示す。メチル化カットオフを中央値より高く設定することは、これら３つのマーカーの性能を向上させる。これは、マーカーの陽性群を減少させて、検定の特異性を増加させる効果を有する。中央値メチル化レベルは、配列番号：６３のためには最適ではない。その代わりに、より低いカットオフは、このマーカーのために良好および不良予後の群をより明瞭に分類する。これら４つのマーカーのための最適化されたメチル化カットオフ値はすべて、それぞれのアッセイが技術的によく適している範囲内に収まる。
サンプルが本研究において分析された患者は、前立腺摘除術検定のために標的となるであろう集団を代表する。したがって、これらのマーカーが将来の患者に提供することもあり得る情報について思索することは可能である。ＰＩＴＸ２は、例えば、約６０％の感度と７０％の特異性を有する。図９０のカプランマイヤー分析では、マーカーの陽性群は１０年後に、マーカーの陰性群が有する再発のリスクの約３倍を有する。図９７では、ＰＩＴＸ２が陽性であるグリーソン８〜１０の患者は、１０年以内のＰＳＡの再現の可能性を６５％有する。対照的に、マーカーが陰性であったグリーソン８〜１０の患者は、たった１５％のＰＳＡの再現の可能性を有した。メチル化マーカー情報をグリーソン層化へ追加することにより、臨床医は、アジュバント療法から最も便益を得ることができる、予後の芳しくないサブ群を特定することができる。アジュバント療法臨床試験の患者の選択手順に、これらのメチル化マーカーを組み込む場合、臨床医は、予後の芳しくない患者のための早期アジュバント治療の追加に明瞭な便益を見始める可能性がある。
情報をグリーソンに追加することに加えて、ＰＩＴＸ２および他のマーカーのうちのいくつかは、局限性臓器疾病を有する患者を階層化することもできる。臓器に実に局限される疾病を有する患者は、臓器の完全なる除去によって治療されるであろう。臓器に局限されると見られる疾病を有するが、検出されていない微小転移巣を有する患者は、手術によって治療されないであろう。両方とも手術可能な小さな病巣を有するこれら２つの群の患者は、転移に対して非常に異なる潜在的可能性を有する腫瘍を有する。ＰＩＴＸ２および他のマーカーのうちのいくつかは、基本的な腫瘍の浸潤性において根本的なこれらの差異を検出しているように見える。
現在使用されているマーカーに情報を追加するこれらのマーカーの能力は、最も重要である。グリーソンおよび病期分類化はすでに重要な予後情報を提供しており、従来からの情報源に取って代わることはないが補完するであろう新しい検定はどちらも、より有益であり、また臨床治療においてすぐに採用される可能性がより高い。
患者のサブ群でのマーカーのアッセイでは、多くの場合、マーカーは、従来の臨床的変数に基づく芳しくない予後を有する患者に対し最も効果があるようであった。グリーソン８〜１０の患者およびＰＳＡのない生存者のノモグラムの確率が低い患者を、本マーカーによって、良好および不良予後の群にうまく階層化した。前立腺摘除術検定には、アジュバント療法から最も便益を得ることができる、不良予後の患者群を選択するのに前記検定が使用されるであろうから、これらの患者は標的とするのに理想的である。Ｔ３患者(非局限性臓器疾病）には、マーカー配列番号：６３が好ましい。概して、この分析は、本マーカーが不良予後の患者を特定するのに特によく適していることを証明している。
実施例６：パラフィンの埋め込まれた組織でのアッセイの検定
以下のアッセイでは、配列番号：１９、３５、３７および６３の分析のために、表１２で示すアッセイを用いて、パラフィンの埋め込まれた前立腺組織のサンプル内のメチル化を分析した。その後、これを実施例２で説明した冷凍サンプルに実行された同じ測定と比較した。
サンプル
サンプルは、パラフィンの埋め込まれた前立腺摘除術サンプル、または実例３で説明された新鮮冷凍組織であった。サンプルを区分化し、組織を溶解し、その後、ＤＮＡを抽出し、バイサルファイト変換した。
３０９のパラフィンの埋め込まれたサンプルが利用可能であり、使用されているＰＣＲにつき１ｎｇから１０ｎｇの間のＤＮＡを有し、ＰＣＲにつき少なくとも１ｎｇのＤＮＡを有するこれらすべてのサンプルを分析に含めた。
試薬：
１×Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ緩衝液Ａ
０．２５ｍＭのｄＮＴＰ
３．５ｍＭのＭｇＣｌ２
９００ｎＭの各プライマー
３００ｎＭのプローブ
１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ金
サーマルサイクリングプロファイル：
ステップ１、９５℃−＞１０分(Ｔａｑ活性化）
反復：１
ステップ２、９５℃−＞１５秒(変性）
６３．０℃−＞１分(アニーリング／けん引法）
反復：５０
以下のカテゴリーを比較した
１．早期生化学的再発(前立腺摘除術後２４ヵ月未満のＰＳＡの再現）対生化学的非再発(手術後最低４年のＰＳＡモニターリングの間のＰＳＡの大幅な上昇なし）
１３２のサンプルが非再発群において利用可能であり、５９のサンプルが早期再発群において利用可能である。
２．高いグリーソン(スコア＝８〜１０）対低いグリーソン(スコア＝悪性度４または悪性度５の要素のないスコア２〜６）
５９のサンプルが高いグリーソン群において利用可能であり、６４のサンプルが低いグリーソン群において利用可能である。
結果
図１０２から図１２５に結果を示し、上述のウィルコクソン検定を使用して計算した。
図１０２は、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１０３は、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１０４は、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１０５は、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１０６は、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１０７は、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１０８は、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１０９は、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１０は、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１１は、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１２は、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１３は、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用している早期生化学的再発対生化学的非再発の比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１４は、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１１５は、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１１６は、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１１７は、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍およびＰＥＴの両サンプルで検出された増幅産物を示す。
