CN105394086B - 一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应用，所述捕食线虫性真菌冻干制剂是将捕食线虫性真菌分离株进行厚垣孢子批量培养，然后0.04％～0.06％的灭菌吐温‑80洗脱、过滤制成0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液，接着用10％～20％的β‑环状糊精洗脱保护，最后经预冻、真空冷冻干燥后制成。本发明还包括捕食线虫性真菌口服生物制剂及其制备方法与应用。本发明之捕食线虫性真菌冻干制剂不仅可口服，节约成本，方便实施，而且更能够在保存、运输等环节保持良好活性，对厚垣孢子起到很好的保护作用。本发明制备方法不仅适合于保存菌种，更适合于规模化生产冻干制剂。

Description

一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种冻干制剂及其制备方法与应用，具体涉及一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应用。

背景技术

胃肠道线虫病是家畜最常见的寄生蠕虫病，呈全世界性分布，给畜牧产业造成严重的经济损失。长期以来主要依赖化学驱虫药来控制家畜胃肠道线虫，随着驱虫药的不断使用，线虫对驱虫药的抗药性不断地增强，以及造成环境污染、畜产品中化药的残留等问题。

捕食线虫性真菌是一类由营养菌丝特化形成捕食器捕捉线虫的真菌，它们是线虫的自然天敌，对线虫具有独特的捕获和致死能力，因此，利用食线虫真菌对家畜寄生线虫自由生活阶段的幼虫进行生物防治来替代化学驱虫剂是非常有潜力的防治手段。Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans是典型的能够产生三维粘性网的菌之一，该菌由于在培养的中后期能够产生大量的厚垣孢子，其双层壁的厚垣孢子对酸碱和消化酶有耐受性，可在通过动物的胃肠道时存活下来。正是由于这个特性，厚垣孢子可通过口服给家畜，然后与产生的虫卵随粪便一起排出体外，温度适宜时虫卵发育孵化出幼虫，厚垣孢子也随之萌发成菌丝，进而由线虫的刺激产生三维粘性网杀死线虫。

目前，Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans在动物线虫寄生的生物防治上进行了大量的研究，国内外已对捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans的菌丝团块或菌厚垣孢子制备成冻干制剂，例如现有技术CN201410227501.3中公开了一种捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法，将捕食线虫性真菌CIM菌株在大麦粒培养基上进行厚壁孢子的批量培养，然后用0.2％吐温洗脱并保护厚壁孢子，再分装灭菌、预冻、真空冷冻干燥后获得。该发明中吐温既可作分散剂也可充当保护剂，但吐温浓度太低对厚垣孢子的保护作用不明显，若浓度在5％以上虽能起到保护作用，但因粘度高无法冻干。至今研究尚未解决生防制剂的批量化生产、规格化和有效含量的标准化问题。因此，在动物寄生虫病防治中所面临的重要问题是，如何制备一种既能让家畜随草料口服，不被消化酶破坏；更能够在保存、运输等环节保持良好活性，减少对捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans厚垣孢子损伤的可规模生产的食线虫性真菌冻干制型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂，是将捕食线虫性真菌Arthrobotrys flagrans分离株进行厚垣孢子批量培养，然后0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱、过滤制成0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液，接着用10％～20％的β-环状糊精洗脱保护，最后经预冻、真空冷冻干燥后制成。

进一步，所述捕食线虫性真菌分离株SDH035，属于鞭式节丛孢(Arthrobotrysflagrans)，其保藏编号为CGMCC N0.11210，保藏日期为2015年8月31日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)孢子液的制备：将捕食线虫性真菌分离株在培养基(优选玉米和小麦联合谷粒培养基)上进行厚垣孢子批量培养15～45天，然后用0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱厚垣孢子，过滤(优选两层灭菌纱布过滤)，制成含厚垣孢子浓度为0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液；

(2)冻干保护剂的洗脱保护：将孢子液与等量10％～20％的β-环状糊精混合均匀；

(3)预冻、真空冷冻干燥：置于-20℃预冻过夜后，在冷阱温度-45～-50℃、真空度8～10Pa的条件下进行真空冷冻干燥14～18小时，即得捕食线虫性真菌口服生物制剂。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂在动物寄生线虫生物防治中的应用。

本发明之捕食线虫性真菌冻干制剂不仅可口服，节约成本，方便实施，而且更能够在保存、运输等环节保持良好活性，对厚垣孢子起到很好的保护作用。本发明制备方法不仅适合于保存菌种，更适合于规模化生产冻干制剂。

