JP2007522795A - Dna座におけるメチル化密度の定量的測定の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2004年4月12日に出願された米国仮特許出願第60/561,721号、2004年4月12日に出願された米国仮特許出願第60/561,563号、および2003年10月21日に出願された米国仮特許出願第60/513,426号の優先権の恩典を主張し、それぞれは、すべての目的のために全体として参照により組み入れられている。
ヒト癌細胞は、典型的には、重要な遺伝子の突然変異、増幅または欠失により特徴付けられる体細胞性に変化したゲノムを含む。さらに、ヒト癌細胞由来のDNA鋳型は、しばしば、DNAメチル化における体細胞性変化を示す。例えば、E.R. Fearon, et al., Cell 61:759 (1990): P.A. Jones, et al., Cancer Res. 46:461 (1986): R. Holliday, Science 238:163 (1987); A. De Bustros, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5693 (1988); P.A. Jones, et al., Adv. Cancer Res. 54:1 (1990); S.B. Baylin, et al., Cancer Cells 3:383 (1991); M. Makos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1929 (1992); N. Ohtani-Fujita, et al., Oncogene 8:1063 (1993)を参照されたい。
本発明は、ゲノムDNAの集団内の標的配列における平均メチル化密度を定量化するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、ゲノムDNAをメチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で、接触させる段階;座の無傷コピーを定量化する段階;および増幅産物の量を対照DNAのメチル化の量を表す対照値と比較し、それにより、対照DNAのメチル化密度と比較した座における平均メチル化密度を定量化する段階を含む。
i. DNA試料をメチル化依存性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部のメチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階、またはDNA試料をメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部の非メチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階;
ii. ハイブリッド捕獲を用いてDNAにおいて座の無傷コピーの数を定量化する段階;および
iii. 試料の部分のハイブリッド捕獲シグナルを、試料の異なる部分のハイブリッド捕獲シグナルと、または対照値(本明細書に記載されているような)と比較することにより座についての相対的メチル化密度を決定する段階。
i. DNA試料をメチル化依存性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部のメチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階、またはDNA試料をメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部の非メチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階;
ii. 接触段階後、DNA試料において座の無傷コピーを定量的に増幅する段階;
iii. DNA試料からの増幅された部分についてサイクル閾値(Ct)を同定する段階;および
iv. DNA試料のCtと対照Ct値の間の差(ΔCt)を計算することにより標的座についての相対的メチル化密度を決定する段階であって、2|ΔCt|が、DNA試料と対照の間の相対的メチル化密度に等しい、または、比例する、段階。
i. 対照DNA試料をメチル化依存性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部のメチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階、または対照DNA試料をメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部の非メチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階;
ii. 接触段階後、対照DNA試料において座の無傷コピーを増幅する段階;および
iii. 対照DNA試料からの増幅された部分についてサイクル閾値(Ct)を同定する段階。
DNAの「断片」とは、染色体全体またはそのより小さな区域でありうる、可変長の無傷DNA分子を指す。
(i)亜硫酸水素塩変換後、メチル化DNA配列を表す配列にハイブリダイズするが、亜硫酸水素塩変換後、同一の非メチル化配列を表す配列にハイブリダイズしない;または
(ii)亜硫酸水素塩変換後、非メチル化DNA配列を表す配列にハイブリダイズするが、亜硫酸水素塩変換後、同一のメチル化配列を表す配列にハイブリダイズしない。
I. 序論