図１１８は、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１１９は、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２０は、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２１は、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２２は、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２３は、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２４は、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１２５は、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用している高いグリーソン対低いグリーソンの比較において、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。
図１は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：１９のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図２は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：３５のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図３は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：３７のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図４は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：７のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図５は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：６３のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図６は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、配列番号：８のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図７は、早期ＰＳＡ再現を有する患者からの２６の根治的前立腺摘除術冷凍サンプル、および少なくとも４８ヶ月後、ＰＳＡ再現のない患者からの３０のサンプルに対して行った、ＭＳＰアッセイ配列番号：６４のＭＳＰアッセイに対するＲＯＣプロットを示す。 図８は、１２のＤＮＡサンプルにおけるゲル電気泳動分析を示す。ＤＮＡあたり２００ｎｇを０．８％のアガロース・ゲルに適用した。ゲルを８０ボルトで４時間流した。サイズマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、番号：１０４９６−０１６）は、１０．０００ｂｐ、６．０００ｂｐの断片を含む。 図９は、単一のＰＣＲ生成物（ｓＰＣＲ Ｓｅｔ Ｄ２）と比較する多重送信のＰＣＲ生成物（８ｐｌｅｘ、ｍＰＣＲ Ｓｅｔ Ｄ２）のＡＬＦ Ｅｘｐｒｅｓｓ分析を示す。サイズ標準（レーン１、４）は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｂｐの長さの断片を含んだ。全ての断片を増幅することができた。好ましくない副生物（２２０ｂｐ）を観察した。 図１０は、多重送信ＰＣＲの実施を示す。レーン１：１００ｂｐマーカー。レーン２〜１１：１０のテストサンプルの多重送信ＰＣＲの実施、レーン１２：陽性対照、レーン１３：Ｈ２Ｏ対照。 図１１は、ウィルコクソン検定により順位付けされた腫瘍対リンパ球のサンプルを示す。ボンフェローニの補正をしたｐ値（最大値）およびＡＵＣ（最小値）をデータ行列の右に示す。各行は、１つのサンプルを示し、各列は、１つのオリゴヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチドをマーカー候補ごとに分類した。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加と共に、上からの下の順となっている。各マーカーの右側に、ボンフェローニの補正をしたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを示す。０．７５未満の特異度でＡＵＣ感度以下のものを大括弧で囲んで示している。個々のオリゴヌクレオチドに対する標準偏差で、メチル化データを中心とし、正規化した。色は、平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を示す。濃い灰色は、オリゴヌクレオチド内での高メチル化ＣｐＧを示すが、薄灰色は、オリゴヌクレオチド内での低メチル化ＣｐＧを示す。 図１２は、グリーソンマーカー順位付けにおける高い値と低い値の比較を示す。プロットは、ＧｅｎｅＷｉｓｅのウィルコクソン順位統計分析から補正されていないｐ値を示す。低い破線と高い破線は、それぞれ５％のボンフェローニおよびＦＤＲの境界を示す。 図１３は、最高のＡＵＣ値を有する、１０のマーカーのうちグリーソンマーカーにおける高い値と低い値の比較を示す。グリーソンスコアは、サンプルの各グループの上に示す。各行は、１つのサンプルを示し、各列は、１つのオリゴヌクレオチド（各１、２、または３つのＣｐＧの場所）を示す。オリゴヌクレオチドをマーカー候補ごとに分類した。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加と共に、上からの下の順となっている。各マーカーの右側に、ボンフェローニの補正をしたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを示す。０．７５未満の特異度でＡＵＣ感度以下のものを大括弧で囲んで示している。個々のオリゴヌクレオチドに対する標準偏差で、メチル化データを中心とし、正規化した。色は、平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を示す。濃い灰色は、オリゴヌクレオチド内での高メチル化ＣｐＧを示すが、薄灰色は、オリゴヌクレオチド内での低メチル化ＣｐＧを示す。 図１４は、マーカー順位付けにおける早期再現と再現のないものの比較を示す。プロットは、ＧｅｎｅＷｉｓｅのウィルコクソン順位統計分析から補正されていないｐ値を示す。低い破線と高い破線は、それぞれ５％のボンフェローニおよびＦＤＲ限界を示す。 