RU2665547C1 - Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами - Google Patents
Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665547C1 RU2665547C1 RU2017117228A RU2017117228A RU2665547C1 RU 2665547 C1 RU2665547 C1 RU 2665547C1 RU 2017117228 A RU2017117228 A RU 2017117228A RU 2017117228 A RU2017117228 A RU 2017117228A RU 2665547 C1 RU2665547 C1 RU 2665547C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- strain
- free culture
- plants
- bacillus subtilis
- Prior art date
Links
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 50
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 30
- 239000004460 silage Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 title claims description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title abstract description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 title description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 32
- 239000012532 cell-free culture fluid Substances 0.000 claims description 17
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 13
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 11
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 22
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 9
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 9
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 8
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 7
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 6
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 6
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 3
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 3
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 241000208474 Protea Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003324 growth hormone secretagogue Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Предложена группа изобретений: бесклеточная культуральная жидкость штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 и применение ее в качестве полифункционального средства для растений и консерванта для силоса. Бесклеточную культуральную жидкость получают путем отделения клеточной массы от жидкости центрифугированием при 600 об/мин в течение 20 минут. Полученная бесклеточная культуральная жидкость обладает антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, и применяется в качестве полифункционального средства для растений. Указанная бесклеточная культуральная жидкость применяется также в качестве консерванта для силоса. Группа изобретений позволяет повысить выход сельскохозяйственных растений и повысить усвояемость растительного сырья для животных. 3 н.п. ф-лы, 11 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии при применении штамма Bacillus subtilis 3Н [RU 2067616, опубл. 10.10.96], основы препарата-пробиотика «Бактиспорин» [RU 2130316, опубл. 20.05.1999], при этом являющимся также антагонистом патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных, а также продуцентом гидролитических ферментов (амилазы, протеазы, целлюлазы) и литических ферментов, а также бесклеточной культуральной жидкости на его основе.
В настоящее время препараты на основе живых бактерий рода Bacillus, находят широкое применение в различных областях. Поскольку эти бактерии вырабатывают большой спектр антибиотических веществ, они используются в качестве пробиотиков в медицине и ветеринарии (БАКТИСПОРИН [RU 2130316, опубл. 20.05.1999], СПОРОЛАКТ [RU 2035186, опубл. 20.05.1995], СПОРОБАКТЕРИН [WO 8909607, опубл. 19.10.1989], СУБАЛИН [RU 2035185, опубл. 31.01.1992], БИОСПОРИН [SU1722502, опубл. 30.03.19], лечебно-профилактических кормовых добавках (МОНОСПОРИН, ЦЕЛЛОБАКТЕРИН, БАЦЕЛЛ), а также в составе биофунгицидов для защиты растений от болезней (ФИТОСПОРИН [RU 2099947, опубл 25.12.1997].
В связи с выработкой большого набора гидролитических ферментов обосновано их применение в пищевой промышленности в качестве биологически активных добавок (далее - БАД), содержащих ферменты растительного или микробного происхождения (БАКТИСТАТИН), и применение в сельском хозяйстве в качестве силосных заквасок (БИОТРОФ).
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 (RU 2298032, опубл. 27.04.2007), выделенный в естественных условиях в микробиологической лаборатории ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Штамм проявляет широкий спектр антагонистической активности, низкую адгезивную активность, иммуномодулирующую активность, продуцирует комплекс гидролитических ферментов, таких как липаза, протеаза, амилаза.
Штамм Bacillus subtilis 3Н известен как антагонист возбудителей заболеваний желудочно-кишечного тракта у человека и предложен в качестве основы препарата-пробиотика «Бактиспорин» для лечения дисбактериоза у людей [RU 2067616, опубл. 10.10.1996, RU 2130316, опубл. 23.01.1997].
Однако применение штамма Bacillus subtilis 3Н и получаемой на его основе культуральной жидкости может быть гораздо шире благодаря сочетанию у штамма ряда полезных свойств.
