CN108070544B - 门多萨假单胞菌及其培养基、发酵方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种门多萨假单胞菌，其于2017年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，生物保藏编号为：GDMCC 60297。相应的，本发明还公开门多萨假单胞菌的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和/或补料培养基，其中，发酵培养基包括：淀粉15‑30g/L，玉米浆干粉6‑14g/L，磷酸氢二钾4‑8g/L，硫酸铵2‑5g/L，七水合硫酸镁0.1‑0.4g/L。相应的，本发明还公开一种门多萨假单胞菌的发酵方法，以及门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。采用本发明，实现了门多萨假单胞菌的低成本、高密度发酵。

Description

门多萨假单胞菌及其培养基、发酵方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种门多萨假单胞菌，以及上述门多萨假单胞菌的培养基，上述门多萨假单胞菌的发酵工艺，上述门多萨假单胞菌的应用。
背景技术
氮污染问题日益显著，对其治理刻不容缓。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化以至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。
传统的生物脱氮由自养硝化菌的硝化作用和厌氧反硝化菌的反硝化作用完成。近年来发现一些细菌可以同步异养硝化和好氧反硝化。国内外研究者发现并分离出的好氧反硝化菌大致可归为：产碱菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)及红球菌属(Rhodococcus)等。这些微生物均能在好氧的条件下将硝酸盐或者亚硝酸盐还原。与自养型硝化菌比较，异养硝化菌的生长速率快，细胞产率高，需要的溶解氧浓度低，能耐受酸性环境且活性高，并且能够代谢各种形态的氮化合物，同时提高COD的去除率。好氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，使得同步硝化和反硝化成为可能，不仅可以降低运行成本，减少工艺上繁琐的操作，还可以扩大自养硝化菌所不能处理的水质范围。
门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)可以同步异养硝化和好氧反硝化，在污水治理领域前景广阔，但其高密度发酵培养基和工艺未有报导，高发酵成本和低发酵水平等制约了其应用前景。开发低成本培养基和高效发酵工艺对加速水处理菌种门多萨假单胞菌的生产和应用意义巨大。
公开号为CN101787353A，发明名称为《高效去除水体中亚硝态氮、硝态氮和氨氮的门多萨假单胞菌CY004及其应用》的专利，其公开一种能去除水体中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的门多萨假单胞菌，发酵72h后的活菌数仅为1×1010CFU/mL，发酵效率低，培养基的成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种适用于污水处理的门多萨假单胞菌。
本发明所要解决的技术问题还在于，提供一种低成本、高密度的门多萨假单胞菌的培养基。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种门多萨假单胞菌的发酵方法，实现了门多萨假单胞菌的高密度发酵，且该方法稳定可靠。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种门多萨假单胞菌，所述门多萨假单胞菌于2017年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，生物保藏编号为：GDMCC 60297。
相应的，本发明还提供了一种门多萨假单胞菌的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和/或补料培养基，其中，发酵培养基包括：
淀粉15-30g/L，玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L。
作为上述方案的改进，所述种子培养基包括一级种子培养基，所述一级种子培养基包括：
蛋白胨5-20g/L，葡萄糖5-20g/L，酵母粉3-7g/L，氯化钠3-7g/L。
作为上述方案的改进，所述种子培养基包括二级种子培养基，所述二级种子培养基包括：
淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L。
作为上述方案的改进，所述补料培养基包括：
淀粉150-300g/L、玉米浆干粉40-80g/L，磷酸氢二钾20-40g/L，硫酸铵10-25g/L，七水合硫酸镁0.5-2g/L。
相应的，本发明还公开一种门多萨假单胞菌的发酵方法，包括：
(1)发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
(2)按4-8％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
(3)发酵开始后5-7h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的3-6％；发酵开始后15-17h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的0.1-3％；发酵结束时间为20-28h。
作为上述方案的改进，发酵参数设定如下：温度30-40℃，转速500-700rpm，通气20-30L/min，发酵液pH下限设定为7，当pH降至设定值以下时，自动添加pH调节剂使pH维持在设定值。
作为上述方案的改进，所述发酵培养基的制备方法如下：
(1)对发酵罐进行灭菌；
(2)加入4-6L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉6-14g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的其他组分，补加水至发酵罐总体积的60-70％；