図１５は、最高のＡＵＣ値を有する、１０のマーカーのメチル化マトリクスにおける早期再現と再現のないものの比較を示す。各行は、１つのサンプルを示し、各列は、１つのオリゴヌクレオチド（各１、２、または３つのＣｐＧの場所）を示す。オリゴヌクレオチドをマーカー候補ごとに分類した。示されたマーカーは、ＡＵＣの増加と共に、上からの下の順となっている。各マーカーの右側に、ボンフェローニの補正をしたウィルコクソンｐ値およびＡＵＣを示す。０．７５未満の特異度でＡＵＣ感度以下のものを大括弧で囲んで示している。個々のオリゴヌクレオチドに対する標準偏差で、メチル化データを中心とし、正規化した。色は、平均値からのオリゴヌクレオチドメチル化状態の相対距離を示す。濃い灰色は、オリゴヌクレオチド内での高メチル化ＣｐＧを示すが、薄灰色は、オリゴヌクレオチド内での低メチル化ＣｐＧを示す。 図１６は、配列番号：１４の増幅産物を示す。 図１７は、配列番号：１５の増幅産物を示す。 図１８は、配列番号：１６の増幅産物を示す。 図１９は、配列番号：１７の増幅産物を示す。 図２０は、配列番号：１８の増幅産物を示す。 図２１は、配列番号：１９の増幅産物を示す。 図２２は、配列番号：２０の増幅産物を示す。 図２３は、配列番号：２１の増幅産物を示す。 図２４は、配列番号：２２の増幅産物を示す。 図２５は、配列番号：２３の増幅産物を示す。 図２６は、配列番号：２４の増幅産物を示す。 図２７は、配列番号：２５の増幅産物を示す。 図２８は、配列番号：２６の増幅産物を示す。 図２９は、配列番号：２７の増幅産物を示す。 図３０は、配列番号：２８の増幅産物を示す。 図３１は、配列番号：２９の増幅産物を示す。 図３２は、配列番号：３０の増幅産物を示す。 図３３は、配列番号：３１の増幅産物を示す。 図３４は、配列番号：３２の増幅産物（増幅産物Ａ）を示す。 図３５は、配列番号：３２の増幅産物（増幅産物Ｂ）を示す。 図３６は、配列番号：３３の増幅産物を示す。 図３７は、配列番号：３４の増幅産物を示す。 図３８は、配列番号：３５の増幅産物を示す。 図３９は、配列番号：１３の増幅産物を示す。 図４０は、配列番号：３６の増幅産物を示す。 図４１は、配列番号：３７の増幅産物を示す。 図４２は、配列番号：１の増幅産物を示す。 図４３は、配列番号：２の増幅産物を示す。 図４４は、配列番号：３の増幅産物を示す。 図４５は、配列番号：４の増幅産物を示す。 図４６は、配列番号：５の増幅産物を示す。 図４７は、配列番号：６の増幅産物を示す。 図４８は、配列番号：７の増幅産物を示す。 図４９は、配列番号：３８の増幅産物を示す。 図５０は、配列番号：３９の増幅産物を示す。 図６０は、配列番号：４０の増幅産物を示す。 図６１は、配列番号：４１の増幅産物を示す。 図６２は、配列番号：４２の増幅産物を示す。 図６３は、配列番号：４３の増幅産物を示す。 図６４は、配列番号：４４の増幅産物を示す。 図６５は、配列番号：４５の増幅産物を示す。 図６６は、配列番号：４６の増幅産物を示す。 図６７は、配列番号：４７の増幅産物を示す。 図６８は、配列番号：４８の増幅産物を示す。 図６９は、配列番号：４９の増幅産物を示す。 図７０は、配列番号：５０の増幅産物を示す。 図７１は、配列番号：５１の増幅産物を示す。 図７２は、配列番号：５２の増幅産物を示す。 図７３は、配列番号：５３の増幅産物を示す。 図７４は、配列番号：５４の増幅産物を示す。 図７５は、配列番号：５５の増幅産物を示す。 図７６は、配列番号：５６の増幅産物を示す。 図７７は、配列番号：５７の増幅産物を示す。 図７８は、配列番号：５８の増幅産物を示す。 図７９は、配列番号：５９の増幅産物を示す。 図８０は、配列番号：６０の増幅産物を示す。 図８１は、配列番号：６１の増幅産物を示す。 図８２は、配列番号：６２の増幅産物を示す。 図８３は、配列番号：８の増幅産物を示す。 図８４は、配列番号：９の増幅産物を示す。 図８５は、配列番号：１０の増幅産物を示す。 図８６は、配列番号：１１の増幅産物を示す。 図８７は、配列番号：１２の増幅産物（増幅産物Ａ）を示す。 図８８は、配列番号：１２の増幅産物（増幅産物Ｂ）を示す。 図８９は、実施例５に分析されるような、患者のフォローアップ期間の分布を示す。白い帯は、全ての打ち切り（ＰＳＡ再現がない）患者の分布を示す。灰色の帯は、全ての再発患者に対する無ＰＳＡ生存期間の分布を示す。頻度をＹ軸に示し、期間（月）をＸ軸に示す。 図９０は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＰＩＴＸ２のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合をＹ軸に示し、期間（年）をＸ軸に示す。 図９１は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＧＰＲ７のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。 図９２は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、配列番号：６３のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。 図９３は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、配列番号：３５のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。 図９４は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＡＢＨＤ９のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。 図９５は、実施例５による、前立腺癌患者間の分化における、ＣＣＮＤ２のマーカー（Ａ＆Ｂ）のカプラン・マイヤー法による生存期間分析およびマーカーＰＩＴＸ２のＲＯＣ曲線解析（Ｃ）を示す。無再発患者の割合は、Ｙ軸に示され、期間（年）は、Ｘ軸で示される。 図９６は、実施例５による、病期に基づき、亜母集団におけるＰＩＴＸ２実施のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。 図９７は、実施例５による、グリーソンスコアに基づき、亜母集団におけるＰＩＴＸ２実施のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。 図９８は、実施例５による、ノモグラムスコアに基づき、亜母集団におけるＰＩＴＸ２実施のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。 図９９は、実施例５による、高グリーソンスコアに基づき、亜母集団における配列番号：６３のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。 図１００は、実施例５による、不良のノモグラムスコアに基づき、亜母集団における配列番号：６３のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。 図１０１は、実施例５による、Ｔ２の亜母集団における配列番号：３５のカプラン・マイヤー法による生存期間分析を示す。 