Дальнейшие исследования свойств штамма показали, что штамм обладает способностью к выработке широкого круга гидролитических ферментов, в том числе целлюлазы, амилазы, протеазы, а также внеклеточных литических ферментов.
Гидролитические ферменты, способствующие расщеплению питательных субстратов и усвоению кормов, играют важную роль в обмене веществ у сельскохозяйственных животных. В настоящее время в условиях промышленного содержания животных и ускоренного роста высокопородистых рас и кроссов, у промышленных видов животных и птицы отмечается выраженная ферментопатия (недостаточный уровень выработки пищеварительных ферментов).
В связи с вышеизложенным большое значение имеет наличие продукции гидролитических ферментов у штаммов бактерий Bacillus subtilis, входящих в состав разрабатываемых кормовых добавок, как на основе бактериальной массы, так и на основе бесклеточной культуральной жидкости, содержащей внеклеточные метаболиты, в том числе гидролитические ферменты и другие биологические вещества.
Проблемой, которую решает настоящее изобретение, является выявление у штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н свойств по продуцированию ферментов и антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных, и получение бесклеточной культуральной жидкости на его основе для создания средств, обладающих биологической активностью.
Решение технической проблемы достигается тем, что у штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н выявлены свойства продуцента литических и гидролитических ферментов, таких как амилаза, протеаза, целлюлаза, и антагониста в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных. Штамм Bacillus subtilis 3Н депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России, г. Москва, под регистрационным номером В-12758. Дата депонирования 10.01.2017 г.
Решение технической проблемы достигается также тем, что у бесклеточной культуральной жидкости, полученной отделением клеточной массы из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758, выявлены свойства антагониста в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных, а также амилолитическая, протеолитическая и целлюлозолитическая активность.
Бесклеточную культуральную жидкость получают отделением клеточной массы посредством центрифугирования культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 при 6000 об/мин в течение 20 минут.
Бесклеточная культуральная жидкость применима в качестве полифункционального средства для растений, обладающего фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами. Возможно применение бесклеточной культуральной жидкости в качестве консерванта для силоса.
Штамм В. subtilis 3Н получен в результате селекции штамма Bacillus subtilis 534 (основы препарата-пробиотика Споробактерин) на устойчивость к антибиотику рифампицину сотрудниками НИИВС им. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат» г. Уфа. Штамм Bacillus subtilis 3Н проявляет устойчиость к антибиотикам: рифампицину, стрептомицину, пенициллину, линкомицину, обладает антагонистической активностью в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: подавляет рост стафилококков, протея, патогенной кишечной палочки, сальмонелл, шигелл, дрожжевых грибов, стрептококков и синегнойной палочки. Идентификация штамма проведена сотрудниками НИИВС им. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат», г. Уфа, путем изучения морфологических, культуральных, биохимических свойств штамма согласно «Определителю бактерий Берджи» М.: Мир, 1997. Bacillus subtilis 3Н - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. Хорошо растут на простых питательных средах. На мясопептонном агаре, среде Гаузе №2 культура растет в виде шероховатой пленки беловато-бежевого цвета или образует единичные шероховатые колонии розовато-бежевого цвета с фестончатыми краями. Может образовывать до 20% гладких белых или прозрачных колоний.
На мясопептонном бульоне культура растет в виде беловатой пленки и придонного осадка, вызывая незначительное помутнение среды. Оптимальная температура для роста микроба (37±1)°С.
Штамм продуцирует протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Ферментирует глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, маннит без образования газа, мальтозу, не ферментирует лактозу. Гидролизует крахмал, казеин, мочевину, не расщепляет тирозин, утилизирует цитрат, образует аммиак и сероводород, не образует индол. Не растет в анаэробных условиях. Штамм Bacillus subtilis 3Н - невирулентен, нетоксичен и нетоксигенен.
