CN111471796B - 新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核酸检测技术领域，其公开了一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及制备方法及检测方法，所述试剂盒包括COVID‑19反应液，所述COVID‑19反应液由COVID‑19荧光标记物与COVID‑19探针溶液配制而成；所述COVID‑19探针溶液包括：ORF1ab区段探针、N区段探针、E区段探针，所述ORF1ab区段探针用于检测COVID‑19开放阅读编码框la b，所述N区段探针用于检测COVID‑19囊膜蛋白基因，所述E区段探针用于检测COVID‑19核壳蛋白基因；相比一般的荧光PCR和测序检测，信号强度更强，特异性更好，检测时间更短，无需专业技术人员操作，运输和保存无需冷藏，反应过程中无变温环节，无需配套实验室和配套PCR仪器，使用方便快捷。

Description

新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及制备 方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，特别是一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及该试剂盒的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别，与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上。
新型冠状病毒感染的肺炎是由新型冠状病毒感染导致的肺部炎症，现已将该病纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。随着疫情的蔓延，急需一种能够准确快速诊断新型冠状病毒的检测试剂。
目前已经有6家企业取得了新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂的注册文号：
1)圣湘生物科技股份有限公司的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（国械注准20203400064）；
2)中山大学达安基因股份有限公司的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（国械注准20203400063）；
3)上海捷诺生物科技有限公司的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（国械注准20203400058）；
4)上海之江生物科技股份有限公司的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（国械注准20203400057）；
5)华大生物科技（武汉）有限公司的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（国械注准20203400060）；
6)华大生物科技（武汉）有限公司的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）（国械注准20203400059）。
上述各新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒主要是采用荧光PCR核酸检测方法，检测原理是通过在PCR反应体系中加入荧光报告基团和荧光淬灭基团，随着 PCR 反应的进行，扩增产物不断积累，导致荧光信号不断积累，对荧光信号进行实时监测并得到未知样品的Ct（Thresholdcycle）值，Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
上述荧光PCR核酸检测方法虽然定量准确、重现性好，但是，该方法需要专业的PCR实验室、专用的PCR仪器，需要专门经过培训的技术人员进行操作，还需要对样本进行核酸提取和纯化处理，需要-20℃以下的冷链运输，检测时间长达1-3小时，检测效率低，并且检测过程有核酸扩增，容易引起实验室阳性产物污染，等诸多问题，使用不便。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及制备方法及检测方法，不仅检测时间更短，而且无需专业技术人员操作，无需配套实验室和专用仪器，使用更加方便快捷。