本発明は、ゲノムDNAの領域においてメチル化の存在およびメチル化密度を測定するための迅速かつ効率的な方法を提供する。メチル化密度における変化の測定は、様々な癌を含む様々な疾患についての診断および予後を提供するために有用でありうる。本発明の方法はまた、特定のメチル化事象の検出を提供するが、本発明の方法は、それらが、特定のヌクレオチドのメチル化状態が表現型を決定するという予想または期待により限定されないため、特に注目に値する。特定のメチル化ヌクレオチドの有無よりむしろ、メチル化の密度(すなわち、核酸配列の特定の長さにおいてメチル化されているヌクレオチドの量)が遺伝子発現を調節する、および座のメチル化密度が連続体に沿った疾患進行を反映している場合において、本方法は特に役に立つ。
DNAの座のメチル化の量は、座を含むゲノムDNAの試料を供給する段階、DNAを、メチル化感受性またはメチル化依存性のいずれかである制限酵素で切断する段階、およびその後、無傷DNAの量を定量化する段階、または対象となるDNA座における切断されたDNAの量を定量化する段階により測定されうる。無傷または切断されたDNAの量は、座を含むゲノムDNAの最初の量、座におけるメチル化の量、およびゲノムDNAにおいてメチル化されている座におけるヌクレオチドの数(すなわち、割合)に依存する。DNA座におけるメチル化の量は、無傷DNAまたは切断されたDNAの量を、同様に処理されたDNA試料において無傷DNAまたは切断されたDNAの量を表す対照値と比較することにより決定されうる。下で考察されているように、対照値は、メチル化ヌクレオチドの既知または予想される数を表すことができる。または、対照値は、もう一つの細胞(例えば、正常な、非罹患性)における同じ座もしくは第二の座からの無傷または切断されたDNAの量を表すことができる。
部分的または完全の制限酵素消化のいずれかが、特定のDNA座内のメチル化密度に関する情報を提供するために用いられうる。
対象となる座を含むDNA試料がメチル化を感知する制限酵素で完全に消化される場合、提供される情報は、制限酵素の認識配列におけるメチル化の有無を含む。制限酵素の切断部位を含む座における無傷DNAの存在は、メチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素による切断に必要な認識部位の適切なメチル化状態が、制限酵素にもよるが、座に、または、の近くに、存在しなかったことを示す。
部分的(すなわち、不完全)消化におけるメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素での切断の量は、試料におけるDNAの座内の平均メチル化密度を反映する。例えば、座が対照より高いメチル化密度をもつ場合、メチル化依存性制限酵素を用いる部分的消化は、座のコピーをより頻繁に切断する。同様に、座が対照より低いメチル化密度をもつ場合、メチル化依存性制限酵素を用いる部分的消化は、認識部位がより少なく存在するため、座内において座のコピーをより少ない頻度で切断する。または、メチル化感受性制限酵素が用いられる場合、より高いメチル化密度をもつ座のコピーがより少ないほど、より少なく切断され、従って、この座を含むより多くの無傷DNA鎖が存在する。これらの場合のそれぞれにおいて、問題になっているDNA試料の消化は、完全消化について上で考察されたもののような対照値と比較される。または、消化後の無傷DNAの量は、試料間の相対的メチル化密度を決定するために第二試料と比較されうる。
DNAは、用いられうる任意の生物試料から、例えば、細胞、組織、分泌物から、および/または生物体(例えば、動物、植物、真菌、原核生物)から得られうる。試料は、新鮮でありうる、凍結状態でありうる、固定液(例えば、アルコール、ホルムアルデヒド、パラフィン、またはPreServeCyte(商標))に保存されうる、または緩衝液に希釈されうる。生物試料は、例えば、皮膚、血液またはその画分、組織、生検(例えば、肺、結腸、乳房、前立腺、頸部、肝臓、腎臓、脳、胃、食道、子宮、睾丸、皮膚、毛、骨、腎臓、心臓、胆嚢、膀胱など由来)、体液および分泌物(例えば、血液、尿、粘液、痰、唾液、子宮頸管スミア検体、骨髄、大便、汗、濃縮呼気など)を含む。生物試料はまた、葉、茎、根、種、花弁、花粉、胞子、キノコの傘、および樹液を含む。
いくつかの態様において、制限酵素により切断されたDNAの存在および量は、消化後、座を増幅することにより測定されうる。増幅のために無傷DNA鎖の存在を必要とする増幅技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))を用いることにより、残っている非切断DNAの存在および量が測定されうる。例えば、増幅プライマーが対象となる特定の座に隣接するPCR反応が、設計されうる。増幅は、2つのプライマーを含む座が制限消化後に無傷の状態のままである場合に起こる。全体および無傷のDNAの量がわかっている場合には、切断されたDNAの量が決定されうる。DNAの切断は、DNAのメチル化状態に依存するため、無傷および切断されたDNAは、異なるメチル化状態を表す。
いくつかの態様において、核酸ハイブリッド捕獲アッセイ法は、制限酵素により切断されたDNAの存在および量を検出するために用いられうる。この方法は、DNAをあらかじめ増幅しようがしまいが、用いられうる。制限消化後、対象となるDNA配列に特異的にハイブリダイズするRNAプローブは、DNAと混合されて、RNA:DNAハイブリッドを形成する。その後、RNA:DNAハイブリッドに結合する抗体が、ハイブリッドの存在、ならびにそれゆえに、非切断DNAの存在および量を検出するために用いられる。