Для изучения уровня гидролитических ферментов, вырабатываемых популяцией штамма Bacillus subtilis 3Н в процессе своего роста, провели выращивание биомассы в ферментере с отбором культуральной жидкости по часам выращивания. Культуральная жидкость штамма Bacillus subtilis 3Н содержала бактериальные клетки, метаболиты и остатки питательной среды. Для отделения экзометаболитов от клеточной бактериальной массы проводили центрифугирование культуральной жидкости при 6000 об/мин в течение 20 минут, таким образом, получали «культуральный супернатант» или бесклеточную культуральную жидкость.
Выращивание биомассы бактерий штамма Bacillus subtilis 3Н проводили методом периодического гомогенного глубинного культивирования на жидкой полусинтетической питательной среде, содержащей соли и пептон, в условиях аэрации и перемешивания. Выращивание проводили в течение 20 часов при температуре 37°С.
Проводили исследования уровня накопления гидролитических ферментов по часам культивирования в культуральной жидкости и бесклеточном культуральном супернатанте.
Для изучения целлюлозолитической активности из фильтровальной бумаги (источник целлюлозы) нарезают полоски размером 1,5×10 см, полоски взвешивают.
В каждую пробирку с культуральной жидкостью или культуральным супернатантом (источником фермента целлюлазы) по часам культивирования помещали полоски фильтровальной бумаги и инкубировали при 37°С в течение 24 ч.
После 24-часовой инкубации извлекали полоски фильтровальной бумаги, промывали, высушивали и взвешивали. По потере в весе полосок фильтровальной бумаги определяли целлюлозолитическую активность культуральной жидкости (Н.В. Курилов, Н.А. Севастьянова, В.Н. Коршунов и др. Изучение пищеварения у жвачных. Методические указания, Боровск, 1979, С. 64).
Данные по изучению уровня целлюлозолитической активности культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н и бесклеточной культуральной жидкости, полученной в процессе гомогенного глубинного культивирования на полусинтетической среде с пептоном, представлены в табл.1 и 2.
*3а единицу целлюлозолитической активности принимали снижение веса бумаги на 0,001 г. Испытания каждого образца культуральной жидкости проводили в трех повторностях.
Как показали проведенные исследования, целлюлозолитическая активность культурального супернатанта не ниже значений культуральной жидкости, содержащей бактерии. Таким образом, целлюлозолитические ферменты являются экзометаболитами бактерий штамма и культуральный супернатант можно использовать в кормовых пробиотических добавках.
С целью изучения продукции протеазы использовали агаризованный 2% раствор казеина на 0,1 М трис -НС1 буфере (ph 7-8).
Буфер подогревали до 55°С и смешивали в равных объемах с расплавленным раствором 2% агара, охлажденного до той же температуры. Полученный казеиновый агар разливали в условиях стерильности по 10 мл в стерильные чашки Петри и остужали. После застывания агара, делали лунки металлическим пробойником с диаметром 7 мм и вносили в лунку культуральную жидкость, содержащую метаболиты штамма вместе с бактериальными клетками, или бесклеточную культуральную жидкость штамма Bacillus subtilis и инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-24 часов. По окончанию инкубации в чашки наливали по 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и наблюдали в течение 3 мин за появлением прозрачных зон гидролиза вокруг посевов штамма бактерий в агаре. Результаты исследований представлены в табл.3.
Как показали проведенные исследования, в бесклеточной культуральной жидкости содержатся протеолитические ферменты в том же количестве, что и в культуральной жидкости, содержащей бактерии.
С целью изучения продукции амилазы штаммом бактерий Bacillus subtilis 3Н, готовили картофельный агар и разливали в чашки Петри.
