CN115851957A - 一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点标志物及其应用 - Google Patents
一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程和肿瘤学领域，公开了一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点标志物及其应用。该甲基化位点标志物是肺腺癌相关的甲基化位点chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294的组合。该甲基化位点标志物的特异性扩增引物可以用于制备肺腺癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程和肿瘤学领域，涉及一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点标志物及其应用。
背景技术
肺癌是全球第二大常见的癌症，也是中国发病率最高的癌症。由于缺乏有效的早期诊断工具，肺癌患者确诊时大多是癌症晚期。目前，全球大多数国家肺癌患者的5年生存率仅为10％-20％。在中国，2012-2015年男性肺癌5年生存率为16.8％，女性肺癌5年生存率为25.1％，整体预后仍然较差。肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)是最常见的肺癌组织学亚型，其复杂的分子机制和肿瘤异质性为肺腺癌的早诊早治研究带来了巨大挑战。
表观遗传异常几乎存在于所有的癌症类型中，其中DNA甲基化是研究最深入的表观基因组变化之一。据研究报道，癌症中启动子高甲基化发生的频率可能与编码区突变相同，甚至更多，通常与关键肿瘤抑制基因(Tumor suppressor gene，TSG)的异常沉默有关。已知近一半通过生殖系突变诱发家族性癌症的肿瘤抑制基因在散发性癌症中发生甲基化相关的功能性失活。全基因组低甲基化是癌症中另一常见的表观遗传特征，常被当作是癌症中高甲基化的伴随现象而被忽视了促癌潜力。随着癌症表观遗传组学的深入研究，人们发现癌症中DNA甲基化的丢失并不是继发事件，全局或者局部的DNA低甲基化与早期癌变或肿瘤进展关系密切。有研究报道，全基因组低甲基化有利于重复序列的有丝分裂重组，导致染色体不稳定，诱发基因突变；此外，在癌前病变进展到癌的过程中，全基因组DNA甲基化水平不断降低。目前，肿瘤DNA甲基化研究以甲基化芯片为主，且已观察到多个关键基因由于启动子区域异常高甲基化而表达沉默。由于DNA甲基化测序技术和成本的限制，癌症中DNA甲基化全局性丢失方面的研究一直被忽视，这导致我们对肿瘤中低甲基化相关的基因组区域及其功能机制都了解有限。
越来越多的证据证明，癌症中遗传和表观遗传机制并不是独立的事件，两者可在有丝分裂中遗传并相互影响，导致基因表达异常，促进癌症的发生和进展。研究发现核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位点显著富集在胚胎干细胞的“功能增强子”区域，可通过改变染色质可及性和转录因子结合赋予个体癌症易感性，导致基因表达差异。
在癌症生物学中，直接或间接为癌细胞提供选择性生长优势的基因突变被称为“驱动突变”，这些突变通过激活癌基因(Oncogene)和/或抑制肿瘤抑制基因(TSG)表达，使癌细胞逃脱细胞分裂的正常检查点并促进肿瘤生长。但并非所有的肿瘤都存在关键性驱动突变，当突变不足以驱动癌细胞恶性转化时，表观遗传改变可能才是癌症驱动事件的潜在贡献者。表观遗传改变作为癌症“驱动因素”已受到广泛认可，但由于缺乏DNA甲基化、基因组和转录组数据的整合，表观遗传因素、遗传因素对癌症基因转录调控目前还未得到系统性评估。
综上，癌症全基因组DNA甲基化研究主要集中在启动子高甲基化方面，基因体和/或CpG岛外等区域的DNA甲基化变化及其功能潜力尚未得到重视。DNA甲基化异常是否参与了癌症易感区域的功能机制也未能得到系统性评估。此外，癌症中DNA甲基化是否与遗传因素联合影响基因转录调控，驱动癌症表型等尚缺乏系统评价。
目前，还没有将甲基化应用于肺腺癌癌辅助诊断的报道，若能找出与肺腺癌相关的甲基化特征以及受甲基化影响的肺腺癌相关基因，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肺腺癌的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述问题，提出一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点标志物。
本发明的第二个目的是提供上述扩增上述甲基化位点的特异性引物组合。
本发明的第三个目的是提供上述特异性引物组合在制备肺腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供肺腺癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过研究肺腺癌患者癌和癌旁组织的甲基化数据，寻找一组与肺腺癌发病风险高度相关的高特异性和高敏感性的甲基化位点，并研制出可用于临床应用的肺腺癌辅助诊断试剂盒，为肺腺癌的早期辅助诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种用于肺腺癌辅助诊断相关的甲基化位点标志物。该甲基化位点标志物是肺腺癌相关的甲基化位点chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294的组合。
所述的甲基化位点标志物的特异性扩增引物，这些引物为：
chr5:37112010的引物序列为：5‘-AGTAGATGATAGGAATGTAT(SEQ ID NO：1),3’-CTTTCAATCTCACTTTTTCT(SEQ ID NO：2)；