に記載されている。場合によっては、抗体は、検出を容易にするために、検出可能な標識(例えば、酵素標識、同位元素、または蛍光標識)で標識される。または、抗体:核酸複合体は、検出可能な標識で標識された二次抗体とさらに接触させられうる。適した免疫学的およびイムノアッセイ手順の概説について、例えば、Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1988); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 第7版 1991); 米国特許第4,366,241号;同第4,376,110号;同第4,517,288号;および同第4,837,168号; Antibodies in Cell Biology, 37巻 (Asai, ed. 1993)を参照されたい。
対照値は、外部値(例えば、既知もしくは予想される数のメチル化ヌクレオチドまたはメチル化制限酵素認識配列をもつ第二のDNA試料における無傷座の数)かまたは内部値(例えば、同じDNA試料における第二の座、または第二DNA試料における同じ座)のいずれかを表しうる。有用であるが、対照においてどれくらいの数のヌクレオチド(すなわち、絶対値)がメチル化されているかを知る必要はない。例えば、メチル化が結果として疾患状態を生じる座について、座が正常細胞においてより多くメチル化されているという知識は、試料が得られた対象が疾患をもちうる、または疾患を発症する初期にありうることを示しうる。
いくつかの態様において、メチル化特異的PCRは、DNA座における特定のヌクレオチドのメチル化状態をモニターするために用いられうる。これらの態様において、制限酵素での消化後または前に、DNAは、非メチル化シトシンを修飾する作用物質と混合される。例えば、亜硫酸水素ナトリウムがDNAに加えられ、それにより、非メチル化シトシンをウラシルへ変換させ、メチル化シトシンを無傷の状態のままにしておく。1つまたは複数のプライマーは、亜硫酸水素ナトリウムで処理されたメチル化と非メチル化の配列の間を識別するように設計される。例えば、亜硫酸水素塩処理されたメチル化配列に相補的なプライマーは、内因性シトシンに相補的であるグアノシンを含む。亜硫酸水素塩処理された非メチル化配列に相補的なプライマーは、ウラシル、非メチル化シトシンの変換生成物、に相補的であるアデノシンを含む。好ましくは、変換されたメチル化および非メチル化の配列の間を区別するヌクレオチドは、プライマーの3'末端に、または、の近くに、ある。亜硫酸水素ナトリウムに基づいたPCRを用いる方法のバリエーションは、例えば、Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826 (1996); 米国特許第5,786,146号および同第6,200,756号に記載されている。
増幅プライマーは、特定の表現型または疾患に関連した座を増幅するように設計されうる。そのような変化が疾患に関連している座における変化したメチル化プロファイルの検出は、疾患の診断または予後を提供するために用いられうる。例えば、表1を参照されたい。また、Costello and Plass, J Med Genet 38:285-303 (2001)およびJones and Baylin, Nature. Rev 3:415-428 (2002)も参照されたい。
上記のように、対象となる遺伝子座におけるメチル化の相対的量を測定するために、多数の可能性が利用できる。例えば、部分的または完全消化が行われうる、メチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素が用いられうる、亜硫酸水素ナトリウム処理が用いられうるなど。本発明を特定のシリーズの段階に限定することを意図することなく、以下の可能性がさらに例示される。
上記のように、サイクル閾値(Ct)は、増幅反応においてDNA鋳型の最初の量を決定するための有用な測定である。従って、本明細書に記載されているように、メチル化依存性および/またはメチル化感受性制限酵素で処理され、かつ増幅された試料からのCt値は、用いられたメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素の認識配列におけるメチル化密度を計算するために用いられうる。1つの試料と対照値(第二試料からのCt値を表しうる)の間のCt値における変化は、相対的メチル化密度を予測する。PCRにおける増幅は、理論的には、サイクルごとにコピーを2倍にするため、2Xは、指数関数的増幅中の増幅におけるコピーの数に近似し、Xはサイクルの数である。従って、2Ctは、増幅の開始時における無傷DNAの量に比例する。2つの試料の間、または試料と対照値(例えば、対照からのCt値を表す)の間のCtの変化(ΔCt)は、試料における最初の出発鋳型における差を表す。それゆえに、2|ΔCt|は、試料と対照または第二試料の間の相対的メチル化密度差に比例する。例えば、実施例9に説明されているように、2つの試料(それぞれ、メチル化依存性制限酵素で処理され、その後、増幅された)間のCtにおける1.46の差は、一方の試料が、他方の試料より、座内に少なくとも2.75(すなわち、2(1.46)=2.75)倍多い可能性のあるメチル化制限部位を有することを示している。