Для этого, картофель промывали, нарезали ломтиками, заливали водой из расчета 130 г на 1 л воды, кипятили 30 мин, фильтровали и к фильтрату добавляли 20 г агара и 2 г натрия хлористого. Нагревали фильтрат, помешивая стеклянной палочкой до полного расплавления агара, разливали в пробирки по 10 мл, укупоривали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали в автоклаве 30 мин при 110°С.
Готовый картофельный агар разливали по 10 мл в стерильные чашки Петри. После застывания агара стерильным пробойником вырезали лунки размером 7 мм в диаметре и вносили культуральную жидкость штамма бактерий Bacillus subtilis или культуральный супернатант. Инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-24 часов.
После инкубации в чашки вносили по 5 мл 10% раствор йода и оценивали прозрачную зону гидролиза крахмала ферментом амилазой (табл. 4).
Как показали проведенные исследования, в бесклеточной культуральной жидкости содержатся амилолитические ферменты в том же количестве, что и в культуральной жидкости, содержащей бактерии.
Выработка гидролитических ферментов бактериями штамма Bacillus subtilis 3Н, способствуют улучшению обмена веществ у животных, поэтому могут увеличивать привесы при использовании культуральной жидкости штамма или его бесклеточного культурального супернатанта.
Провели исследования по оценке влияния культуральной жидкости (далее - к/ж) и культурального супернатанта (далее - к/с) штамма Bacillus subtilis 3Н на массу тела у мышей при пероральном введении.
Постановка опыта: мышам вводили «к/ж» и «к/с» (иначе - препарат) перорально по 0,2 мл препарата в течение 5 суток. Последующие 5 суток мышам препарат не вводили.
Вес измеряли групповым методом трехкратно: исходный вес (до начала ввода препарата), через 5 суток (по окончании ввода препарата) и через 10 суток (конец испытаний).
- привес 5 мышей в группе за 5 суток (разница веса мышей в исходном состоянии и после приема препарата);
5 суток - ежедневный прием препарата;
Последующие 5 суток без введения препарата (эффект последействия)
К1, К2 - контрольные группы - назначение физиологического раствора. Данные представлены в табл. 5.
Как следует из полученных данных, пероральное введение культуральной жидкости (к/ж) и культурального супернатанта (к/с) штамма Bacillus subtilis 3Н повышало привесы у мышей. Культуральный супернатант положительно влиял на обмен веществ даже в большей степени нежели культуральная жидкость, возможно в виду того, что бесклеточный супернатант не вызывает напряжения иммунитета у животных, которое способны оказать бактерии.
Поскольку штамм бактерий Bacillus subtilis 3Н предлагался к использованию в медицине (RU 2130316, опубл. 20.05.1999) не было проведено изучение спектра его антагонистической активности на возбудителей заболеваний у животных и на фитопатогенные штаммы грибов и бактерий, вызывающие заболевания растений. С целью изучения возможности использования штамма Bacillus subtilis 3Н в составе биологических фунгицидов, проведено изучение его антагонистической активности в отношении фитопатогенных возбудителей заболеваний у растений (табл. 6) и животных (табл. 7).
Исследование 20-часовой бактериальной культуральной жидкости штамма В. subtilis 3Н осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей по диагонали в центре чашки Петри с агаризованной картофельно-глюкозной средой. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельно-глюкозной средой без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов испытания культуральной жидкости штамма представлены в табл.6, 7.
Для изучения наличия литических ферментов в бесклеточном культуральном супернатанте штамма Bacillus subtilis 3Н провели испытания к/с в отношении тест-штаммов патогенных бактерий и грибов. Испытания проводили на чашках с картофлельно-глюкозным агаром, в котором пробойником диаметром 7 мм, делалось 2 ряда лунок по 3 лунки в каждом ряду с расстоянием между рядами 5 см.