chr16:62875877的引物序列为：5‘-AGGATATGAATATAGGAAGAA(SEQ ID NO：3),3’-CAAATCTACTTTATCTACTAAT(SEQ ID NO：4)；
chr6:50682050的引物序列为：5‘-TAGAAATATTTGTTATAATGAG(SEQ ID NO：5),3’-TCCCCCCTTTTATTATTAAA(SEQ ID NO：6)；
chr13:31613633的引物序列为：5‘-TTTATTTGTGGTTTGTGGTT(SEQ ID NO：7),3’-TCTCTCCTTTTTTACTCTCATTT(SEQ ID NO：8)；
chr2:43521317的引物序列为：5‘-TTTTTTTGTTAAGTTTTATGGTT(SEQ ID NO：9),3’-ACTCCTAACACATAATAAAC(SEQ ID NO：10)；
chr6:166411604的引物序列为：5‘-GTGTAATTTTTGAGTGTAGA(SEQ ID NO：11),3’-CATTCTTCCTTTTCAACCTTTA(SEQ ID NO：12)；
chr5:37111954的引物序列为：5‘-TGTTATTGAAAGTTTTATGTT(SEQ ID NO：13),3’-CTTTCAATCTCACTTTTTCT(SEQ ID NO：14)；
chr6:50682024的引物序列为：5‘-TTATAATTTGTTTTTYGGGGGA(SEQ ID NO：15),3’-RTCTCTATCTCTTTCTCTTCACT(SEQ ID NO：16)；
chr10:130992603的引物序列为：5‘-TTATAATTTGTTTTTYGGGGGA(SEQ ID NO：17),3’-RTCTCTATCTCTTTCTCTTCACT(SEQ ID NO：18)；
chr2:126776294的引物序列为：5‘-GTTTGGGTTAGTTTATTAGT(SEQ ID NO：19),3’-CAAAATATATATACACACAACA(SEQ ID NO：20)。
(Y代表C/T，R代表A/G)
所述的甲基化位点标志物在制备肺腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种分腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294的甲基化程度。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述甲基化位点标志物的特异性扩增引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的甲基化位点标志物的特异性扩增引物，这些引物为：
chr5:37112010的引物序列为：5‘-AGTAGATGATAGGAATGTAT(SEQ ID NO：1),3’-CTTTCAATCTCACTTTTTCT(SEQ ID NO：2)；
chr16:62875877的引物序列为：5‘-AGGATATGAATATAGGAAGAA(SEQ ID NO：3),3’-CAAATCTACTTTATCTACTAAT(SEQ ID NO：4)；
chr6:50682050的引物序列为：5‘-TAGAAATATTTGTTATAATGAG(SEQ ID NO：5),3’-TCCCCCCTTTTATTATTAAA(SEQ ID NO：6)；
chr13:31613633的引物序列为：5‘-TTTATTTGTGGTTTGTGGTT(SEQ ID NO：7),3’-TCTCTCCTTTTTTACTCTCATTT(SEQ ID NO：8)；
chr2:43521317的引物序列为：5‘-TTTTTTTGTTAAGTTTTATGGTT(SEQ ID NO：9),3’-ACTCCTAACACATAATAAAC(SEQ ID NO：10)；
chr6:166411604的引物序列为：5‘-GTGTAATTTTTGAGTGTAGA(SEQ ID NO：11),3’-CATTCTTCCTTTTCAACCTTTA(SEQ ID NO：12)；
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chr6:50682024的引物序列为：5‘-TTATAATTTGTTTTTYGGGGGA(SEQ ID NO：15),3’-RTCTCTATCTCTTTCTCTTCACT(SEQ ID NO：16)；
chr10:130992603的引物序列为：5‘-TTATAATTTGTTTTTYGGGGGA(SEQ ID NO：17),3’-RTCTCTATCTCTTTCTCTTCACT(SEQ ID NO：18)；
chr2:126776294的引物序列为：5‘-GTTTGGGTTAGTTTATTAGT(SEQ ID NO：19),3’-CAAAATATATATACACACAACA(SEQ ID NO：20)。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括以下任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂，所述甲基化检测方法包括:全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应(甲基化特异性PCR,Methylation-Specific PCR,MS-PCR)、亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined BisulfiteRestriction Analysis，COBRA)、数字聚合酶链式反应、限制性界标基因组扫描、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、甲基化图谱分析(Methylation Profiling)、甲基化芯片中一种或多种方法所使用的试剂。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括处理样品的试剂。