図１０２は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１０３は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１０４は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１０５は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１０６は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１０７は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１０８は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１０９は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１１０は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１１１は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１１２は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１１３は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、早期生化学的再現対無生化学的再現の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１１４は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１１５は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１１６は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１１７は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍およびＰＥＴサンプルの双方で検出された増幅産物を示す。 図１１８は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１１９は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１２０は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１２１は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、ＰＥＴサンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１２２は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：１９のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１２３は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：６３のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１２４は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３５のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。 図１２５は、実施例６で記載されるように、表１２に示される配列番号：３７のアッセイを使用して、高グリーソン悪性度対低グリーソン悪性度の比較における、冷凍サンプルのみで検出された増幅産物を示す。

Claims (6)

  1. ＰＩＴＸ２遺伝子内の１つ以上のＣｐＧ配列のメチル化レベルの決定に基づいて、手術治療後に前立腺癌または前立腺腫瘍が再発する危険性を予測する方法であって、
    前立腺癌または前立腺腫瘍を有する対象から取得した前立腺組織試料を提供するステップ、
    前記前立腺組織試料内でのＰＩＴＸ２遺伝子内の１つ以上のＣｐＧ配列のメチル化レベルを決定するステップであって、前記ＰＩＴＸ２遺伝子のメチル化レベルが提供されるステップ、及び、
    手術治療後に前立腺癌または前立腺腫瘍が再発する危険性を予測するステップ
    を含み、
    臓器限局前立腺癌の患者群の中央値よりも低い前記ＰＩＴＸ２遺伝子の低メチル化が、前記対象の癌が再発する危険性が、前記中央値よりも高いメチル化レベルを有する患者と比較して低いことを示す、方法。
  2. 前記対象のノモグラム、ＰＳＡ値およびグリーソンスコアの少なくとも１つを決定するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記メチル化レベルに基づいて、前記対象に適切な手術後アジュバント処置を決定するために有用な情報を提供するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記前立腺癌または前立腺腫瘍がＴ２前立腺癌である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記前立腺癌または前立腺腫瘍がグリーソンスコア８以上を有する前立腺癌である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  6. 前記対象から得た前立腺組織試料から分離したゲノムＤＮＡを、前記ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内で、メチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを識別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬に接触させるステップを含み、前記標的領域は、ＰＩＴＸ２遺伝子の少なくとも１６の隣接するヌクレオチドの配列を備えるか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記隣接するヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を備える、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
ES2533767T3 (es) * 2005-04-15 2015-04-15 Epigenomics Ag Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares
WO2007039128A1 (en) * 2005-09-21 2007-04-12 Epigenomics Ag Markers for the prediction of outcome of anthracycline treatment
WO2007039291A2 (en) * 2005-10-03 2007-04-12 Epigenomics Ag Methods, apparatus and nomograms to determine prostate cancer progression