В каждую чашку между лунками сеяли штрихом тест штаммы, в лунки с двух краев штриха помещали культуральный супернатант штамма. В контрольных чашках в лунки помещали физиологический раствор. Помещали чашки в термостат при 37°С. Учет результатов по грибным тест-штаммам проводили через 48-72 ч инкубирования, по бактериальным тест-штаммам - через 18-24 часа. Результат оценивали по величине зоны отсутствия роста тест-культур между 2 лунками. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельно-глюкозной средой без «к/с» исследуемого штамма. Полное отсутствие роста соответствовало - 50 мм зоны задержки роста.
Из данных табл. 6 следует, что штамм В. subtilis 3Н и культуральный супернатант (внеклеточные метаболиты) на его основе обладают широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающих заболевания растений и могут применяться в составе биофунгицидов и биобактериоцидов для защиты растений от заболеваний.
Из данных табл. 7 следует, что штамм В. subtilis 3Н и культуральный супернатант (внеклеточные метаболиты) на его основе обладают широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающих заболевания у животных, и могут быть использованы в составе ветеринарных препаратов - пробиотиков или пробиотических лечебно-профилактических кормовых добавках.
Для оценки влияния «к/ж» и «к//с» штамма В. subtilis 3Н на микробиоценоз кишечника животных, проведено изучение перорального введения 20 часовой культуральной жидкости, содержащей 0,6×109 клеток/ бактерий в объеме 0,5 мл и 20 часового бесклеточного культурального супернатанта в дозе 0,5 мл. Бесклеточный культуральный супернатант (к/с) содержал только внеклеточные метаболиты штамма и не содержал живых бактерий.
Влияние «к/ж» и «к/с» штамма В. subtilis 3Н на микробиоценоз кишечника изучалось на группах по 10 белых опытных крыс, которых в течение 30 дней поили «к/ж» и «к/с» штамма В. subtilis 3Н в дозе по 0,5 мл на 1 крысу однократно. 10 контрольных животных получали адекватный объем физиологического раствора. Перед началом исследований и по окончании опыта фекалии животных в виде разведений в соответствии МУ (Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника. Метод. Рекомендации. Сост. проф. Р.В. Эпштейн-Литвак, д-р мед. наук Ф.Л. Вильшанская; М-во здравоохранения РСФСР, Гл. упр. НИИ и координации науч. исследований. - Москва: [б.и.], 1977) высевались на селективные и дифференциально-диагностические среды для определения основных групп микроорганизмов, обитающих в кишечнике. Данные по исследованию микробиоценоза кишечника представлены в табл. 8 и 9.
Из данных табл. 8 и 9 следует, что применение «к/ж» и «к/с» штамма В. subtilis 3Н у животных вызывает нормализацию кишечной микрофлоры у крыс опытной группы: увеличивается на порядок содержание бифидо- и лактобактерий, снижается количество условно-патогенной микрофлоры, в том числе стафилококков, энтерококков и дрожжеподобных грибов.
Таким образом можно заключить, что как бактериальная суспензия штамма В. subtilis 3Н, так и его бесклеточная культуральная жидкость (внеклеточные метаболиты штамма) проявляет пробиотические свойства. Поэтому можно использовать как культуру штамма В. subtilis 3Н, так и его метаболиты, содержащиеся в бесклеточной культуральной жидкости для создания пробиотических препаратов, кормовых добавок и силосных заквасок.
Таким образом, исходя из полученных, данных можно использовать штамм В. subtilis 3Н и его бесклеточную культуральную жидкость (внеклеточные метаболиты штамма) по новому назначению: в составе биофунгицидов и биобактерицидов в растениеводстве, в составе ветеринарных пробиотиков в ветеринарии, в составе лечебно-профилактических кормовых добавках и силосных заквасок в животноводстве, и в составе биологически активных добавок на основе внеклеточных метаболитов штамма.
Пример 1. Пример использования штамма В. subtilis 3Н в качестве консерванта для силоса.