所述处理可以包括提取DNA的步骤、使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤。
所述使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤所使用的试剂最常见的是亚硫酸氢盐试剂。
所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液。
所述DNA的提取试剂可以包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。
所述裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。
所述结合缓冲液包括蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。
所述pH缓冲剂包括Tris、硼酸、磷酸盐、和MES中的一种或多种。
所述核酸酶抑制剂包括EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。
所述清洗缓冲液包括Tris、硼酸、山梨醇、聚乙二醇和巯基乙醇中的一种或多种；
所述洗脱缓冲液包括NaCl、Tris-HCl和EDTA中的一种或多种。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：
(1)建立统一标准的标本库和数据库:以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
(2)重亚硫酸盐全基因组测序：选择肺腺癌癌与癌旁组织，利用重亚硫酸盐全基因组测序，在全基因组范围内找出与癌与癌旁差异甲基化位点。
(3)肺腺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据肺腺癌和癌旁中筛选的显著差异的甲基化位点用于肺腺癌辅助诊断的试剂盒。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为肺腺癌的患者。
(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗；
本研究共采用54例符合标准的样本进行研究。
2.QIAamp DNAKit提取组织样本基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Illumina HiSeq X Ten平台全基因组甲基化检测
(1)提取组织DNA：使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行提取提取组织DNA。
(2)片段化处理：加入约100ng 1％外源性的噬菌体DNA，1.25μL FragmentBuffer，2.5μLEnzyme，加入ddH2O至12.5μL，4℃加热1min，37℃加热14min，4℃静置。以将DNA打断成200-300bp片段。
(3)末端修复和添加A尾；取DNA12.5μL加入ER-AT buffer 1.75μL，ER-ATEnzyme0.75μL，20℃加热30min，65℃加热30min，4℃静置。
(4)DNA连接：使用KAPA DNA HyperPlus试剂盒。取DNA15μL，加入LigationBuffer7.5μL，Enzyme 2.5μL，Methy-Adapter 1μL，加入ddH2O至27.5μL。20℃加热4h或4℃过夜保存。
(5)片段纯化：DNA beads室温平衡0.5h后，加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系(27.5×0.8)混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，弃尽上清。接着加入200μL 80％乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠，磁力架上静置，弃上清，重复此步骤一次。加入12μL EB洗脱，磁力架上转移上清液至新的PCR管。
(6)重亚硫酸盐转化：使用EZ DNA Methylation-LightningTMKit(D5030T)试剂盒对DNA进行亚硫酸盐转化。试剂盒使用前需要将24mL 100％乙醇添加到6mL M-Wash缓冲液浓缩液中制备M-Wash缓冲液。
(7)PCR扩增：采用KAPA HIFI HotStartReadyMix(2802)进行高效PCR反应。加入DNA15μL，Index11μL，Index21μL。将两份混合共34μL。先98℃加热45s，循环以下操作十次：98℃加热15s，65℃加热30s，72℃加热30s。循环操作结束后72℃加热1min，4℃静置。
(8)片段纯化：DNA beads室温平衡0.5h后，加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系(34×0.8)混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，弃尽上清；加入200μL 80％乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠，磁力架上静置，弃上清，重复此步骤一次；16μL EB洗脱，磁力架上转移上清液至新的PCR管，测定浓度。
(9)片段筛选：DNA beads室温平衡0.5h后，加入0.55×上步骤反应体系体积的beads到上步骤完成体系(16×0.8)混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，将上清液转移至新的PCR管中。向管内加入0.15×DNA beads，混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，弃上清。16μL EB洗脱，磁力架上转移上清液至新的PCR管，测定浓度。