(4)培养基组分充分溶解后，调pH至7.2-7.8后，灭菌，待温度下降到35-39℃时调pH至7.2-7.8，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在30-40℃。
作为上述方案的改进，所述二级摇瓶种子液的制备方法如下：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于30-40℃，100-300rpm条件下培养10-14h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按0.1-3％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于30-40℃，100-300rpm条件下培养14-20h作为二级种子液。
相应的，本发明还公开上述的门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明优化了门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的高密度发酵的种子培养基、发酵培养基和补料培养基，通过发酵过程中流加pH调节剂控制发酵液pH、控制发酵温度和分批补料的策略，实现了门多萨假单胞菌的高密度发酵，20L发酵罐规模条件下发酵24h活菌数达到1.4×1011CFU/mL，远高于现有技术门多萨假单胞菌发酵72h后1×1010CFU/mL，为目前报导门多萨假单胞菌发酵最高活菌数。而且，本发明连续发酵若干批次，各批次之间无明显差异，故所述发酵方法稳定可靠。
此外，本发明以淀粉和玉米浆干粉为主要成分的培养基有效控制了生产成本，尽量少添加无机盐和微量元素，实现了门多萨假单胞菌的低成本、高效率发酵，为其工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1是不同发酵温度下门多萨假单胞菌生长曲线；
图2是门多萨假单胞菌在20L发酵罐条件下的高密度发酵生长曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供了一种门多萨假单胞菌，为申请人从污水处理厂活性淤泥中分离得到，经16S rRNA及生化鉴定，确定为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)。所述门多萨假单胞菌于2017年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，该保藏中心的地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，生物保藏编号为：GDMCC 60297。所述门多萨假单胞菌可以同步异养硝化和好氧反硝化，有利于污水处理。
相应地，本发明还提供了一种门多萨假单胞菌的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和/或补料培养基。
其中，发酵培养基包括：淀粉15-30g/L，玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L。
优选的，发酵培养基包括：淀粉18-26g/L，玉米浆干粉8-12g/L，磷酸氢二钾5-7g/L，硫酸铵2-4g/L，七水合硫酸镁0.2-0.4g/L。
更佳的，发酵培养基包括：淀粉20-22g/L，玉米浆干粉8-10g/L，磷酸氢二钾6-6.5g/L，硫酸铵2.5-3.5g/L，七水合硫酸镁0.25-0.35g/L。
最佳的，发酵培养基包括：淀粉20g/L，玉米浆干粉10g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸铵3g/L，七水合硫酸镁0.3g/L。
本发明发酵培养基由淀粉、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、硫酸铵、七水合硫酸镁组成，其中，本发明选用淀粉作为碳源，与麦芽糖、淀粉、葡萄糖和糊精等其他碳源相比，其可以提升发酵效率，又降低了成本。且本发明的淀粉浓度设置为15-30g/L，可以保证得到最高活菌数。门多萨假单胞菌产淀粉酶，可以高效将培养基中淀粉转化为葡萄糖。根据克勒勃屈利效应(又称葡萄糖效应)，在高浓度的葡萄糖培养基和有氧条件下培养细胞时细胞生长会受到抑制。当本发明淀粉浓度＞30g/L时，活菌数下降明显，活菌数下降了至少14％；当淀粉浓度＜15g/L时，活菌数也下降明显，活菌数下降了至少18％。
本发明选用玉米浆干粉作为氮源，其不仅含有易被微生物消化利用的氨基酸和蛋白质，还富含金属离子和维生素等微量元素。门多萨假单胞菌在合适浓度的玉米浆干粉方可获得最大活菌数。若玉米浆干粉＜6g/L，活菌数下降了至少15％；若玉米浆干粉＞14g/L，活菌数下降了2％，也增加了成本。
磷酸氢二钾为微生物生长提供必要的磷元素，硫酸铵作为速效氮源可以加速微生物前期生长，七水合硫酸镁提供足够的镁离子以激活淀粉酶和蛋白酶等消化酶系。本发明的发酵培养基具有配方简便，物料廉价易得，符合工业生产需求的优点。与现有发酵培养基相比，采用淀粉取代葡萄糖为碳源，避免了葡萄糖高温下与氨基酸发生美拉德反应，简化了培养基配制工艺；使用淀粉和玉米浆干粉等廉价物料代替葡萄糖和酵母膏等，节约了生产成本；提升了发酵效率，为工业化生产打下了基础。
所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，所述一级种子培养基包括：蛋白胨5-20g/L，葡萄糖5-20g/L，酵母粉3-7g/L，氯化钠3-7g/L。所述二级种子培养基包括：淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L。
优选的，所述一级种子培养基包括：蛋白胨7-18g/L，葡萄糖7-18g/L，酵母粉4-6g/L，氯化钠4-6g/L。所述二级种子培养基包括：淀粉17-28g/L、玉米浆干粉7-12g/L，磷酸氢二钾5-7g/L，硫酸铵3-4g/L，七水合硫酸镁0.2-0.4g/L。
