CN114015771A

CN114015771A - 一种snrpn父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法

Info

Publication number: CN114015771A
Application number: CN202210002485.2A
Authority: CN
Inventors: 于超计; 吴文立; 王倩玉; 肖江山; 魏星
Original assignee: Beijing Huanuo Aomei Gene Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Beijing Huanuo Aomei Gene Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-02-08

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种SNRPN父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法。本方案通过设计了SNRPN位点检测的引物组，及该引物组制成的试剂盒，能够快速、准确且灵敏地检测出小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷），填补临床检测空白，从常染色体基因突变层面辅助找出造成小胖威利综合征的原因；实验结果重复性好，精密度高。最快能在90分钟内完成检测，节约检测时间，加快检测效率。检测仪器仅依赖普通PCR仪，临床推广性高。当父源性小胖威利综合征中SNRPN缺失（或功能缺陷）时，患儿即表现出小胖威利的表型，针对此突变的检测对于优生优育有着重大意义。

Description

一种SNRPN父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种SNRPN父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法。

背景技术

小胖威利综合征，正式医学名为普拉德-威利综合征（英文Prader-WilliSyndrome，简称PWS），因来自父亲的第15号染色体长臂（位置15q11-q13）基因突变导致的先天性终身性疾病，非孟德尔遗传的表观遗传性罕见疾病，是多系统化异常的复杂综合征。

小胖威利以肌张力低、生长发育迟缓、智能障碍、多食、肥胖及性腺功能减退为主要临床特征。因下视丘功能障碍，患者无饱腹感，长期的强烈饥饿感导致过度摄食造成威胁生命的肥胖。目前尚无办法根治，终身需在监管下生活。发病无种族和性别差异，国内发病率不明，预计中国5-10万患者，每年新增1500-4500例（按照国外发病率1/12000至1/15000估算）。

目前有关研究显示小胖威利综合征中存在SNRPN、NDN、MAGEL2、MKRN3和Cl5orf 2印记基因，它们仅存在于父源15号染色体的等位基因上。SNRPN位于印迹中心区域，可编码5种snoRNAs，被认为与小胖威利表型有密切关系，也是最可靠的诊断位点，可检出绝大多数小胖威利，并可用于产前诊断。正常人母源性小胖威利综合征中SNRPN的CpG岛高度甲基化，而父源SNRPN的CpG岛未甲基化，因此母源性基因失活，而父源性SNRPN基因有表达（遗传印记）。当父源性小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）时，患儿即表现出小胖威利的表型。

小胖威利的致病原因及遗传机制非常特殊且复杂，绝大多数病例为新的突变，即父母亲皆正常，仅有极少数为遗传。大部分可归因于在卵子(精子)或胚胎形成阶段产生的基因错误，也就是在15号染色体长臂上有10多个基因被遗漏或抑制。

小胖威利的病因肇因于第15号染色体印迹基因区的基因缺陷，且此基因缺陷来自父亲，或同时拥有两条来自母亲的带有此缺陷的第15号染色体，若此基因缺陷来自母亲，则会造成Angelman syndrome(天使人综合征)。

目前小胖威利综合征的辅助诊断方法有：（1）高分辨率染色体分析（HRB）；（2）荧光原位杂交法（FISH）；（3）甲基化-特异性聚合酶链反应（MS-PCR）；（4）甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增法（MS-MLPA）；（5）染色体微阵列分析（CMA）又称“分子核型分析”。此外，还可使用全外显子测序(父源缺失、突变)、微卫星标记、全基因组SNP微阵列芯片、Southern印迹杂交、DNA甲基化(MSP)、Affymetrix CytoScan芯片。《Parent-of-Origin Testing for15q11-q13 Gains by Quantitative DNA Methylation Analysis》公开的技术也是需要依赖荧光定量PCR仪器。这些检测方法要么依赖于特定的检测设备，如荧光定量PCR仪器、荧光显微镜、一代测序仪等；要么，具有操作复杂、技术要求高。