Для изучения способности культуры штамма В. subtilis 3Н к силосованию, были поставлены модельные опыты по силосованию измельченной кукурузы. Для опытов использовали 20-часовую культуральную жидкость штамма В. subtilis 3Н и 20-часовой бесклеточный культуральный супернатант штамма В. subtilis 3Н. Опыт проводили в 3-х литровых банках в сравнении с известным консервантом для силоса - Биотроф 111.
Исходное сырье для силосования сырье получено в Чишминском районе Башкирии. Зеленая масса была измельчена, разложена тонким слоем на бумаге. По технологии применения Биотрофа 111, производили предварительное разведение консервантов в 600 раз (0,1 мл + 60 мл воды). Из раствора брали 5 мл консерванта разведенного и вносили в 45 мл воды. В распылитель наливали изучаемый консервант и опрыскивали из распылителя в дозе 0,1 мл на 1 кг зеленой массы (по технологии).
Зеленую массу закладывали в 3-х литровые банки. Каждый вариант закладки опыта с препаратом проводили в 3-х повторностях. Банки закрывали полиэтиленовыми крышками и помещали в темное место без прямого солнечного света.
Через 1 месяц определяли основные показатели качества силоса из заложенных вариантов согласно ГОСТ 23638-90 «Силос из зеленых растений». Данные приведены в таблице №10.
Как следует из полученных результатов, применение культуральной жидкости штамма В. subtilis 3Н в качестве консерванта для силоса не уступает по эффективности Биотрофу 111 и даже несколько превосходит его по показателям качества, при использовании культуральной жидкости В. subtilis 3Н с концентрацией микробных клеток 1×108 кл/мл. Использование бесклеточного культурального супернатанта показывает чуть меньшую эффективность, чем культуральная жидкость, но также показатели лучше контроля и препарата «Биотроф».
Пример 2. Пример использования культуральной жидкости и бесклеточного культурального супернатанта штамма В. subtilis 3Н в качестве биофунгицида и ростстимулятора на проростках пшеницы.
Биологическю эффективность штамма В. subtilis 3Н подавлять инфекцию и стимулировать рост растений оценивали на проростках пшеницы методом рулонов (ГОСТ 12044-93).
Для проведения опыта использовали зерна мягкой яровой пшеницы сорта «Омская 35». Эффективность действия определили при проращивании обработанных культуральной жидкостью и бесклеточным культуральным супернатантом семян во влажных рулонах фильтровальной бумаги и полиэтилена.
Для определения биологической эффективности действия рулонным методом отобрали по 155 семян (50 семян в 3-х повторах) для каждого опыта.
Для проращивания семян использовали 1 слой увлажненной фильтровальной бумаги шириной 15 см и длиной 110 см. Семена пшеницы сорта «Омская 35» обрабатывают 54 мкл воды и исследуемыми препаратами. Время обработки 2 часа.
Полиэтиленовые рулоны стерилизуют 70%-ным спиртом. На этикетке записывают название культуры, сорта, номер опыты, дату закладки образца. Сверху кладут увлажненную фильтровальную бумагу, с правого края для возгонки воды используют полоску фильтровальной бумаги шириной 3 мм.
Семена пшеницы раскладывают в одну линию с интервалом 1 (2) см и на расстоянии 2-3 см от верхнего и боковых краев бумаги зародышами вниз.
Разложенные на бумаге семена накрывают такой же полоской увлажненной фильтровальной бумаги и сворачивают в рулон. Рулоны ставят вертикально в контейнеры с водой и помещают в термостат при температуре 22°С-25°С на 5 дней. При проращивании семян не допускают подсыхания рулонов. Затем рулоны выставляют на светоплощадку на 2 дня.
Спустя неделю после постановки опыта снимают следующие морфометрические показатели (вносят эти параметры в соответствующие таблицы):
а) длина корешка; б) длина ростка; в) количество корешков.
На основании фитоэкспертизы определяется суммарная инфекция, степень зараженности семян головневыми болезнями, уровень поражения проростков корневыми гнилями фузариозной или гельминтоспориозной этиологии.