(10)上机测序：上述制备WGBS文库通过Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台进行全基因组测序。
4.统计分析方法
使用t检验比较癌与癌旁组织的全局、基因元件区域的甲基化水平差异。对差异甲基化位点进行主成分分析，使用超几何分布检验进行富集分析。
DNA甲基化差异分析通过R统计软件进行。使用的bsseq包对亚硫酸氢盐测序数据进行平滑处理，由于WGBS数据的高CpG覆盖率，我们对最小总宽度为1kb，最少包含70个CpG位点的窗口进行平滑。使用DSS包进行配对差异甲基化分析。DSS基于离散收缩法和Wald统计检验，在没有生物重复的情况下也可以实现了差异甲基化位点/区域的计算。本研究中，差异甲基化位点(Differently methylated locus，DML)定义为P值小于1×10-5的差异位点，差异甲基化区域(Differently methylated region，DMR)确定为以P值小于0.01的差异位点结合形成最小宽度为300bp，至少包含10个CpG位点的区域。基于年龄、性别、吸烟状态和癌症分期等基线特征，将研究对象进行亚组分析，差异甲基化分析策略与前述保持一致。
为了进一步研究这10个甲基化位点构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个甲基化位点与肺腺癌发病的关联情况和关联强度。具体来说，我们综合考虑每个甲基化位点的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的算法如下：危险分值＝
(2.450457262×chr5:37112010+13.24831614×chr16:62875877+58.90249185×chr6:50682050+396.5795458×chr13:31613633+523.1826831×chr2:43521317+148.0719384×chr6:166411604+9.140061203×chr5:37111954+11.60692533×chr6:50682024+64.17459782×chr10:130992603+58.16708958×chr2:126776294)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于甲基化关联分析研究的54对样本中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(R语言，v4.0.2)。统计学显著性水平设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
5.诊断试剂盒制备方法
Illumina HiSeq X Ten平台进行全基因组甲基化测序，在甲基化差异分析后确定肺腺癌与癌旁中显著的差异甲基化位点作为肺腺癌诊断的指标。最后筛选出的与肺腺癌发病有关的差异甲基化位点用于制作辅助诊断试剂盒(chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294)。诊断试剂可以包括这些甲基化位点的特异性引物，以及DNA提取和重亚硫酸盐转化等试剂，这些物质可以全部装配在一个试剂盒中，也可以分散在一系列试剂盒中组合使用。
以下是本发明进一步的说明：
在上述54对符合条件的肺腺癌和癌组织中，我们将这两组人群使用IlluminaHiSeq XTen重亚硫酸盐全基因组甲基化测序获得相关结果。
根据Illumina HiSeq X Ten全基因组甲基化检测，本发明人检测到在“癌组织”组和“癌旁”组中甲基化表达存在差异的位点包括:chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603、chr2:126776294等2.60×107个差异甲基化位点。
选取差异最显著的前10个差异甲基化位点的组合用于肺腺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于肺腺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述甲基化位点的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这10个甲基化位点的组合，或者这10个甲基化位点的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于肺腺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点及其应用的优点在于：
(1)DNA甲基化是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。肺癌人群甲基化特征的发现有利于临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案。
(2)甲基化试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，有助于反映不同受试者甲基化水平，结合受试者的基因型数据和转录组数据可以迅速判断受试者的肿瘤发病是对之前肺癌辅助诊断的强有力补充。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人采用重亚硫酸盐全基因组测序技术直接测量甲基化DNA序列进一步分析获取疾病相关的甲基化图谱；以上方法和策略的应用加速和保证了DNA甲基化和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过研究肺腺癌癌与癌旁组织的甲基化数据，寻求可用于肺腺癌检测的甲基化相关标志物。因此，本发明获得了肺癌甲基化数据库和受甲基化影响的相关基因；通过肺腺癌辅助诊断的受甲基化影响的相关癌基因和应用，促进肺癌甲基化相关研究结果的临床转化和不同实验室间研究结果的比较，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1:显示全基因组甲基化关联研究癌与癌旁的的ROC曲线。