核酸胶体金免疫层析技术是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上形成U线、M线和C线，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上。待测样本通过常规的核酸提取后，采用5′端带有特定标记的引物进行PCR扩增，之后将扩增产物直接添加到试纸条一端的样本垫上后，扩增产物通过毛细作用向前移动，在结合垫上与胶体金标记试剂相互作用，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，形成肉眼可观察的显色结果。该方法已广泛应用于抗原抗体检测，但在核酸检测领域还鲜有使用。

目前还缺乏专门用于15q11~13区域异常的操作简便、不依赖于特定检测设备的试剂盒。

发明内容

为了解决现有技术存在的现有小胖威利综合征的辅助诊断方法繁杂且检测要求高、对于特定的检测设备具有依赖性，不具有便利性和实时检测的功能；缺乏专门用于15q11~13区域异常检测的试剂盒的技术问题，本发明目的在于提供一种SNRPN父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法。

本发明所采用的技术方案为：一种SNRPN父源缺失的检测引物组，所述引物组为SNRPN位点的引物组；

所述SNRPN位点引物组包括非甲基化引物组和甲基化引物组；

所述非甲基化引物组包括第一引物和第二引物；

所述第一引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1：

5′-TGTGGTAAATAAGTATGTTTGTGTGGTT-3′；

所述第二引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2：

5′-ACTACAACAACAACAAACTTCACAC-3′；

所述甲基化引物组包括第三引物和第四引物；

所述第三引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3：

5′- GTAAATAAGTACGTTTGCGCGGTC-3′；

所述第四引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4 ：

5′- CTACAACAACGACAAACTTCGCAC-3′。

作为优选地，所述第一引物和第三引物5′端均标记生物素。

作为优选地，所述第二引物5′端标记TAMARA；第四引物5′端标记Dig（Digoxigenin）。

一种SNRPN父源缺失的检测试剂盒，所述试剂盒包括含有权利要求1所述SNRPN位点引物组的检测液。

作为优选地，所述试剂盒还包括扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和层析条。

作为优选地，所述扩增反应液包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及各种PCR扩增反应液离子。

作为优选地，所述阳性对照品为SNRPN父源缺失或功能缺陷的细胞系DNA；

所述阴性对照品为SNRPN正常的血液DNA。

作为优选地，所述层析条为包被胶体金颗粒和抗体的层析试纸。

一种SNRPN父源缺失的非诊断目的检测方法，采用SNRPN父源缺失的试剂盒进行检测。

本发明的有益效果为：

本发明旨在建立一种利用胶体金免疫层析技术简便、快速、准确检测人染色体小胖威利综合征中异常情况引物组及试剂盒。

（一）检测位点精准：本发明选取并提供了小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）荧胶体金层析检测的引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法，能够快速、准确且灵敏地检测出小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）。

（二）填补临床空白：目前国内医疗市场上并没有检测小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）的试剂盒，本试剂盒填补了临床检测小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）的空白，为相关疾病后续的治疗提供的及时的预判。

（三）针对性检测：造成小胖威利综合征的原因尚不明确，可能与下丘脑部功能紊乱或新陈代谢障碍有关。本发明可以从常染色体基因突变层面上辅助找出造成小胖威利综合征的原因，从而辅助医师做出判断，医生进行针对性治疗：包括内分泌科、新生儿科、口腔科、骨科、眼科、神经内科、血液科、外科、康复科、理疗科、营养科及心理学等在内的多学科参与的综合管理模式，根据不同年龄段患儿的表型特征，针对不同的内分泌代谢紊乱及相关问题进行有效干预。

（四）加快临床诊断效率：实验结果重复性好，精密度高。本发明检测时间周期短，最快能在90分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率。

（五）操作简单：本方法仅需操作者将扩增反应液、检测液和模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于普通PCR仪器，层析结果可用肉眼判读，对操作人员的要求极其简单，临床可推广性高。