本发明的目的之一，在于提供一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，所述试剂盒包括COVID-19 反应液，所述COVID-19 反应液由COVID-19荧光标记物与COVID-19探针溶液配制而成；所述COVID-19探针溶液包括：ORF1ab区段探针、N区段探针、E区段探针，所述ORF1ab区段探针用于检测COVID-19开放阅读编码框lab，所述N区段探针用于检测COVID-19囊膜蛋白基因，所述E区段探针用于检测COVID-19核壳蛋白基因。
优选的，所述ORF1ab区段探针的序列为：
Aacgattgtgcatcagctgactgaagcatgggttcgcggagttgatcacaactacagccataacctttccacataccgcagac；
所述N区段探针的序列为：
Agagcagcatcaccgccattgccagccattctagcaggagaagttc；
所述E区段探针的序列为：
aaggatggctagtgtaactagcaagaataccacgaaagcaagaaaaa。
优选的，所述COVID-19荧光标记物采用荧光物质与COVID-19标记原料耦合制成；所述COVID-19标记原料采用COVID-19抗体；所述荧光物质采用以下任一种：FITC荧光素、荧光微球、荧光颗粒、生物荧光素。
优选的，所述试剂盒还包括COVID-19阴性对照品，所述阴性对照品包括以下对照品中的一种或多种：生理盐水性对照品、纯化水性对照品、非COVID-19病原体对照品、未含有COVID-19靶序列的假病毒。
进一步的，所述阴性对照品包括N1～N17：N1～N2为生理盐水性对照品，N3～N4为纯化水性对照品，N5～N13为人咽拭子样本，N14～N17为未含有COVID-19靶序列的假病毒；其中，所述人咽拭子样本中，COVID-19均为阴性，其他常见病原体为阳性；所述未含有COVID-19靶序列的假病毒为冠状病毒的亚型，N14为人冠状病毒229E N区段阳性，N15为人冠状病毒NL63 N区段阳性，N16为人冠状病毒OC43 N区段阳性，N17为人冠状病毒HKU1 N区段阳性。
优选的，所述试剂盒还包括COVID-19阳性对照品，所述阳性对照品为含有COVID-19靶序列的假病毒；所述阳性对照品包括P1、P2、P3，其中，P1为COVID-19 N区段阳性、P2为COVID-19 E区段阳性、P3为COVID-19 ORF 1ab区段阳性；所述阳性对照品的浓度为3000TU/mL±5%。
优选的，所述试剂盒还包括精密度对照品和检测限对照品，所述精密度对照品包括J1、J2、J3，J1～J2为含有COVID-19靶序列的假病毒，均为COVID-19 ORF 1ab区段阳性，浓度分别为2000TU/mL±5%和5000TU/mL±5%，J3为混合人阴性咽拭子样本，且COVID-19阴性；所述检测限对照品包括L1、L2、L3，L1为COVID-19 N区段阳性、L2为COVID-19 E区段阳性、L3为COVID-19 ORF 1ab区段阳性，所述检测限对照品的浓度为1000 TU/mL±5%。
优选的，所述试剂盒还包括COVID-19检测条、COVID-19复溶液、COVID-19样品保存液。
本发明的目的之二在于，提供如上任一项所述的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒的制备方法，其包括COVID-19荧光标记物的制备，步骤如下：
活化：将1%荧光微球溶液以1.0mg/mL±5%的比例，EDC溶液以0.6mg/mL±5%的比例加入上述配制好的0.05M±5%硼酸盐缓冲液混匀，置于旋转混匀器上旋转20分钟以上，活化后以15000～16000rpm离心30分钟以上，去上清，并用0.05M±5%硼酸缓冲液重悬，混匀。
偶联：向所述活化完的荧光微球溶液中按0.2mg/mL的量加入COVID-19抗体，混匀，置于旋转混匀器上旋转2小时以上，得到荧光微球标记结合物溶液；
封闭：按0.1ml/mL±5%比例将10%BSA溶液加入到荧光微球标记结合物溶液，混匀，置于旋转混匀器上旋转12～16小时。
离心重悬：将荧光微球标记结合物溶液以15000～16000rpm离心，去上清，用等体积0.05M±5%硼酸盐缓冲液洗涤，最后沉淀用上清溶液等体积量的标记物稀释液重悬，制备成COVID-19荧光标记物。