显示肺腺癌癌组对癌旁组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为肺腺癌的患者。
(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗；
本研究共采用54例符合标准的样本进行研究。
3.QIAamp DNAKit提取组织样本基因组DNA，按常规方法操作。通常能的到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Illumina HiSeq X Ten平台全基因组甲基化检测
(1)提取组织DNA：使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行提取提取组织DNA。
(2)片段化处理：加入约100ng 1％外源性的噬菌体DNA，1.25μL FragmentBuffer，2.5μL Enzyme，加入ddH2O至12.5μL，4℃加热1min，37℃加热14min，4℃静置。以将DNA打断成200-300bp片段。
(3)末端修复和添加A尾；取DNA 12.5μL加入ER-AT buffer 1.75μL，ER-ATEnzyme0.75μL，20℃加热30min，65℃加热30min，4℃静置。
(4)DNA连接：使用KAPADNAHyperPlus试剂盒。取DNA15μL，加入LigationBuffer7.5μL，Enzyme 2.5μL，Methy-Adapter 1μL，加入ddH2O至27.5μL。20℃加热4h或4℃过夜保存。
(5)片段纯化：DNAbeads室温平衡0.5h后，加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系(27.5×0.8)混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，弃尽上清。接着加入200μL 80％乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠，磁力架上静置，弃上清，重复此步骤一次。加入12μL EB洗脱，磁力架上转移上清液至新的PCR管。
(6)重亚硫酸盐转化：使用EZ DNA Methylation-LightningTMKit(D5030T)试剂盒对DNA进行亚硫酸盐转化。试剂盒使用前需要将24mL 100％乙醇添加到6mL M-Wash缓冲液浓缩液中制备M-Wash缓冲液。
(7)PCR扩增：采用KAPAHIFI HotStartReadyMix(2802)进行高效PCR反应。加入DNA15μL，Index11μL，Index21μL。将两份混合共34μL。先98℃加热45s，循环以下操作十次：98℃加热15s，65℃加热30s，72℃加热30s。循环操作结束后72℃加热1min，4℃静置。
(8)片段纯化：DNAbeads室温平衡0.5h后，加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系(34×0.8)混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，弃尽上清；加入200μL 80％乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠，磁力架上静置，弃上清，重复此步骤一次；16μLEB洗脱，磁力架上转移上清液至新的PCR管，测定浓度。
(9)片段筛选：DNA beads室温平衡0.5h后，加入0.55×上步骤反应体系体积的beads到上步骤完成体系(16×0.8)混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，将上清液转移至新的PCR管中。向管内加入0.15×DNA beads，混匀，室温静置孵育5min，至于磁力架上待液体澄清，弃上清。16μL EB洗脱，磁力架上转移上清液至新的PCR管，测定浓度。
(10)上机测序：上述制备WGBS文库通过Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台进行全基因组测序。
4.统计分析方法
使用t检验比较癌与癌旁组织的全局、基因元件区域的甲基化水平差异。对差异甲基化位点进行主成分分析，使用超几何分布检验进行富集分析。
DNA甲基化差异分析通过R统计软件进行。使用的bsseq包对亚硫酸氢盐测序数据进行平滑处理，由于WGBS数据的高CpG覆盖率，我们对最小总宽度为1kb，最少包含70个CpG位点的窗口进行平滑。使用DSS包进行配对差异甲基化分析。DSS基于离散收缩法和Wald统计检验，在没有生物重复的情况下也可以实现了差异甲基化位点/区域的计算。本研究中，差异甲基化位点(Differently methylated locus，DML)定义为P值小于1×10-5的差异位点，差异甲基化区域(Differently methylated region，DMR)确定为以P值小于0.01的差异位点结合形成最小宽度为300bp，至少包含10个CpG位点的区域。基于年龄、性别、吸烟状态和癌症分期等基线特征，将研究对象进行亚组分析，差异甲基化分析策略与前述保持一致。
为了进一步研究这10个甲基化位点构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个甲基化位点与肺腺癌发病的关联情况和关联强度。具体来说，我们综合考虑每个甲基化位点的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的算法如下：危险分值＝