Биологическая эффективность применения фунгицидов оценивается снижением количества пораженных растений степени поражения органов растения и снижением развития болезни. Учет процента развития болезни и степени повреждения растений проводят согласно принятым методикам.
Для расчета процента пораженных растений (распространенность болезни) пользуются формулой:
где p - распространенность болезни (%), П - количество больных растений в пробе, N - общее количество растений в пробе.
Расчет процента пораженных растений или их органов проводят при учете эффективности применения фунгицидов в борьбе с болезнями, которые обуславливают гибель растений или тех его частей, которые составляют урожай (головня, корневые гнили, увядание).
Для определения биологической эффективности при проведении обработок против заболеваний, которые приводят к снижению урожая в зависимости от интенсивности их проявления (пятнистости, налеты) вначале ведут расчет степени развития болезни по формуле 2:
где R - процент развития болезни, Σ а × б - сумма произведений числа растений на соответствующий им балл (%) поражения, N - общее количество учетных растений, листьев, плодов и т.д., К - наивысший балл (%) шкалы, по которой проводилась оценка поражений.
Расчет процента снижения пораженных растений (биологическая эффективность) возбудителями болезней на обработанных фунгицидами участках по отношению к контролю проводят по формуле 3.
где Бэф. - биологическая эффективность фунгицидов в процентах; Рк - показатель развития или распространения болезни на контроле; Ро - показатель развития или распространения болезни в опыте
Данные по биологической эффективности и ростстимулирующей активности приводятся в таблице 11.
В качестве контроля биологической эффективности использовали коммерческий биологический фунгицид «Фитоспорин МЖ».
Как следует из результатов опыта культуральная жидкость штамма В. subtilis 3Н и его бесклеточный культуральный супернатант могут быть использованы для создания биофунгицидов, поскольку проявляют биологическую активность по подавлению инфекции и обладают ростстимулирующей активностью.
Claims (3)
1. Бесклеточная культуральная жидкость, полученная отделением клеточной массы из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 20 мин.
2. Применение бесклеточной культуральной жидкости по п. 1 в качестве полифункционального средства для растений, обладающего фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами.
3. Применение бесклеточной культуральной жидкости по п. 1 в качестве консерванта для силоса.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017117228A RU2665547C1 (ru) | 2017-05-17 | 2017-05-17 | Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017117228A RU2665547C1 (ru) | 2017-05-17 | 2017-05-17 | Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2665547C1 true RU2665547C1 (ru) | 2018-08-30 |
Family
ID=63459794
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017117228A RU2665547C1 (ru) | 2017-05-17 | 2017-05-17 | Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2665547C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2751792C1 (ru) * | 2020-05-12 | 2021-07-16 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-внедренческое предприятие "БашИнком" | Наполнитель для домашних животных (варианты) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2067616C1 (ru) * | 1995-04-25 | 1996-10-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Штамм бактерий bacillus subtilis, несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения препарата "бактиспорин" |
RU2130316C1 (ru) * | 1997-01-23 | 1999-05-20 | Государственное предприятие НПО. "Иммунопрепарат" | Лечебно-профилактический биопрепарат "бактиспорин" |
RU2298032C2 (ru) * | 2005-04-19 | 2007-04-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 1719-ПРОДУЦЕНТ АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ В ОТНОШЕНИИ БОЛЕЗНЕТВОРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, А ТАКЖЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ, АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ |
RU2539762C1 (ru) * | 2013-09-19 | 2015-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-внедренческое предприятие "БашИнком" | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ К РАСЩЕПЛЕНИЮ САХАРОВ И АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ. |
RU2595405C1 (ru) * | 2015-11-19 | 2016-08-27 | Акционерное общество "Щёлково Агрохим" | ШТАММЫ БАКТЕРИЙ РОДОВ Bacillus, Pseudomonas, Rahnella, Serratia, ОБЛАДАЮЩИЕ ФИТОПРОТЕКТОРНОЙ И РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ |
-
2017
- 2017-05-17 RU RU2017117228A patent/RU2665547C1/ru active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2067616C1 (ru) * | 1995-04-25 | 1996-10-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Штамм бактерий bacillus subtilis, несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения препарата "бактиспорин" |
RU2130316C1 (ru) * | 1997-01-23 | 1999-05-20 | Государственное предприятие НПО. "Иммунопрепарат" | Лечебно-профилактический биопрепарат "бактиспорин" |
RU2298032C2 (ru) * | 2005-04-19 | 2007-04-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 1719-ПРОДУЦЕНТ АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ В ОТНОШЕНИИ БОЛЕЗНЕТВОРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, А ТАКЖЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ, АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ |
RU2539762C1 (ru) * | 2013-09-19 | 2015-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-внедренческое предприятие "БашИнком" | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ К РАСЩЕПЛЕНИЮ САХАРОВ И АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ. |
RU2595405C1 (ru) * | 2015-11-19 | 2016-08-27 | Акционерное общество "Щёлково Агрохим" | ШТАММЫ БАКТЕРИЙ РОДОВ Bacillus, Pseudomonas, Rahnella, Serratia, ОБЛАДАЮЩИЕ ФИТОПРОТЕКТОРНОЙ И РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ХАЗИЕВ А.Ф. Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis, Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М., 2004, с.4-21. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2751792C1 (ru) * | 2020-05-12 | 2021-07-16 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-внедренческое предприятие "БашИнком" | Наполнитель для домашних животных (варианты) |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107312726B (zh) | 一株植物乳杆菌zn-3及应用 | |
JP6793633B2 (ja) | 産業的使用のための細菌芽胞組成物 | |
US5667779A (en) | Fungal inhibiting composition comprising Bacillus subtilis FERM BP-3418 | |
CN106399159B (zh) | 一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用 | |
CN113278540B (zh) | 一种蜡样芽孢杆菌菌株yn917及其应用 | |
CN1494374A (zh) | 细菌菌株,加工过的植物提取物,含有它们的组合物,其制备方法及其治疗和工业应用 | |
CN101677595A (zh) | 动物用饲料添加剂 | |
CN105524855B (zh) | 一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用 | |
CN1057563C (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 | |
KR20130101370A (ko) | 유산균이 함유된 양봉 사료 및 이의 제조방법 | |
CN105994937A (zh) | 一种绿色富有机硒饲料及其制备方法 | |
CN106566788B (zh) | 利用耐银土壤芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用 | |
CN103098980A (zh) | 一种微生物秸秆饲料发酵剂 | |
JP2010136668A (ja) | 新規シュウドモナス属細菌 | |
JP2008048683A (ja) | 動物用生菌剤、飼料組成物、及びこれらの使用方法 | |
RU2665547C1 (ru) | Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами | |
RU2415604C2 (ru) | Способ приготовления силоса | |
RU2539762C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ К РАСЩЕПЛЕНИЮ САХАРОВ И АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ. | |
CN110897053B (zh) | 一种改善蛋鸡鸡蛋品质的驱蝇中药发酵饲料及其制备方法与用途 | |
CN104604503B (zh) | 一种生物防治抗红景天根腐病及促生的方法 | |
CN1177637A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌活菌制剂及其制做方法 | |
CN104620817B (zh) | 一种青稞生物防治抗病促生方法 | |
Tsugkieva et al. | Effect of feeding Yeast obtained from Sakhalin Buckwheat on the growth of broiler chickens. | |
RU2493723C1 (ru) | Биопрепарат с пробиотической активностью для оптимизации усвоения кормов, предназначенных для сельскохозяйственных животных и птицы | |
RU2542484C1 (ru) | Способ стимулирования роста сельскохозяйственных культур |