优选的，包括COVID-19 反应液的制备，步骤如下：
荧光标记物配制：将所述COVID-19荧光标记物按照比例用标记物稀释液稀释，所述比例为：稀释液:T线标记物:C线标记物=17:2:1；
探针溶液配制：将COVID-19探针用核酸溶解液稀释至10μM±5%，得到COVID-19探针溶液；
反应液配制：将稀释后的COVID-19荧光标记物和所述COVID-19探针溶液按1:1的体积比混合，得到COVID-19反应液；
反应液分装：将所述COVID-19反应液分装在反应管，并在温度18～28℃、湿度≤30%条件下干燥6～8小时。
优选的，还包括COVID-19阳性对照品的制备步骤：用阳性对照品稀释液将人工合成的COVID-19 RNA稀释到2000TU/mL±5%；将稀释后的阳性对照品分装在可立管，并在温度18～28℃、湿度≤30%条件下干燥6～8小时。
本发明的目的之三在于，提供如上任一项所述的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：
通过杂交捕获获取待测样本中的目标核酸片段；
将所述目标核酸片段与所述COVID-19 反应液进行核酸杂交反应，得到待测液；
将所述待测液加入COVID-19检测条中进行荧光信号识别。
本发明的有益效果是：
本发明的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒运用杂交捕获免疫荧光分析法，英文简称HC-IFA，是一种通过杂交捕获获取待测样本中的目标核酸片段，通过荧光信号识别，对样本中目标核酸片段的数量进行定性、半定量、定量判断的方法。相比一般的抗原抗体免疫检测，本发明涵盖了核酸检测，达到了分子水平的检测灵敏度，实现了核酸检测荧光识别；相比一般的荧光PCR和测序检测，信号强度更强，特异性更好，检测时间更短，无需专业技术人员操作，运输和保存无需冷藏，反应过程中无变温环节，无需配套实验室和配套PCR仪器，可进行单人份检测，检测时间单人份30min，检测时间短，一小时检测通量100人份～200人份。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒的制备工艺流程简图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
第一实施例（试剂盒）：
本实施例的一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，所述试剂盒包括COVID-19 反应液、COVID-19复溶液、COVID-19阴性对照品、COVID-19阳性对照品、COVID-19样本保存液，各液体分别分装在反应管或可立管中，还包括COVID-19检测条，以及铝箔袋卡、试剂盒盒签、试剂盒说明书等。
所述COVID-19 反应液由COVID-19荧光标记物与COVID-19探针溶液配制而成；所述COVID-19探针溶液包括：ORF1ab区段探针、N区段探针、E区段探针，所述ORF1ab区段探针用于检测COVID-19开放阅读编码框lab，所述N区段探针用于检测COVID-19囊膜蛋白基因，所述E区段探针用于检测COVID-19核壳蛋白基因。
其中，所述ORF1ab区段探针的序列为：
Aacgattgtgcatcagctgactgaagcatgggttcgcggagttgatcacaactacagccataacctttccacataccgcagac；
所述N区段探针的序列为：
Agagcagcatcaccgccattgccagccattctagcaggagaagttc；
所述E区段探针的序列为：
aaggatggctagtgtaactagcaagaataccacgaaagcaagaaaaa。
所述COVID-19荧光标记物采用荧光物质与COVID-19标记原料耦合制成；所述COVID-19标记原料采用COVID-19抗体；所述荧光物质采用以下任一种：FITC荧光素、荧光微球、荧光颗粒、生物荧光素，以及其他可发出荧光的物质，不以此为限。