实验证明，本发明之捕食线虫性真菌冻干制剂在体外对三期幼虫的杀虫率可达97％以上。

附图说明

图1为冻干后的样品。1、不加保护剂的对照组；2.、加入5％β_环状糊精保护剂；3、加入10％β_环状糊精保护剂；4、加入15％β_环状糊精保护剂；5、加入20％β_环状糊精保护剂。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：捕食线虫性真菌冻干制剂的制备

(1)捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans分离株SDH 035的分离、纯化、分离鉴定

SDH035于2014年8月，从来源于宁夏吴忠地区羊粪堆所采的5份样品中采用改良的平板撒布法分离，分离时在平皿中加入绵羊线虫第三期幼虫作诱饵25℃孵化，每天或隔天在倒置显微镜下检查一次，持续3周，挑出单个的捕食结构或被捕食的线虫，转接入0.2％麸皮琼脂25℃培养3-14天，待有分生孢子长出后，挑取单个的分生孢子于另一个0.2％麸皮琼脂平皿中直至获得纯培养物。通过玻片插入法获得该菌株分生孢子的形态和数据测量，并提取该菌种的DNA，用引物ITS1和ITS4(white等1990和campos等2010)进行扩增rDNA中5.8S、ITS-1和ITS-2序列。其结果从5份样品15份平皿中分离纯化获得SDH035菌种一株，形态学和分子学鉴定该菌与A.flagrans相一致。SDH035的形态特征为：在2％玉米粉琼脂中菌落为白色，菌丝较为稀疏，菌丝透明、分隔、分枝，当培养至7天时就可产生大量的厚垣孢子，而分生孢子相对很少；分生孢子梗透明、直立、分隔，长117.5～387.5(平均为241.59)μm，基部宽５～7.5μm，端部宽2.5～5μm；分生孢子呈卵圆形、长卵圆形和椭圆形，以1个分隔为主，偶有2个分隔或3-4个分隔，0个分隔的也时常可见；分生孢子长20～57.5(平均为38.89)μm、宽10～17(平均为12.87)μm。此外，当28℃培养在玉米与小麦粒联合培养基，3天即可产生大量的圆形性、椭圆形的厚垣孢子(可达到6×10⁴个/克)，直径15～30(平均25.8)μm。

SDH035的主要生理、生物学特征为：该菌在12℃-35℃范围内能生长，最佳生长温度为28℃；在pH为2～13范围内能够生长，最佳生长pH值为9～10；生长的相对湿度在90％～100％为最佳；该菌在水琼脂上产生厚垣孢子而不产生分生孢子；厚垣孢子能够耐受紫外线照射12小时；干燥能引起厚垣孢子的萌发率快速下降；厚垣孢子能够耐受40～50℃水浴处理1小时，但60℃水浴作用30分钟后仅个别萌发，60℃以上作用30分钟后不能萌发。该菌与绵羊三期幼虫和秀丽新杆线虫互作后，产生三维粘性网并捕捉线虫。

(2)将捕食线虫性真菌分离株SDH035在玉米和小麦联合谷粒培养基上进行批量培养15～45d，然后用0.05％灭菌吐温-80洗脱厚垣孢子，用两层灭菌纱布过滤以除去一部分菌丝及大的杂质，制成菌液，用血细胞计数板计数，厚垣孢子浓度约为0.5×10⁶个/ml。

(3)将孢子液与等量的10％～20％的β-环状糊精(AR)在适合的容器中混合均匀。

(4)置于-20℃预冻过夜后，在冷阱温度-45～-50℃、真空度8～10Pa的条件下进行真空冷冻干燥(转移前半小时将冻干机制冷开关先打开，让冻干机腔内温度降到0℃以下)，菌液保护剂厚度约为0.5cm的情况下，冻干14～18小时(如果混合液厚度增加，时间可适度延长)，制得的冻干制剂成品呈疏松多孔略带微黄的酥饼状，见图1。

实施例2：冻干制剂的发芽率实验

称取实施1制备的适量冻干制剂加入到30ml灭菌蒸馏水中，将其稀释到1.5×10⁴个/ml厚垣孢子，吸取0.35～0.4ml涂布于水琼脂(WA)平板上25～26℃孵化，在孵化24小时后，用打孔器取琼脂培养物置载玻片上用棉蓝染液染色，逐一在光镜下观察计其厚垣孢子发芽数和不发芽数(直接将平皿置倒置显微镜观察，经试验很难得到较准确的计数结果)，根据预测样本容量大小公式：来预测样本容量，计数孢子总数要大于＞2000个。另外，经反复试验刚洗下的厚垣孢子24小时时的发芽率一般在8％～20％，此后发芽率随时间延长而增加，但3天后由于菌丝交织，很难计数准确，故试验中一律采用孢子孵化24小时计算其发芽率。