更佳的，所述一级种子培养基包括：蛋白胨9-15g/L，葡萄糖9-15g/L，酵母粉4.5-5.5g/L，氯化钠4.5-5.5g/L。所述二级种子培养基包括：淀粉20-25g/L、玉米浆干粉8-11g/L，磷酸氢二钾5.5-6.5g/L，硫酸铵3-4g/L，七水合硫酸镁0.2-0.4g/L。
最佳的，所述一级种子培养基包括：蛋白胨12g/L，葡萄糖12g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L。所述二级种子培养基包括：淀粉22g/L、玉米浆干粉10g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸铵3g/L，七水合硫酸镁0.3g/L。
一级种子培养基中，蛋白胨为微生物生长提供氨基酸、维生素和生长因子等，葡萄糖为微生物生长提供碳源，酵母粉为微生物生长提供氮源，氯化钠起到调节细胞渗透压的作用，上述蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠发生协同作用，使得一级种子培养基具有加速门多萨假单胞菌繁殖生长的优点。
二级种子培养基中，淀粉为微生物生长提供碳源、玉米浆干粉不仅含有易被微生物消化利用的氨基酸和蛋白质，还富含金属离子和维生素等微量元素，磷酸氢二钾为微生物生长提供必要的磷元素，硫酸铵作为速效氮源可以加速微生物前期生长，七水合硫酸镁提供足够的镁离子以激活淀粉酶和蛋白酶等消化酶系，上述淀粉、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、硫酸铵、七水合硫酸镁发生协同作用，使得二级种子培养基具有原料廉价易得，营养丰富，利于门多萨假单胞菌持续生长的优点。
所述补料培养基包括：
淀粉150-300g/L、玉米浆干粉40-80g/L，磷酸氢二钾20-40g/L，硫酸铵10-25g/L，七水合硫酸镁0.5-2g/L。
优选的，所述补料培养基包括：淀粉180-280g/L、玉米浆干粉50-70g/L，磷酸氢二钾22-38g/L，硫酸铵12-22g/L，七水合硫酸镁0.7-1.8g/L。
更佳的，所述补料培养基包括：淀粉200-250g/L、玉米浆干粉55-65g/L，磷酸氢二钾25-35g/L，硫酸铵15-20g/L，七水合硫酸镁1-1.5g/L。
最佳的，所述补料培养基包括：淀粉225g/L、玉米浆干粉60g/L，磷酸氢二钾30g/L，硫酸铵18g/L，七水合硫酸镁1.2g/L。
补料培养基中，淀粉为微生物生长提供碳源、玉米浆干粉不仅含有易被微生物消化利用的氨基酸和蛋白质，还富含金属离子和维生素等微量元素，磷酸氢二钾为微生物生长提供必要的磷元素，硫酸铵作为速效氮源可以加速微生物前期生长，七水合硫酸镁提供足够的镁离子以激活淀粉酶和蛋白酶等消化酶系，上述淀粉、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、硫酸铵、七水合硫酸镁发生协同作用，使得补料培养基具有原料廉价易得和提升发酵效率的优点。补料培养基物料浓度远高于发酵培养基，是为了在尽量不增加发酵液体积的前提下，补充微生物持续生长所需的营养物质。
相应的，本发明还公开一种门多萨假单胞菌的发酵方法，包括：
一、发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
二、按4-8％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
三、发酵开始后5-7h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的3-6％；发酵开始后15-17h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的0.1-3％；发酵结束时间为20-28h。
发酵参数设定如下：温度30-40℃，转速500-700rpm，通气20-30L/min，发酵液pH下限设定为7，当pH降至设定值以下时，自动添加pH调节剂使pH维持在设定值。
优选的，发酵开始后5-7h，第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的4-5％；发酵开始后15-17h，第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的1-2％；发酵结束时间为20-28h。发酵参数设定如下：温度32-38℃，转速600rpm，通气22-28L/min，发酵液pH下限设定为7，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值。
在发酵开始后0-2h，发酵液中还原糖量逐步增加，这是因为培养基中淀粉在门多萨假单胞菌分泌的淀粉酶作用下转化为还原糖；在发酵开始后2-8h，还原糖量逐渐降低，这是由于菌体生长需要大量碳源，培养基中淀粉已大部分转化为还原糖，而还原糖不断被菌体消耗。发酵到8h时，培养基中的还原糖已经消耗殆尽，此时碳源不足可能是限制菌体进一步增长的主要原因。为此，本发明设置了第一次补料和第二次补料，且通过限定第一次补料的时间和用量，以及第二次补料的时间和用量，在最恰当的时机补加合适用量的营养物质，可以促进菌体进一步生长，来获得活菌数的最大提升。与不补料的工艺相比，本发明的活菌数有了数量级的提升。
表一是选用不同补料方式的发酵工艺的对比，本发明与现有技术仅仅在补料方式中存在不同，其他试验条件完全一致。
项目 本发明(二次补料) 现有技术(不补料)
活菌数 7.4×10<sup>10</sup>CFU/mL 4.9×10<sup>9</sup>CFU/mL
需要说明的是，本发明是设置了第一次补料和第二次补料，且通过限定第一次补料的时间和用量，以及第二次补料的时间和用量，方可使活菌数有了数量级的提升。若仅仅是简单、随机的进行补料，其活菌量无法获得数量级提升。
具体的，所述发酵培养基的制备方法如下：
(1)对发酵罐进行灭菌；
(2)加入4-6L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉6-14g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的其他组分，补加水至发酵罐总体积的60-70％；