(2.450457262×chr5:37112010+13.24831614×chr16:62875877+58.90249185×chr6:50682050+396.5795458×chr13:31613633+523.1826831×chr2:43521317+148.0719384×chr6:166411604+9.140061203×chr5:37111954+11.60692533×chr6:50682024+64.17459782×chr10:130992603+58.16708958×chr2:126776294)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于甲基化关联分析研究的54对样本中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(R语言，v4.0.2)。统计学显著性水平设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
5、结果：
使用R软件，基于54对全基因组甲基化测序样本数据，纳入以上10个甲基化位点，年龄、吸烟和病理分期作为协变量，以肺腺癌为表型构建Logistic回归模型。为了评估该模型对肺腺癌的辅助诊断效能，使用rROC软件包绘制受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve，简称ROC曲线)，又称为感受性曲线(sensitivitycurve)，以假阳性概率(False positive rate)为横轴，真阳性(True positive rate)为纵轴所组成的坐标图，曲线下面积AUC代表了模型区分肺腺癌与健康对照的能力，大于0.85代表模型的分类效能优秀，该模型AUC值为0.937(见图1)，说明能够很好地区分肺腺癌与健康对照。
实施例2：诊断试剂盒制备方法
Illumina HiSeq X Ten平台进行全基因组甲基化测序，在甲基化差异分析后确定肺腺癌与癌旁中显著的差异甲基化位点作为肺腺癌诊断的指标。最后筛选出的与肺腺癌发病有关的差异甲基化位点用于制作辅助诊断试剂盒(chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294)。诊断试剂可以包括这些甲基化位点的特异性引物，以及DNA提取和重亚硫酸盐转化等试剂，这些物质可以全部装配在一个试剂盒中，也可以分散在一系列试剂盒中组合使用。
具体是，一种肺腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294的甲基化程度，该试剂盒含有的特异性扩增引物组合如下：
chr5:37112010的引物序列为：5‘-AGTAGATGATAGGAATGTAT(SEQ ID NO：1),3’-CTTTCAATCTCACTTTTTCT(SEQ ID NO：2)；
chr16:62875877的引物序列为：5‘-AGGATATGAATATAGGAAGAA(SEQ ID NO：3),3’-CAAATCTACTTTATCTACTAAT(SEQ ID NO：4)；
chr6:50682050的引物序列为：5‘-TAGAAATATTTGTTATAATGAG(SEQ ID NO：5),3’-TCCCCCCTTTTATTATTAAA(SEQ ID NO：6)；
chr13:31613633的引物序列为：5‘-TTTATTTGTGGTTTGTGGTT(SEQ ID NO：7),3’-TCTCTCCTTTTTTACTCTCATTT(SEQ ID NO：8)；
chr2:43521317的引物序列为：5‘-TTTTTTTGTTAAGTTTTATGGTT(SEQ ID NO：9),3’-ACTCCTAACACATAATAAAC(SEQ ID NO：10)；
chr6:166411604的引物序列为：5‘-GTGTAATTTTTGAGTGTAGA(SEQ ID NO：11),3’-CATTCTTCCTTTTCAACCTTTA(SEQ ID NO：12)；
chr5:37111954的引物序列为：5‘-TGTTATTGAAAGTTTTATGTT(SEQ ID NO：13),3’-CTTTCAATCTCACTTTTTCT(SEQ ID NO：14)；
chr6:50682024的引物序列为：5‘-TTATAATTTGTTTTTYGGGGGA(SEQ ID NO：15),3’-RTCTCTATCTCTTTCTCTTCACT(SEQ ID NO：16)；
chr10:130992603的引物序列为：5‘-TTATAATTTGTTTTTYGGGGGA(SEQ ID NO：17),3’-RTCTCTATCTCTTTCTCTTCACT(SEQ ID NO：18)；
chr2:126776294的引物序列为：5‘-GTTTGGGTTAGTTTATTAGT(SEQ ID NO：19),3’-CAAAATATATATACACACAACA(SEQ ID NO：20)。
该试剂盒还含有处理样品的试剂，所述处理包括提取DNA的步骤、使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤；其中：
所述使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤所使用的试剂最常见的是亚硫酸氢盐试剂，包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液；
所述DNA的提取试剂包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液，其中，裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂；结合缓冲液包括蛋白变性剂和pH缓冲剂；pH缓冲剂包括Tris、硼酸、磷酸盐、MES中的一种或多种；所述核酸酶抑制剂包括EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种；清洗缓冲液包括Tris、硼酸,山梨醇,聚乙二醇和巯基乙醇中的一种或多种；洗脱缓冲液包括NaCl,Tris-HCl和EDTA中的一种或多种。