（六）优生优育：当父源性小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）时，患儿即表现出小胖威利的表型，所以针对此突变的检测对于优生优育有着重大意义。

附图说明

图1为实验例阳性检测结果示意图；

图2为实验例阴性检测结果示意图；

图3为PCR-核酸胶体金免疫层析技术流程图。

图中：Z-质控；J-甲基化；FJ-非甲基化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

1、小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）核酸检测试剂盒（胶体金层析法）

本试剂盒通过将采集的离体血液样本经常规方法提取核酸后，在taq DNA聚合酶的作用下，使用taqman探针，利用胶体金金标信号实现小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）的核酸检测。本试剂盒PCR过程采用一步法进行，操作简单快捷，对操作人员素质的要求也较低。

本发明建立了一种利用胶体金层析技术简便、快速、准确、高通量检测人小胖威利综合征中SNRPN位点引物及试剂盒，从而为小胖威利综合征中SNRPN父源缺失（或功能缺陷）的检测提供参考依据，试剂盒保存于-20 ℃。试剂盒规格：50人份/盒，具体组分见表1。

2.试剂盒性能验证

2.1 样本处理

选用企业参考品进行试剂盒性能验证。所有样本按照美基生物核酸提取试剂盒（产品编号：IVD4173）进行DNA提取，所得DNA样本保存于2-8℃；若样本长时间不适用可保存于-20℃。

2.2 PCR扩增

。

将配置好的PCR扩增反应液按20 μL每个反应空进行分装。将已提取好的样品DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5 μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。

2.3 扩增程序：

95℃ 3min (1个循环)；

95℃ 15 sec，58℃ 30 sec，72℃ 30 sec；(35个循环)，

72℃ 5 min(1个循环)，

4℃（∞）。

使用常规PCR仪进行扩增即可。

2.5试剂盒性能：

2.5.1 阳性符合率100%：对企业参考品的阳性（表2）样本进行检测，结果均为阳性，阳性符合率为 100%。

2.5.3 重复性：检测20ng/µL的P1和P2，各重复检测10次，均为阳性。

2.5.4 最低检出限：本试剂盒最低检测限为5ng/µL。

本试剂盒对稀释至不低于5ng/µL的P1和P2，检测结果均为阳性。

3、实验例：对50份临床样本检测

3.1 样本处理

采集10名小胖威利患者及40名健康人受检者血液标本。

样本采集要点：采用紫色头盖管(含有乙二胺四乙酸以及其盐的采血管)采集静脉血，采集后4℃保存备用。

每份样本取200 µL，按照美基生物核酸提取试剂盒（产品编号：IVD4173）进行核酸提取DNA待用。

3.2 PCR扩增

。

将配置好的PCR扩增反应液液按20 μL每个反应空进行分装。将已处理样本DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5 μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。

3.3 扩增程序：

95℃ 3min (1个循环)；

95℃ 15 sec，58℃ 30 sec，72℃ 30 sec；(35个循环)，

72℃ 5 min(1个循环)，

4℃（∞）。

实验结果：最终试剂盒检测结果显示其中7例阳性，43例阴性。

如图1所示，为经试剂盒检测后的阳性检测结果图：附图表明只有质控Z、甲基化J存在。

如图2所示，为经试剂盒检测后的阴性检测结果图：附图表明质控Z、甲基化J和非甲基化FJ 同时存在。

如图3所示，为PCR-核酸胶体金免疫层析技术流程图。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 北京华诺奥美基因医学检验实验室有限公司

<120> 一种SNRPN父源缺失的检测引物组、试剂盒及非诊断目的的检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<223> SNRPN U-F1（第一引物） 5′端标记生物素

<400> 1

tgtggtaaat aagtatgttt gtgtggtt 28

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> SNRPN U-R1（第二引物） 5′端标记TAMARA

<400> 2

actacaacaa caacaaactt cacac 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> SNRPN M-F2（第三引物） 5’端标记生物素