(4)培养基组分充分溶解后，调pH至7.2-7.8后，灭菌，待温度下降到35-39℃时调pH至7.2-7.8，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在30-40℃。
优选的，所述发酵培养基的制备方法如下：
(1)加入5-15g/L氢氧化钠溶液到发酵罐，装液量为60-80％，0.12-0.15Mpa灭菌10-30min，待发酵罐冷却后排液，用清水反复冲洗后排空发酵罐。
(2)加入4-6L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉6-14g/L，搅拌至充分溶解。
(3)依次称取加入发酵培养基中的其他组分，补加自来水至发酵罐总体积的60-70％。
(4)调节发酵罐搅拌转速到200-400rpm并加热，使培养基组分充分溶解，用氨水调pH至7.5后，0.12-0.15Mpa灭菌20-40min，待温度下降到35-37℃时用氨水调pH至7.5，并校正溶氧为100％。
(5)灭菌后的培养基保温在30-40℃，转速200-400rpm，通气量20-30L/min。
更佳的，所述发酵培养基的制备方法如下：
(1)加入10g/L氢氧化钠溶液到发酵罐，装液量为60-80％，0.12-0.15Mpa灭菌20min，待发酵罐冷却后排液，用清水反复冲洗后排空发酵罐。
(2)加入5L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉6-14g/L，搅拌至充分溶解。
(3)依次称取加入发酵培养基中的其他组分，补加自来水至发酵罐总体积的60-70％。
(4)调节发酵罐搅拌转速到300rpm并加热，使培养基组分充分溶解，用28％氨水调pH至7.5后，0.12-0.15Mpa灭菌30min，待温度下降到37℃时用28％氨水调pH至7.5，并校正溶氧为100％。
(5)灭菌后的培养基保温在30-40℃，转速300rpm，通气量20-30L/min。
本发明优化了发酵培养基的制备方法，具体是通过限定发酵过程中的pH值和温度来实现。
本发明的pH设定为7.2-7.8，优选为7.5，通过发酵过程中流加氨水控制发酵液pH，可以实现门多萨假单胞菌的高密度发酵。表二是选用不同pH的发酵工艺的对比，表二仅仅在pH的设定上存在不同，其他试验条件完全一致。
发酵pH 7.0 7.2 7.5 7.8 8.0
活菌数(10<sup>10</sup>) 5.5 6.1 6.4 6.2 5.8
由表二可知，本发明的pH值设定在7.2-7.8方可有较大的活菌数。若pH值小于7.0，活菌数比pH为7.5时降低了14％，若pH值大于8.0，活菌数比pH为7.5时降低了9％。pH值在7.2-7.8之外，活菌数都有比较大的降低。
本发明的温度设定为35-39℃，优选为37℃，可以实现门多萨假单胞菌的高密度发酵。图1是不同发酵温度下门多萨假单胞菌生长曲线，三条曲线仅仅是发酵温度不同，其他试验条件完全一致。由图1可知，适当提高温度，有利于门多萨假单胞菌快速生长，37℃培养24h得到最高活菌数6.5×1010CFU/mL。当温度从35℃提高到37℃时，菌体达到最高活菌数所用发酵时间明显减短；而进一步提高到40℃时，发酵周期无缩短且后期细胞衰亡加速。为了得到最高活菌数且降低发酵成本，门多萨假单胞菌高密度发酵温度选择为35-39℃。
所述二级摇瓶种子液的制备方法如下：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于30-40℃，100-300rpm条件下培养10-14h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按0.1-3％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于30-40℃，100-300rpm条件下培养14-20h作为二级种子液。
优选的，所述二级摇瓶种子液的制备方法如下：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落(培养于PCA平板计数培养基)，接种至一级种子培养基中，30-40℃，190-220rpm培养12-13h作为一级摇瓶种子液；
(2)一级种子液镜检确保无杂菌污染后，按1-2％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，30-40℃，190-220rpm培养16-17h作为二级种子液。
更佳的，所述二级摇瓶种子液的制备方法如下：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落(培养于PCA平板计数培养基)，接种至一级种子培养基中，30-40℃,190rpm培养12h作为一级摇瓶种子液；
(2)一级种子液镜检确保无杂菌污染后，按1％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，30-40℃，190rpm培养16h作为二级种子液。
图2是门多萨假单胞菌在20L发酵罐条件下的高密度发酵生长曲线，由图2可知，使用上述发酵培养基和发酵工艺，门多萨假单胞菌在20L发酵罐高密度发酵24h时活菌数达到1.4×1011CFU/mL，远高于专利《高效去除水体中亚硝态氮、硝态氮和氨氮的门多萨假单胞菌CY004及其应用》中门多萨假单胞菌发酵72h后1×1010CFU/mL，为目前报导门多萨假单胞菌发酵最高活菌数。且本负担采用廉价的淀粉和玉米浆干粉作为碳源氮源，尽量少添加无机盐和微量元素，有效控制了成本，实现了门多萨假单胞菌的低成本、高效率发酵，为其工业化生产奠定了基础。
需要说明的是，图2是使用上述发酵培养基和发酵工艺后得到的整体效果，其发酵24h时活菌数远远大于优化单一要素所获得的活菌数，例如表一优化补料方式、表二优化pH值和图1优化发酵温度，故本发明是通过发酵培养基和发酵工艺的协同作用方可实现低成本、高密度、高效率的发酵。
相应的，本发明还公开上述的门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)可以同步异养硝化和好氧反硝化，在污水治理领域前景广阔。
下面以具体实施例进一步阐述本发明
实施例1
一、配方：
发酵培养基：淀粉15g/L，玉米浆干粉6g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.1g/L。