该试剂盒还包括任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂，所述甲基化检测方法包括:全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应(甲基化特异性PCR,Methylation-Specific PCR,MS-PCR)、亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined Bisulfite Restriction Analysis，COBRA)、数字聚合酶链式反应、限制性界标基因组扫描、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、甲基化图谱分析(Methylation Profiling)、甲基化芯片中一种或多种方法。
Claims (8)
1.一种用于肺腺癌辅助诊断相关的甲基化位点标志物，其特征在于，该甲基化位点标志物是肺腺癌相关的甲基化位点chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294的组合。
2.用于扩增权利要求1所述的甲基化位点标志物的特异性扩增引物组合，其特征在于，这些引物组合为：
chr5:37112010的引物序列为：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2；
chr16:62875877的引物序列为：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4；
chr6:50682050的引物序列为：SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6；
chr13:31613633的引物序列为：SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8；
chr2:43521317的引物序列为：SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10；
chr6:166411604的引物序列为：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12；
chr5:37111954的引物序列为：SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14；
chr6:50682024的引物序列为：SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16；
chr10:130992603的引物序列为：SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18；
chr2:126776294的引物序列为：SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20。
3.权利要求2所述的特异性扩增引物组合在制备肺腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
4.一种肺腺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测外周血DNA中chr5:37112010、chr16:62875877、chr6:50682050、chr13:31613633、chr2:43521317、chr6:166411604、chr5:37111954、chr6:50682024、chr10:130992603和chr2:126776294的甲基化程度。
5.根据权利要求4所述的辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物组合。
6.根据权利要求5所述的辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有处理样品的试剂。
7.根据权利要求6所述的辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述处理包括提取DNA的步骤、使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤；其中：
所述使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤所使用的试剂最常见的是亚硫酸氢盐试剂，包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液；
所述DNA的提取试剂包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液，其中，裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂；结合缓冲液包括蛋白变性剂和pH缓冲剂；pH缓冲剂包括Tris、硼酸、磷酸盐、MES中的一种或多种；所述核酸酶抑制剂包括EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种；清洗缓冲液包括Tris、硼酸,山梨醇,聚乙二醇和巯基乙醇中的一种或多种；洗脱缓冲液包括NaCl,Tris-HCl和EDTA中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂。
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