(1)试验1

实验组：用不同浓度的甘油和β-环状糊精各取15ml+SDH 035厚垣孢子15ml，在同一冻干温度和真空度下冻干15小时制成冻干制剂。

对照组：用灭菌蒸馏水(15ml)+SDH 035厚垣孢子(15ml)在同一冻干温度和真空度下制备成冻干制剂。

空白对照组：刚用蒸馏水洗下的厚垣孢子。

实验结果见表1，由表1可知，实验组中2％甘油不仅冻干时间长，而且发芽率远低于空白对照，5％～10％的甘油冻干时间也超长，且不能冻干；而实验组中10％～20％的β_环状糊精作保护剂冻干后孢子的发芽率与空白对照组无显著差异，且冻干时间短。

表1-试验1孢子孵化24h发芽率的结果

(2)试验2

试验方法同上，保护剂为脱脂奶粉和吐温-80，结果见表2。由表2可知，脱脂奶粉组发芽率远低于空白对照；5％～15％的吐温-80冻干时间较长，均不能达到冻干的目的。

表2-试验2孢子孵化24h发芽率的结果

(3)试验3

试验方法同上，保护剂为蔗糖和海藻糖，结果见表3。

表3-试验3孢子孵化24h发芽率的结果

由表3可知，5％～20％的蔗糖冻干后发芽率远低于空白对照；5％～20％的海藻糖冻干时间较长，发芽率同样远低于空白对照。

(4)试验4

试验方法同上，对不同浓度的吐温-80进行了试验，结果见表4。

由表4可知，0.2％～2％冻干后发芽率低于空白对照。

表4-试验4孢子孵化24小时发芽率的结果

综上表明，加入保护剂脱脂奶粉、甘油、蔗糖、海藻糖，冻干后对分离株SDH 035的厚垣孢子效果不佳或没有保护作用；对于吐温_-80，当浓度为5％以下时，保护效果不佳，2％以下时达不到保护效果，而浓度为5％以上时则达不到冻干的目的。而10％～20％的β_环状糊精作保护剂冻干后孢子的发芽率与空白对照组无显著差异，而且能够冻干，效果优于吐温。

实施例3：冻干制剂的杀虫率实验

将冻干制剂用灭菌蒸馏水稀释成1×10⁶/ml个厚垣孢子的悬液，试验时称取人工感染捻转血矛线虫和蛇形毛圆线虫绵羊的新鲜粪便10g放入直径为4.5cm的培养皿中，然后加入1ml试验菌液使之与粪便混合均匀，根据粪便的干湿度补充适量蒸馏水和锯末，将小平皿放入一个直径为9cm的较大平皿中，并加蒸馏水2ml。实验组三个平行，并设立相同数量的未加真菌孢子的平皿为对照组，26℃避光培养12天，然后贝尔曼法收集三期幼虫(L3)和L3计数。上述实验重复2次。

体外杀虫效果见表5。

表5-冻干制剂对粪便中L3的体外捕杀效果

次数	试验组L3平均数	对照组L3平均数	杀虫率
				1	153	5869	97.39％
2	112	4030	97.22％

由表5可知，冻干制剂在体外对L3的杀虫率分别为97.39％、97.22％。结果表明，本发明制备的冻干后菌种的捕食性能未发生变化，杀虫效果良好。

Claims (5)

1.一种捕食线虫性真菌冻干制剂，其特征在于，是将捕食线虫性真菌分离株进行厚垣

孢子批量培养，其中捕食线虫性真菌SDH035分离株保藏编号为：CGMCC NO.11210，然后采用0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱、过滤制成 0.3～0.6×10⁶个/mL的孢子液，接着用与孢子液等量的10％～20％β-环状糊精洗脱保护，最后经预冻、真空冷冻干燥后制成捕食线虫性真菌冻干制剂。

2.一种如权利要求1所述的捕食线虫性真菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 孢子液的制备：将捕食线虫性真菌分离株在培养基上进行厚垣孢子批量培养 15～ 45 d，然后用0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱、过滤，制成含厚垣孢子浓度为 0.3～0.6×10⁶个/mL的孢子液；

(2) 冻干保护剂的洗脱保护：将孢子液与等量10％～20％的β-环状糊精混合均匀；

(3)预冻、真空冷冻干燥：置于-20 ℃预冻过夜后，在冷阱温度-45～-50 ℃、真空度8～10 Pa的条件下进行真空冷冻干燥14～18 h，即得捕食线虫性真菌冻干制剂。

3.根据权利要求2所述的捕食线虫性真菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养基为玉米和小麦联合谷粒培养基。

4.根据权利要求2所述的捕食线虫性真菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过滤采用两层灭菌纱布过滤。

5.根据权利要求1所述的捕食线虫性真菌冻干制剂在动物寄生线虫生物防治中的应用。