一级种子培养基：蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉3g/L，氯化钠3g/L。
二级种子培养基：淀粉15g/L、玉米浆干粉6g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.1g/L。
补料培养基：淀粉150g/L、玉米浆干粉40g/L，磷酸氢二钾20g/L，硫酸铵10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L。
二、发酵方法：
(一)制备摇瓶种子液：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于30℃，150rpm条件下培养10h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按0.1％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于30℃，150rpm条件下培养20h作为二级种子液。
(二)制备发酵培养基：
(1)加入10g/L氢氧化钠溶液到发酵罐，装液量为60％，0.12Mpa灭菌20min，待发酵罐冷却后排液，用清水反复冲洗后排空发酵罐；
(2)加入5L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉6g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的其他组分，补加水至发酵罐总体积的60％；
(4)调节发酵罐搅拌转速到300rpm并加热，使培养基组分充分溶解，用28％氨水调pH至7.2后，0.12Mpa灭菌30min，待温度下降到30℃时用28％氨水调pH至7.2，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在30℃，转速300rpm，通气量20L/min。
(三)门多萨假单胞菌的发酵
(1)发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
(2)按4％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
(3)发酵参数设定如下：温度30℃，转速500rpm，通气20L/min，发酵液pH下限设定为7.2，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值。
发酵开始后5h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的3％；发酵开始后15h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的0.1％。
实施例2
一、配方：
发酵培养基：淀粉20g/L，玉米浆干粉8g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵3g/L，七水合硫酸镁0.2g/L。
一级种子培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，氯化钠4g/L。
二级种子培养基：淀粉20g/L、玉米浆干粉8g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵3g/L，七水合硫酸镁0.2g/L。
补料培养基：淀粉200g/L、玉米浆干粉50g/L，磷酸氢二钾30g/L，硫酸铵15g/L，七水合硫酸镁1g/L。
二、发酵方法：
(一)制备摇瓶种子液：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于35℃，200rpm条件下培养12h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按1％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于35℃，200rpm条件下培养16h作为二级种子液。
(二)制备发酵培养基：
(1)加入10g/L氢氧化钠溶液到发酵罐，装液量为70％，0.13Mpa灭菌20min，待发酵罐冷却后排液，用清水反复冲洗后排空发酵罐；
(2)加入5L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉8g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的其他组分，补加水至发酵罐总体积的63％；
(4)调节发酵罐搅拌转速到300rpm并加热，使培养基组分充分溶解，用28％氨水调pH至7.5后，0.13Mpa灭菌30min，待温度下降到35℃时用28％氨水调pH至7.5，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在35℃，转速300rpm，通气量25L/min。
(三)门多萨假单胞菌的发酵
(1)发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
(2)按6％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
(3)发酵参数设定如下：温度35℃，转速600rpm，通气25L/min，发酵液pH下限设定为7.5，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值。
发酵开始后6h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的4％；发酵开始后16h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的1％。
实施例3
一、配方：
发酵培养基：淀粉25g/L，玉米浆干粉12g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸铵4g/L，七水合硫酸镁0.3g/L。
一级种子培养基：蛋白胨15g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉6g/L，氯化钠5g/L。