所述COVID-19阴性对照品包括以下对照品中的一种或多种：生理盐水性对照品、纯化水性对照品、非COVID-19病原体对照品、未含有COVID-19靶序列的假病毒。具体的，所述阴性对照品包括N1～N17：N1～N2为生理盐水性对照品，N3～N4为纯化水性对照品，N5～N13为人咽拭子样本，N14～N17为未含有COVID-19靶序列的假病毒；其中，所述人咽拭子样本中，COVID-19均为阴性，其他常见病原体为阳性；所述未含有COVID-19靶序列的假病毒为冠状病毒的亚型，N14为人冠状病毒229E N区段阳性，N15为人冠状病毒NL63 N区段阳性，N16为人冠状病毒OC43 N区段阳性，N17为人冠状病毒HKU1 N区段阳性。
所述COVID-19阳性对照品为含有COVID-19靶序列的假病毒；所述阳性对照品包括P1、P2、P3，其中，P1为COVID-19 N区段阳性、P2为COVID-19 E区段阳性、P3为COVID-19 ORF1ab区段阳性；所述阳性对照品的浓度为3000 TU/mL±5%。
所述精密度对照品包括J1、J2、J3，J1～J2为含有COVID-19靶序列的假病毒，均为COVID-19 ORF 1ab区段阳性，浓度分别为2000TU/mL±5%和5000TU/mL±5%，J3为混合人阴性咽拭子样本，且COVID-19阴性；所述检测限对照品包括L1、L2、L3，L1为COVID-19 N区段阳性、L2为COVID-19 E区段阳性、L3为COVID-19 ORF 1ab区段阳性，所述检测限对照品的浓度为1000 TU/m±5%L。详见以下表1。
Figure 218563DEST_PATH_IMAGE001
所述检测条可采用层析法或渗滤法，本实施例中，所述检测条采用免疫荧光层析试条，其包括设置于所述检测条一个端部区域上的吸水垫、设置于所述检测条另一个端部区域上的加样区，以及设置在所述吸水垫和所述加样区之间的硝酸纤维膜（NC膜），所述硝酸纤维膜上设置在T线检测区。将处理过的玻纤垫、处理过的硝酸纤维膜、以及吸水垫依序搭接在PVC底板上，切割成设定宽度的试纸条，即得本实用新型的检测条。
第二实施例（制备方法）：
如图1所示，本实施例提供如上任一项所述的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒的制备方法，其包括：
（1）COVID-19荧光标记物的制备，步骤如下：
活化：将1%荧光微球溶液以1.0mg/mL±5%的比例，EDC溶液以0.6mg/mL±5%的比例加入配制好的0.05M±5%硼酸盐缓冲液混匀，置于旋转混匀器上旋转20分钟以上，活化后以15000～16000rpm离心30分钟以上，去上清，并用0.05M±5%硼酸缓冲液重悬，混匀。
偶联：向所述活化完的荧光微球溶液中按0.2mg/mL±5%的量加入COVID-19抗体，混匀，置于旋转混匀器上旋转2小时以上，得到荧光微球标记结合物溶液；
封闭：按0.1ml/mL±5%比例将10%BSA溶液加入到荧光微球标记结合物溶液，混匀，置于旋转混匀器上旋转12～16小时。
离心重悬：将荧光微球标记结合物溶液以15000～16000rpm离心，去上清，用等体积0.05M±5%硼酸盐缓冲液（PH 8.0）洗涤两次，最后沉淀用上清溶液等体积量的标记物稀释液重悬，制备成COVID-19荧光标记物。
（2）COVID-19 反应液的制备，步骤如下：
荧光标记物配制：将所述COVID-19荧光标记物按照比例用标记物稀释液稀释，所述比例为：稀释液:T线标记物:C线标记物=17:2:1；
探针溶液配制：将COVID-19探针用核酸溶解液稀释至10μM±5%，得到COVID-19探针溶液；
反应液配制：将稀释后的COVID-19荧光标记物和所述COVID-19探针溶液按1:1的体积比混合，得到COVID-19反应液；
反应液分装：将所述COVID-19反应液分装在反应管，4μL/管，并在温度18～28℃、湿度≤30%条件下干燥6～8小时。
（3）COVID-19阳性对照品的制备步骤：用阳性对照品稀释液将人工合成的COVID-19 RNA稀释到2000TU/mL±5%；将稀释后的阳性对照品分装在可立管，5μL/管，并在温度18～28℃、湿度≤30%条件下干燥6～8小时。
（4）COVID-19检测条的包被条件：
T线包被浓度为0.5mg/mL±5%、C线包被浓度为1.0mg/mL±5%；
喷量为1.0µL/cm±5%、导轨速度：100mm/s±5%、喷嘴间隔：6mm±5%；
干燥：温度为18～28℃、湿度为≤30％、干燥时间：16h-20h。
（5）检测试剂的检测条件：
反应管复溶液加入量为85μL±5%；
样本取样量为20μL±5%；
吸取100µL±5%混匀后的样本，加入到检测卡的加样孔中；