EP1943356B1 (en) * 2005-10-03 2014-05-14 Epigenomics AG Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression associated with the prognosis of cell proliferative disorders
US7770717B2 (en) * 2005-10-12 2010-08-10 Scanvaegt International A/S Device for transfer of items
US20090275021A1 (en) * 2005-11-27 2009-11-05 Osnat Sella-Tavor Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis
GB0625321D0 (en) * 2006-12-19 2007-01-24 Univ Surrey Cancer biomarker
US20090062645A1 (en) * 2007-09-03 2009-03-05 Jens Fehre Method for diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2009065511A2 (en) * 2007-11-23 2009-05-28 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression associated with the development of prostate cell proliferative disorders
EP2302069A1 (en) * 2007-12-11 2011-03-30 Epigenomics AG Methods and nucleic acids for analyses of cell proliferative disorders
JP5513375B2 (ja) * 2008-05-07 2014-06-04 北海道公立大学法人 札幌医科大学 癌の検出方法および検出用キット、ならびに癌治療剤
US9315802B2 (en) 2009-12-30 2016-04-19 Quest Diagnostics Investments Incorporated RNA isolation from soluble urine fractions
DE102010028105A1 (de) * 2010-04-22 2011-10-27 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren, Vorrichtung und Gerätesystem für die Therapie von Prostatakrebs
US9663781B2 (en) 2010-12-30 2017-05-30 Quest Diagnostics Investments Incorporated Diagnosis of prostate cancer
ES2593959T3 (es) * 2011-04-19 2016-12-14 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Marcadores del cáncer de próstata
US9598735B2 (en) * 2012-11-14 2017-03-21 JBS Science Inc. Detection of a panel of urine DNA markers for HCC screening and disease management
KR101467289B1 (ko) * 2013-01-22 2014-12-02 한국원자력의학원 Ｗｄｆｙ3를 측정하는 제제를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물 및 이의 용도
US20150010518A1 (en) * 2013-07-03 2015-01-08 The University Of British Columbia Nr2e1 mini-promoters
WO2015023285A1 (en) * 2013-08-15 2015-02-19 Xia Xueliang James Biomarkers for use in colorectal cancer
JP6427750B2 (ja) * 2013-10-02 2018-11-28 コニカミノルタ株式会社 Ｃｘｃｌ１、ならびにｓｍｏｘおよび／またはｉｄ１の発現量に基づく肺癌患者の予後を判定するためのデータ収集方法およびキット
GB2524948A (en) * 2014-03-07 2015-10-14 Oxford Gene Technology Operations Ltd Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
GB201404998D0 (en) * 2014-03-20 2014-05-07 Univ Birmingham Atrial fibrillation therapy
EP3037545A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-29 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of the Holy & Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin A DNA-methylation test for prostate cancer
EP3246415A1 (en) * 2016-05-18 2017-11-22 Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias - CIC bioGUNE Methods for the prognosis of prostate cancer
US11901083B1 (en) 2021-11-30 2024-02-13 Vignet Incorporated Using genetic and phenotypic data sets for drug discovery clinical trials
US11705230B1 (en) 2021-11-30 2023-07-18 Vignet Incorporated Assessing health risks using genetic, epigenetic, and phenotypic data sources
CN114015771A (zh) * 2022-01-05 2022-02-08 北京华诺奥美基因医学检验实验室有限公司 一种snrpn父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585481A (en) * 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5457183A (en) * 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5245022A (en) * 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5574142A (en) * 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