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットを提供する。例えば、本発明のキットは、例えば、メチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素、あらかじめ決められた数のメチル化ヌクレオチドを含む対照DNA分子、および対照DNA分子にハイブリダイズする1つまたは2つの異なる対照オリゴヌクレオチドプライマーを含みうる。場合によっては、キットは、ユーザーが試料の増幅を既知の数のメチル化ヌクレオチドを含むいくつかのDNAと比較することができるように、メチル化ヌクレオチドの異なるあらかじめ決められた数を含む複数のDNA分子を含む。
実施例1:DNAメチル化標準試料セットの構築
標準試料セットは多数の方法で作製される。例えば、メチル化密度の増加を有することがわかっているDNAの標準セットを作製するために、メチラーゼ(例えば、M.SssIまたはM.HhaI、M.AluIのような他のメチラーゼ)が、一連のDNA試料へインビトロで適用される。この標準セットは、最初に既知の配列(例えば、対象となる座)の試料を得ることにより作製される。次に、試料は、1シリーズの試料へ分割され、シリーズにおける各試料は、マグネシウムの存在下で、かつ結果として、シリーズにおける試料のメチル化密度を増加させるような様式において、選択されたメチラーゼで処理される。
DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集される。
DNAは、単一の源から得られ、2つの集団へ分割される。DNAの第一集団は、酵素McrBCで完全に消化され、一方、残りの集団は処理されない。または、第一集団は、1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素(例えば、Hpa II、Hha I、またはAci Iなど)のカクテルで消化され、一方、DNAの第二集団は処理されない。
DNAは、単一の源から得られ、1シリーズの2つまたはそれ以上の部分へ分割される。
DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集される。
DNAは、単一の源から得られ、2つまたはそれ以上の部分の群へ分割される。または、DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集され、2つまたはそれ以上の均一な部分の群へ分割される。
DNAは、単一の源から得られ、2つの部分へ分割される。または、DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集され、各集団は2つの部分へ分割される。
ヒト男性胎盤DNAを得て、シトシンの後にグアノシンが続く(すなわち、GCモチーフ)場合シトシンをメチル化する(5mC)、M.SssIを用いてインビトロでメチル化した。結果として生じるインビトロメチル化DNAを、その後、既知の比率で非メチル化男性胎盤DNAへ混合し、それにより、それぞれがメチル化されている総コピーの異なるパーセンテージを含む、1組の混合物を作製した。
および標準PCR条件は以下のものを用いた。
1サイクル[95℃で3分間]
続いて、49サイクル[95℃で30秒間、65℃で15秒間、および68℃で15秒間、プレートを68℃で読み取り、その後、もう一つのプレートを83℃で読み取る]。
この実施例は、座内のメチル化の平均密度(すなわち、メチル化ヌクレオチドの平均数)を測定することを実証している。図6に提供されているように、多くの疾患において、1つまたは複数の座のメチル化は、疾患進行に対応してメチル化密度の増加の進行を受ける。以前に記載されたメチル化検出技術は、1つもしくは複数の特定のヌクレオチドにおけるメチル化の有無を検出することを含むが、座に渡っての密度の分析を提供しない。対照的に、本発明は、座内のメチル化事象の平均数を検出するための方法を提供する。
この実施例は、亜硫酸水素塩およびメチル化依存性制限酵素の両方での処理、続いてPCR増幅および増幅産物の定量化により、座のメチル化密度を測定する能力を実証する。
この実施例は、メチル化依存性およびメチル化感受性制限酵素の、座における異なるメチル化密度を識別できることを実証する。
Dynamo MJ qPCR緩衝液、65℃アニーリング、2サイクルPCR(95℃で30 sec、65℃で20 sec)が49回サイクルされ、MJ opticon II定量的PCRシステムでモニターされた。
a)McrBC切断により、T=1についての0ΔCtからT=4(60分間)における最大ΔCtまで進む際の各試料についてのより大きなΔCtを示すはずである。
b)Aci I反応は、正反対の関係を示すはずである。
c)偽処理された消化物および二重消化物は一定の参照点であるはずである。
この実施例は、モロコシ(Sorghum bicolor)においてカフィリン(kafirin)遺伝子クラスターに繰り返されている配列をモニターするアッセイ法を用いて、一度より多く(すなわち、1コピーより多く)ゲノムに存在する標的配列のメチル化を測定する本方法の能力を実証する。
Claims (50)
- 以下の段階を含む、ゲノムDNAの座における平均メチル化密度を定量化するための方法:
ゲノムDNAをメチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させる段階;
座の無傷コピーを定量化する段階;および
増幅産物の量を、対照DNAのメチル化の量を表す対照値と比較し、それにより、対照DNAのメチル化密度と比較した座における平均メチル化密度を定量化する段階。 - 定量化段階が定量的増幅を含む、請求項1記載の方法。
- 増幅産物の量が標準曲線と比較される、請求項2記載の方法。