核酸杂交反应条件为37℃，反应时间为15分钟以上；
试剂检测反应时间为15分钟以上。
（6）冻干工艺：
本实施例的制备方法的反应过程中涉及的中间制剂均为冻干品，仅需配制工作液，无稀释等复杂操作；冻干处理方式为：在-30℃冻干5h，后续的12h冻干过程中逐步升温至-10℃，升温速率为5℃/3h，最后在-10℃冻干7-19h小时。
第三实施例（检测方法）：
本实施例还提供如上任一项所述的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：
通过杂交捕获获取待测样本中的目标核酸片段；
将所述目标核酸片段与所述COVID-19 反应液进行核酸杂交反应，得到待测液；
将所述待测液加入COVID-19检测条中进行荧光信号识别；本实施例中，是将所述待测液加入所述检测条的加样区，90s后，从加样区再次加入冲洗液100ul，等待10分钟后，对所述检测条的检测区进行荧光检测，读取检测结果。
检测结果的判断如下:
使用480nm的激发光进行照射，识别520nm的荧光发出信号，存在荧光发出信号的情况判读为阳性，反之则为阴性。根据需要可以根据发出信号的强弱来判读反应的强弱，识别仪器运用一般的荧光读数仪即可，例如苏州和迈科技生产的便携式免疫荧光分析仪。
需要说明的是，本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。对于制备方法和检测方法实施例而言，由于其与试剂盒实施例基本相似，所以描述的比较简单，相关之处参见试剂盒实施例的部分说明即可。
本发明的基于核酸杂交捕获的免疫荧光分析法的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒及检测方法，与现有的荧光PCR核酸检测方法的效果比对具体如下：
表2-技术效果对比图
对比项目 本发明 现有技术
方法学原理 核酸杂交捕获荧光法 核酸扩增（荧光PCR法）
样本处理 免核酸提取 核酸提取纯化
检测时间 30分钟 1-3小时
使用环境 实现现场检测、实现随到随检，无需PCR实验室 需三间专业PCR实验室、需大型中心实验室；若污染，长期无法使用
人员要求 无需专业技术人员，人员经过简单培训即可 需要专门经过培训的技术人员
设备 配套设备，小巧轻便，随身携带 需要PCR仪，不能摆动
应用场景 基层医疗、门诊、检验科、急诊、出入境、海关、疾控中心等 大型三甲医院中心实验室
潜在污染 无扩增、不会引起实验室阳性产物污染，且复溶液的成分具有“杀毒”成分 有核酸扩增，容易引起实验室阳性产物污染、且污染长期无法消除
运输和储存 2-30℃常温储存、常温运输 -20℃储存，需要冷链运输
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括COVID-19反应液，所述COVID-19反应液由COVID-19荧光标记物与COVID-19探针溶液配制而成；所述COVID-19荧光标记物采用荧光物质与COVID-19标记原料耦合制成；所述COVID-19标记原料采用COVID-19抗体；所述荧光物质采用以下任一种：FITC荧光素、荧光微球、荧光颗粒、生物荧光素；所述COVID-19探针溶液包括：ORF1ab区段探针、N区段探针、E区段探针，所述ORF1ab区段探针用于检测COVID-19开放阅读编码框lab，所述N区段探针用于检测COVID-19囊膜蛋白基因，所述E区段探针用于检测COVID-19核壳蛋白基因；
所述ORF1ab区段探针的序列为：
Aacgattgtgcatcagctgactgaagcatgggttcgcggagttgatcacaactacagccataacctttccacataccgcagac；
所述N区段探针的序列为：
Agagcagcatcaccgccattgccagccattctagcaggagaagttc；
所述E区段探针的序列为：
aaggatggctagtgtaactagcaagaataccacgaaagcaagaaaaa。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括COVID-19阴性对照品，所述阴性对照品包括以下对照品中的一种或多种：生理盐水性对照品、纯化水性对照品、非COVID-19病原体对照品、未含有COVID-19靶序列的假病毒。