SE501439C2 (sv) 1993-06-22 1995-02-13 Pharmacia Lkb Biotech Sätt och anordning för analys av polynukleotidsekvenser
EP1352956A1 (en) 1993-11-30 2003-10-15 McGILL UNIVERSITY Inhibition of DNA methyltransferase
US5597696A (en) * 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5514758A (en) 1994-09-30 1996-05-07 The Goodyear Tire & Rubber Company Process for making latex for high performance masking tape
US5786146A (en) * 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
US6017704A (en) 1996-06-03 2000-01-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
US6251594B1 (en) 1997-06-09 2001-06-26 Usc/Norris Comprehensive Cancer Ctr. Cancer diagnostic method based upon DNA methylation differences
DE19754482A1 (de) 1997-11-27 1999-07-01 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Herstellung komplexer DNA-Methylierungs-Fingerabdrücke
US7700324B1 (en) 1998-11-03 2010-04-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methylated CpG island amplification (MCA)
US5958773A (en) 1998-12-17 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of AKT-1 expression
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
US6783933B1 (en) * 1999-09-15 2004-08-31 The Johns Hopkins University School Of Medicine CACNA1G polynucleotide, polypeptide and methods of use therefor
AU2002214576A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Genes related to development of refractory prostate cancer
ATE325894T1 (de) * 2001-03-01 2006-06-15 Epigenomics Ag Verfahren und rechnerprogrammprodukte zur erfassung der biologischen wirkung und/oder aktivität von arzneimitteln, chemischen substanzen und/oder pharmazeuitschen verbindungen auf der basis ihrer effekte auf den methylierungszustand der dna
DE60232059D1 (de) * 2001-03-01 2009-06-04 Epigenomics Ag Verfahren zur entwicklung von gensätzen zu diagnostischen und therapeutischen zwecken auf grundlage des expressions- und methylierungsstatus der gene
EP1410304A2 (en) * 2001-03-26 2004-04-21 Epigenomics AG Method for epigenetic feature selection
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US8101359B2 (en) * 2002-10-01 2012-01-24 Epigenomics Ag Method for determining risk of relapse of breast cancer following tamoxifen adjuvant therapy
US20060024684A1 (en) * 2002-10-01 2006-02-02 Epigenomics Ag Prognostic markers for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients
SE524468C2 (sv) * 2002-12-09 2004-08-10 Axlon Int Ab Anordning och metod för sortering av mynt
US20040146868A1 (en) * 2003-01-24 2004-07-29 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for the analysis of CpG dinucleotide methylation status associated with the development of peripheral zone prostate cancer
CA2548528A1 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression associated with the development of prostate cell proliferative disorders
JP2007513621A (ja) 2003-12-11 2007-05-31 エピゲノミクス アーゲー 乳房細胞増殖性障害の改良された処置のための方法および核酸
PL1826279T3 (pl) * 2006-02-28 2011-11-30 Univ Berlin Charite Wykrywanie i kontrola jakości regulatorowych limfocytów T dzięki analizie metylacji DNA genu FoxP3

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