CN1197955C - 一种提高真菌菌剂在土壤中生长和繁殖能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高真菌菌剂在土壤中生长和繁殖能力的方法，属生物农药技术领域。本发明先用水将营养物质稀释，稀释倍数十倍到一百倍，营养物质的成分是以下成分中的一种或其中任何两种或两种以上成分按任何比例的混合：糖蜜，玉米浆，玉米芯，红薯粉，大豆粉，葡萄糖，蔗糖，柠檬酸，十八烷酸。将稀释后的营养物质与厚垣孢轮枝孢ZK7菌株制成的菌剂按1-50∶1的体积比混合，之后在18-30℃下放置20-50小时后施入土壤。本发明工艺简单，成本低，效率高，利用此方法可以提高生防制剂的菌体在大田土壤中的生长和繁殖能力，从而提高厚垣孢轮枝孢菌剂对植物病原线虫的田间防效。
Description
技术领域：
本发明涉及一种提高真菌菌剂在土壤中生长和繁殖能力的方法，属生物农药技术领域。
背景技术：
“土壤抑菌作用，fungistasis of soil”是指在自然土壤中或与土壤相接触的微生物繁殖体(包括真菌、细菌、放线菌等)的萌发受到抑制的现象。抑菌作用对细菌、放线菌、真菌都存在，但以真菌最为敏感，它可使微生物的繁殖体在土壤中保持很长时间的休眠状态(Lockwood，1977)。当用生防菌剂在土壤中或土壤表面对植物病虫害进行防治时，由于受到土壤抑菌作用的影响，生防菌在土壤中或土壤表面上不能萌发或萌发率很低，一般萌发率低于30％，从而大大降低生防菌剂在田间的防治效果。目前的研究已经表明通过营养物质的添加可以部分或完全解除土壤抑菌作用(Lockwood，1964；Emmatty & Green，1967；Lockwood，1977)，从而提高生防菌剂的防治效果。
厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium是用于防治植物寄生线虫的常用生防菌。目前国内外利用这种真菌开发的生防菌剂在国内外都已经商品化。对于解除土壤抑菌作用这一问题现在普遍采用的方法是将发酵后的菌体及发酵罐中残余的培养基直接用吸附剂吸附后烘干，然后做成产品，达到利用残余培养基中的的营养物质解除土壤抑菌作用的目的。这种方法有以下缺点：由于所用的培养基成分经微生物的转化以后，培养基中的营养成分发生变化。这些营养成分虽然可以部份解除土壤抑菌作用，提高菌体的萌发力。但这些营养成分未经过筛选，也可以解除土壤对土壤中植物病原菌的抑制，从而可能加重植物病原菌的危害。此外，残余培养基的直接利用在菌剂工业化生产中还会带来很多问题，如需要及时烘干，否则菌剂在保存期处于萌发和生长状态，从而降低产品质量。尽管营养物质能解除土壤抑菌作用，但现在通过加入营养解除抑真菌作用是盲目的，因为现在还没有弄清楚孢子萌发需要些什么特定的营养，解除抑真菌作用又与具体的什么营养有关。一种物质可以消除土壤对特定真菌的抑制作用，但并不适用于所有的真菌。
张克勤以厚垣孢轮枝孢ZK7菌株作为生防菌株，已经开发出杀线虫商品菌剂“线虫必克”，农药登记号为LS 20011571，并且已经获得了国家发明专利(991173910)。为了进一步提高这一菌剂在田间防治线虫的效果，我们研究了解除土壤抑制该菌剂所需的营养物质和相应的使用方法，获得了满意的结果。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种提高厚垣孢轮枝孢在土壤中生长和繁殖能力的方法。具体说是确定了解除土壤对厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium ZK7菌株的抑菌作用，促进该微生物在土壤中生长和繁殖所需的营养物质及其使用方法，进而提高该微生物对植物寄生线虫的防治效果。
本发明通过以下步骤实现：先用水将营养物质稀释，稀释倍数从十倍到一百倍，营养物质的成分是以下成分中的一种或是其中任何两种或两种以上成分按任何比例的混合：糖蜜，玉米浆，玉米芯，红薯粉，大豆粉，葡萄糖，蔗糖，十八烷酸、柠檬酸。将稀释后的营养物质与厚垣孢轮枝孢菌剂混合，菌剂与稀释液混合的体积比为1∶1-50，混合后在18-30℃下放置20-50小时后施入土壤中。通过这样处理，菌剂的菌体在容器内的萌发率达到80％以上，在土壤中能够正常生长和定殖，从而取得良好的防治效果。