<400> 3

gtaaataagt acgtttgcgc ggtc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> SNRPN M-R2（第四引物） 5’端标记DIG

<400> 4

ctacaacaac gacaaacttc gcac 24

<210> 5

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(666)

<223> 15q11-q13区域SNRPN基因核苷酸序列（父源）

<400> 5

gagggagttg ggatttttgt attgtggtaa ataagtatgt ttgtgtggtt gtagaggtag 60

gttggtgtgt atgtttaggt ggggatgtgt gtgaagtttg ttgttgttgt agtgagtttg 120

gtgtagagtg gagtggttgt tggagatgtt tgatgtattt gtttgaggag tggttagtga 180

tgtgatggag tgggtaaggt tagttgtgtt ggtggttttt tttaagagat agtttgggga 240

gtggttattt ttatttatta gatattttaa gtttttagga tttggagtat tgaataaatg 300

gaatttgggt tttaaagttt tttgttttgg agaattagat ttggaatgtt tagaggtttg 360

ttgttgtgtt gttttgtttt gatggtattt tgtttgtttg tattggggtg tgttttttat 420

ttgtttttaa ttgtggtgtt gtgataggtt ttattgtggg tgtttgtggt gggaagggtg 480

gtggtgattg ggagtatgtg gggtaattgt agtgggtaag ggatatgggt ggaggtgggt 540

atattagggt gattgtagtt ttgtgtggtg agggtatgtg gggggattag tgtataggga 600

ttttaggtgg aggtaggtat attggagtga ttgtggtggg gtgaaggtat gtgaagtgat 660

tggtat 666

<210> 6

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(666)

<223> 15q11-q13区域SNRPN基因核苷酸序列（母源）

<400> 6

gagggagttg ggatttttgt attgcggtaa ataagtacgt ttgcgcggtc gtagaggtag 60

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tcgtttttaa ttgtggtgtc gcgataggtt ttattgcggg tgtttgcggt gggaagggcg 480

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atattagggt gattgtagtt tcgtgtggcg agggtacgtg gggggattag tgtataggga 600

ttttaggcgg aggtaggtat attggagtga ttgtggcggg gcgaaggtac gtgaagtgat 660

cggtat 666

Claims

1.一种SNRPN父源缺失的检测引物组，其特征在于，所述引物组为SNRPN位点的引物组；

所述SNRPN位点引物组包括非甲基化引物组和甲基化引物组；

所述非甲基化引物组包括第一引物和第二引物；

所述第一引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1：

5′-TGTGGTAAATAAGTATGTTTGTGTGGTT-3′；

所述第二引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2：

5′-ACTACAACAACAACAAACTTCACAC-3′；

所述甲基化引物组包括第三引物和第四引物；

所述第三引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3：

5′- GTAAATAAGTACGTTTGCGCGGTC-3′；

所述第四引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4 ：

5′- CTACAACAACGACAAACTTCGCAC-3′。

2.根据权利要求1所述的SNRPN父源缺失的检测引物组，其特征在于，所述第一引物和第三引物的5′端均标记生物素。

3.根据权利要求1所述的SNRPN父源缺失的检测引物组，其特征在于，所述第二引物5′端标记TAMARA；第四引物5′端标记Dig。

4.一种SNRPN父源缺失的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有权利要求1所述SNRPN位点引物组的检测液。

5.根据权利要求4所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和层析条。

6.根据权利要求5所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及各种PCR扩增反应液离子。

7.根据权利要求5所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为SNRPN父源缺失或功能缺陷的细胞系DNA；

所述阴性对照品为SNRPN正常的血液DNA。

8.根据权利要求5所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒，其特征在于，所述层析条为包被胶体金颗粒和抗体的层析试纸。

9.一种SNRPN父源缺失的非诊断目的检测方法，其特征在于，采用权利要求4-8中任一项所述SNRPN父源缺失的试剂盒进行检测。