- 増幅段階が、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、座に隣接するDNAに、プライマー間のゲノムDNAの切断されていない座に対応する増幅産物を生じるようにハイブリダイズさせる段階を含む、請求項1記載の方法。
- 対照値が、既知のまたは予想される数のメチル化ヌクレオチドを有するDNA試料の増幅産物の量を表す、請求項1記載の方法。
- 制限酵素がメチル化感受性制限酵素である、請求項1記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、Aat II、Aci I、Acl I、Age I、Alu I、Asc I、Ase I、AsiS I、Bbe I、BsaA I、BsaH I、BsiE I、BsiW I、BsrF I、BssH II、BssK I、BstB I、BstN I、BstU I、Cla I、Eae I、Eag I、Fau I、Fse I、Hha I、HinP1 I、HinC II、Hpa II、Hpy99 I、HpyCH4 IV、Kas I、Mlu I、MapA1 I、Msp I、Nae I、Nar I、Not I、Pml I、Pst I、Pvu I、Rsr II、Sac II、Sap I、Sau3A I、Sfl I、Sfo I、SgrA I、Sma I、SnaB I、Tsc I、Xma IおよびZra Iからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 制限酵素がメチル化依存性制限酵素である、請求項1記載の方法。
- 制限酵素がメチル-シトシン依存性制限酵素である、請求項1記載の方法。
- 制限酵素がMcrBC、McrA、またはMrrAである、請求項9記載の方法。
- 制限酵素がメチル-アデノシン依存性制限酵素である、請求項1記載の方法。
- 制限酵素がDpn Iである、請求項11記載の方法。
- メチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素が、部分の部分的消化のみを可能にする条件下で部分と接触させられる、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、請求項1記載の方法:
ゲノムDNAを少なくとも2つの等しい部分へ分割する段階;
1つの部分をメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素と接触させ、かつ第二部分をその制限酵素のアイソシゾマーのパートナーと接触させる段階;
2つのオリゴヌクレオチドプライマーを座に隣接するDNAにハイブリダイズさせる段階を含む段階において、各部分においてゲノムDNAの座を増幅する段階;
増幅産物を定量化する段階;および
2つの部分からの増幅産物の量を比較する段階。 - ゲノムDNAを、増幅段階の前に、非メチル化シトシンを修飾する作用物質と接触させる段階をさらに含み、かつ2つのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つがゲノムDNAにおいて修飾された非メチル化とメチル化のDNAの間を識別する、請求項1記載の方法。
- ゲノムDNAが、非メチル化シトシンを修飾する作用物質と接触させられる前に、DNAを、少なくとも1つのメチル化感受性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と接触させる段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
- ゲノムDNAが少なくとも2つの異なるメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素の混合物と接触させられる、請求項16記載の方法。
- 作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項15記載の方法。
- 増幅産物が定量的PCRを用いて定量化される、請求項2記載の方法。
- 対照値が、対照座を含むDNAをメチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素と接触させる段階;対照座を増幅する段階;および増幅産物の量を測定する段階により作成される、請求項1記載の方法。
- 対照座が、既知のものである、またはメチル化されていないと予想される、請求項20記載の方法。
- 対照値が、既知の数のメチル化ヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
- 対象において癌細胞の有無を検出するために行われる、請求項1記載の方法。
- 定量化段階が増幅産物にハイブリダイズするプローブを検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- プローブが検出可能な蛍光部分を含む、請求項24記載の方法。
- DNAが動物由来である、請求項1記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項26記載の方法。
- ゲノムDNAが、植物、真菌および細菌からなる群より選択される生物体由来である、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、DNA試料において標的座についての相対的メチル化密度を計算する方法:
i. DNA試料をメチル化依存性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部のメチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階、またはDNA試料をメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部の非メチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階;
ii. 接触段階後、DNA試料において座の無傷コピーを定量的に増幅する段階;
iii. DNA試料からの増幅された部分についてサイクル閾値(Ct)を同定する段階;および
iv. DNA試料のCtと対照Ct値の間の差(ΔCt)を計算することにより標的座についての相対的メチル化密度を決定する段階であって、2|ΔCt|が、DNA試料と対照の間の相対的メチル化密度に比例する、段階。 - 対照Ctが以下の段階を含む段階により計算される、請求項29記載の方法:
i. 対照DNA試料をメチル化依存性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部のメチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階、または対照DNA試料をメチル化感受性制限酵素と、座における可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させて、座の少なくとも一部の非メチル化コピーが断片化されている核酸の集団を得る段階;
ii. 接触段階後、対照DNA試料において座の無傷コピーを増幅する段階;および
iii. 対照DNA試料からの増幅された部分についてサイクル閾値(Ct)を同定する段階。 - 増幅段階が、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、座に隣接するDNAに、プライマー間のゲノムDNAの切断されていない座に対応する増幅産物を生じるようにハイブリダイズさせる段階を含む、請求項29記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、Aat II、Acl I、Age I、Alu I、Asc I、Ase I、AsiS I、Bbe I、BsaA I、BsaH I、BsiE I、BsiW I、BsrF I、BssH II、BssK I、BstB I、BstN I、BstU I、Cla I、Eae I、Eag I、Fau I、Fse I、Hha I、HinP1 I、HinC II、Hpa II、Hpy99 I、HpyCH4 IV、Kas I、Mlu I、MapA1 I、Msp I、Nae I、Nar I、Not I、Pml I、Pst I、Pvu I、Rsr II、Sac II、Sap I、Sau3A I、Sfl I、Sfo I、SgrA I、Sma I、SnaB I、Tsc I、Xma IおよびZra Iからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
- 制限酵素がメチル化依存性制限酵素である、請求項29記載の方法。
- 制限酵素がメチル-シトシン依存性制限酵素である、請求項29記載の方法。
- 制限酵素がMcrBC、McrA、またはMrrAである、請求項34記載の方法。
- 制限酵素がメチル-アデノシン依存性制限酵素である、請求項1記載の方法。
- 制限酵素がDpn Iである、請求項36記載の方法。
- メチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素が、部分の部分的消化のみを可能にする条件下で部分と接触させられる、請求項29記載の方法。
- 以下のものを含む、ゲノムDNAの座における平均メチル化密度を定量化するためのキット:
メチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素;
あらかじめ決められた数のメチル化ヌクレオチドを含む対照DNA分子;および
対照DNA分子にハイブリダイズする対照オリゴヌクレオチドプライマー。 - 制限酵素がメチル化感受性制限酵素である、請求項39記載のキット。
- 制限酵素がメチル化依存性制限酵素である、請求項39記載のキット。
- 制限酵素がメチル-シトシン依存性制限酵素である、請求項39記載のキット。
- 制限酵素がMcrBC、McrA、またはMrrAである、請求項39記載のキット。
- ゲノムDNAのあらかじめ決められた座にハイブリダイズする標的オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項39記載のキット。
- 少なくとも1つの標的オリゴヌクレオチドプライマーが、ヒトゲノムDNAにおいて修飾された非メチル化とメチル化のDNAの間を識別する、請求項39記載のキット。
- 異なるあらかじめ決められた数のメチル化ヌクレオチドを含む複数のDNA分子を含む、請求項39記載のキット。
- 制限酵素の活性を維持するのに十分な試薬をさらに含む、請求項39記載のキット。
- 耐熱性DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項39記載のキット。
- 非メチル化シトシンを修飾する作用物質をさらに含む、請求項39記載のキット。
- 検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項39記載のキット。
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