本发明适用于利用厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium ZK7菌株(于1999年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCCNO.0418)所开发的线虫生防菌剂。
使用本发明促进ZK7菌剂在土壤中的生长，提高菌剂防治植物寄生线虫的实验：实验一提高厚垣孢轮枝孢菌剂ZK7菌株在土壤中的生长和繁殖能力的方法
(1)取10ml营养物质原液(70％糖蜜，25％红薯粉，2.5％葡萄糖，2.5％蔗糖)于一容器内，用水稀释100倍，再用稀释液与厚垣孢轮枝孢ZK7菌剂按体积比为10∶1的比例混合均匀，在容器上覆盖5层纱布，室温下放置36小时后，取样在光学显微镜下检测，结果菌体萌发率达86％。
(2)将经过上述处理的菌剂施入大田土壤中，15天时取土样在半选择性培养基(葡萄糖5g，糖蜜5g，41％的硫苯唑37.5mg，50％的多菌灵25mg，链霉素50mg，孟加拉红琼脂28g，水1000ml，pH6.5-6.8)上回收施入土壤中的菌体，结果是每克土壤中厚垣孢轮枝孢的菌落数高达4×105，而对照(将菌剂直接施入土壤中)中每克土壤中厚垣孢轮枝孢的菌落数为1.5×102。
实验二 提高厚垣孢轮枝孢菌剂在温室中防治烟草根结线虫的方法
1.实验材料：
1.1制剂：线虫必克粉剂(云南大学微生物发酵工程重点实验室提供，孢子含量为108/克)
1.2营养物质：20％糖蜜，15％玉米浆，10％玉米芯，10％红薯粉，5％大豆粉，0.1％棕榈酸，0.1％十八烷酸，0.1％柠檬酸，2.5％葡萄糖，水37.2％。
2.方法：将营养物质稀释50倍，取100毫升稀释液与200克菌剂混合均匀，25℃下放置12h，将此处理过的菌剂与土壤按1∶20(V∶V)的比例混合，每个花钵(直径20厘米，深25厘米)装土200毫升，栽上番茄幼苗，每钵番茄土中接种花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)二龄幼虫5000条，在温度为25℃的温室中培养，定期浇水。设置2组对照：菌剂和土壤混合的对照(CK1)，不施菌剂的对照(CK2)。每处理设5个重复。
3.调查：每月用平板记数法测定个处理中ZK7的CFU(每克土壤中的菌落数)；5个月后调查番茄感染根结线虫的病情指数，土壤中的幼虫数，平均每克根系的卵粒数，雌虫数。防治效果＝(对照线虫数-处理线虫数)/对照线虫数×100％，线虫数＝幼虫+雌虫。
4.实验结果(见表1)
表1菌剂对线虫的防治效果
| 处理 | 幼虫数(条/200cm3土) | 雌虫数(条/100克根) | 病情指数 | 防治效果(％) | 差异显著性(P＝0.01) |
| CK2 | 465 | 72 | 9.7 | 0 | A |
| CK1 | 242 | 45 | 4.5 | 46.6 | B |
| 处理 | 72 | 13 | 2.3 | 84.2 | C |
表2实验中ZK7在土壤中的CFU
| 处理 | CFU | |||||
| 30天 | 60天 | 90天 | 120天 | 150天 | 180天 | |
| CK1 | 2.3×102 | 1.3×102 | 1.01×102 | 0.7×102 | 0.3×102 | 16×101 |
| 处理 | 2.1×104 | 7.1×104 | 9.3×104 | 2.4×105 | 7.3×105 | 6.7×104 |
从表1可以看出本发明使用的菌剂对防治危害烟草的花生根结线虫有明显的防治效果，与对照相比较能显著降低土壤中的线虫数量，根结线虫造成的危害明显比对照减轻。菌剂未用营养物质处理的防治效果为46.6％，菌剂用营养物质处理的防治效果为84.2％。此结果说明菌剂经过营养物质的处理可以提高对根结线虫的防治效果。