3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品包括N1～N17：N1～N2为生理盐水性对照品，N3～N4为纯化水性对照品，N5～N13为人咽拭子样本，N14～N17为未含有COVID-19靶序列的假病毒；其中，所述人咽拭子样本中，COVID-19均为阴性，非COVID-19病原体对照品为阳性；所述未含有COVID-19靶序列的假病毒为冠状病毒的亚型，N14为人冠状病毒229E N区段阳性，N15为人冠状病毒NL63 N区段阳性，N16为人冠状病毒OC43 N区段阳性，N17为人冠状病毒HKU1 N区段阳性。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括COVID-19阳性对照品，所述阳性对照品为含有COVID-19靶序列的假病毒；所述阳性对照品包括P1、P2、P3，其中，P1为COVID-19N区段阳性、P2为COVID-19E区段阳性、P3为COVID-19ORF 1ab区段阳性；所述阳性对照品的浓度为3000TU/mL±5％。
5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括精密度对照品和检测限对照品，所述精密度对照品包括J1、J2、J3，J1～J2为含有COVID-19靶序列的假病毒，均为COVID-19ORF 1ab区段阳性，浓度分别为2000TU/mL±5％和5000TU/mL±5％，J3为混合人阴性咽拭子样本，且COVID-19阴性；所述检测限对照品包括L1、L2、L3，L1为COVID-19N区段阳性、L2为COVID-19E区段阳性、L3为COVID-19ORF1ab区段阳性，所述检测限对照品的浓度为1000TU/mL±5％。
6.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括COVID-19检测条、COVID-19复溶液、COVID-19样品保存液。
7.如权利要求1至6任一项所述的新型冠状病毒核酸快速杂交捕获免疫荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括COVID-19荧光标记物的制备，步骤如下：
活化：将1％荧光微球溶液以1 .0mg/mL±5％的比例，EDC溶液以0 .6mg/mL±5％的比例加入配制好的0 .05M±5％硼酸盐缓冲液混匀，置于旋转混匀器上旋转20分钟以上，活化后以15000～16000rpm离心30分钟以上，去上清，并用0 .05M±5％硼酸缓冲液重悬，混匀；偶联：向所述活化完的荧光微球溶液中按0 .2mg/mL±5％的量加入COVID-19抗体，混匀，置于旋转混匀器上旋转2小时以上，得到荧光微球标记结合物溶液；
封闭：按0 .1ml/mL±5％比例将10％BSA溶液加入到荧光微球标记结合物溶液，混匀，置于旋转混匀器上旋转12～16小时；
离心重悬：将荧光微球标记结合物溶液以15000～16000rpm离心，去上清，用等体积0.05M±5％硼酸盐缓冲液洗涤，最后沉淀用上清溶液等体积量的标记物稀释液重悬，制备成COVID-19荧光标记物；
还包括COVID-19反应液的制备，步骤如下：
荧光标记物配制：将所述COVID-19荧光标记物按照比例用标记物稀释液稀释，所述比例为：稀释液:T线标记物:C线标记物＝17:2:1；
探针溶液配制：将COVID-19探针用核酸溶解液稀释至10μM±5％，得到COVID-19探针溶液；
反应液配制：将稀释后的COVID-19荧光标记物和所述COVID-19探针溶液按1:1的体积比混合，得到COVID-19反应液；
反应液分装：将所述COVID-19反应液分装在反应管，并在温度18～28℃、湿度≤30％条件下干燥6～8小时。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括COVID-19阳性对照品的制备步骤：用阳性对照品稀释液将人工合成的COVID-19RNA稀释到2000TU/mL±5％；将稀释后的阳性对照品分装在可立管，并在温度18～28℃、湿度≤30％条件下干燥6～8小时。
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Pledgor: ANBIO (XIAMEN) PRODUCTS Inc.

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