从表2可以看出在施用菌剂时是否用营养物质处理可以影响到菌剂在田间的种群数量。未经营养物质处理的菌剂在土壤中的CFU前90天处于102水平，之后降低，到150天后每克土壤中仅能分离到30个菌落。说明孢子在土壤中受到土壤的抑菌作用，只有少数孢子能够生长繁殖。而经过营养物质处理过的菌剂在土壤中一直保持较高的CFU数量，在104-105之间。说明该营养物质能较好地促进ZK7菌剂在土壤中的生长繁殖。
本发明工艺简单，成本低，效率高。利用此方法可以大大提高这种常规生防菌剂的菌体在大田土壤中的生长和繁殖能力，从而提高厚垣孢轮枝孢菌剂对植物病原线虫的田间防效。
具体实施方式：
实施例1：营养物质提高厚垣孢轮枝孢在土壤中的萌发和繁殖
将厚垣孢轮枝孢的菌剂分别与下表中稀释10倍的各营养物质按1∶10的体积比混合，20℃下放置48小时；在六孔平板中每孔加入15克凉干的自然土，每孔中分别加入2毫升上述处理的菌剂，混合后放置48小时，然后用菌落计数法在选择性培养基上计数每克土壤中厚垣孢轮枝孢的菌落数(CFU)。以直接加水和菌剂的处理做对照，每处理三个重复。
营养物质提高厚垣孢轮枝孢在土壤中的萌发和生长
| 营养物质 | 糖蜜 | 红薯粉 | 大豆粉 | 玉米浆 | 葡萄糖 | 蔗糖 | 柠檬酸 | 50％糖蜜，50％葡萄糖 | 50％糖蜜，25％葡萄糖，25％红薯粉 | 对照 |
| CFU(×104) | 12 | 8 | 6 | 4 | 9 | 7 | 4 | 23 | 213 | 0.0023 |
结果显示几种营养物质可以大幅度提高垣轮枝菌在土壤中的萌发和生长，CFU达到104-106，而对照的CFU仅为23。
实施例2：营养物质稀释倍数对提高厚垣孢轮枝孢在土壤中萌发和繁殖的影响
将营养物质(50％糖蜜，25％葡萄糖，25％红薯粉)从10倍到100倍稀释，将厚垣孢轮枝孢的菌剂分别稀释后的营养物质按1∶10的体积比混合，然后按实施例1进行实验。
营养物质稀释倍数对提高厚垣孢轮枝孢在土壤中萌发和生长的影响
| 稀释倍数 | 10 | 30 | 50 | 70 | 90 | 10 | 对照 |
| CFU(×104) | 275 | 245 | 231 | 198 | 167 | 145 | 0.0019 |
结果显示，当将营养物质从10倍稀释到100倍时，仍能明显提高厚垣孢轮枝孢在土壤中萌发和生长，CFU在105以上。
实施例3：营养物质与菌剂混合的比例、放置时间及温度对提高厚垣孢轮枝孢在土壤中萌发和繁殖的影响
将菌剂与稀释10倍的营养物质(50％糖蜜，25％葡萄糖，25％红薯粉)按不同比例混合(1∶1-50)，每个处理分别在不同温度(18，25，30℃)下放置不同的时间(20，30，50小时)，然后按实施例1进行实验。
混合比例对提高厚垣孢轮枝孢在土壤中萌发和生长的影响(25℃，放置30小时)
| 混合比例 | 1∶1 | 1∶5 | 1∶10 | 1∶15 | 1∶20 | 1∶30 | 1∶40 | 1∶50 | 对照 |
| CFU(×104) | 413 | 365 | 213 | 211 | 187 | 154 | 123 | 110 | 0.0045 |
结果显示菌剂与营养物质混合的比例在1∶1-50间都有效果。此外，在所测定的时间和温度范围内，对提高厚垣孢轮枝孢在土壤中萌发和生长的影响没有明显的影响。
Claims (1)
1.一种提高真菌菌剂在土壤中生长和繁殖能力的方法，其特征在于在制剂施入土壤中之前，用营养物质稀释液与菌剂混合，混合物在18-30℃下放置20-50小时后施入土壤中，其中：
1.1营养物质的成分是以下成分中的一种或是其中任何两种或两种以上成分按任何比例的混合：糖蜜，玉米浆，玉米芯，红薯粉，大豆粉，葡萄糖，蔗糖，十八烷酸、柠檬酸；
1.2菌剂为厚垣孢轮枝孢ZK7菌株制成的菌剂；
1.3水与营养物质的稀释倍数从十倍到一百倍，菌剂与稀释液营养物质混合的体积比为1∶1-50。
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