二级种子培养基：淀粉25g/L、玉米浆干粉12g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸铵4g/L，七水合硫酸镁0.3g/L。
补料培养基：淀粉250g/L、玉米浆干粉70g/L，磷酸氢二钾35g/L，硫酸铵20g/L，七水合硫酸镁1.5g/L。
二、发酵方法：
(一)制备摇瓶种子液：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于37℃，190rpm条件下培养12h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按2％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于37℃，190rpm条件下培养16h作为二级种子液。
(二)制备发酵培养基：
(1)加入10g/L氢氧化钠溶液到发酵罐，装液量为75％，0.14Mpa灭菌20min，待发酵罐冷却后排液，用清水反复冲洗后排空发酵罐；
(2)加入5L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉12g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的其他组分，补加水至发酵罐总体积的68％；
(4)调节发酵罐搅拌转速到300rpm并加热，使培养基组分充分溶解，用28％氨水调pH至7.5后，0.15Mpa灭菌30min，待温度下降到37℃时用28％氨水调pH至7.5，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在37℃，转速300rpm，通气量28L/min。
(三)门多萨假单胞菌的发酵
(1)发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
(2)按7％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
(3)发酵参数设定如下：温度37℃，转速600rpm，通气28L/min，发酵液pH下限设定为7.5，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值。
发酵开始后6h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的5％；发酵开始后16h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的2％。
实施例4
一、配方：
发酵培养基：淀粉30g/L，玉米浆干粉14g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸铵5g/L，七水合硫酸镁0.4g/L。
一级种子培养基：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉7g/L，氯化钠7g/L。
二级种子培养基：淀粉30g/L、玉米浆干粉14g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸铵5g/L，七水合硫酸镁0.4g/L。
补料培养基：淀粉300g/L、玉米浆干粉80g/L，磷酸氢二钾40g/L，硫酸铵25g/L，七水合硫酸镁2g/L。
二、发酵方法：
(一)制备摇瓶种子液：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于40℃，220rpm条件下培养14h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按3％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于40℃，220rpm条件下培养14h作为二级种子液。
(二)制备发酵培养基：
(1)加入10g/L氢氧化钠溶液到发酵罐，装液量为80％，0.15Mpa灭菌20min，待发酵罐冷却后排液，用清水反复冲洗后排空发酵罐；
(2)加入5L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉14g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的其他组分，补加水至发酵罐总体积的70％；
(4)调节发酵罐搅拌转速到300rpm并加热，使培养基组分充分溶解，用28％氨水调pH至7.8后，0.15Mpa灭菌30min，待温度下降到40℃时用28％氨水调pH至7.8，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在40℃，转速300rpm，通气量30L/min。
(三)门多萨假单胞菌的发酵
(1)发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
(2)按8％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
(3)发酵参数设定如下：温度40℃，转速700rpm，通气30L/min，发酵液pH下限设定为7.8，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值。
发酵开始后7h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的6％；发酵开始后17h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的3％。
将实施例1-4所得的活菌数做检测，结果表三如下：
项目 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
活菌数CFU/mL 1.37×10<sup>11</sup> 1.47×10<sup>11</sup> 1.45×10<sup>11</sup> 1.49×10<sup>11</sup>
发酵时间h 28 26 24 24
由上可知，本发明在24h时活菌数达到1.4×1011CFU/mL，发酵时间短，活菌数量多，本发明可实现高密度、高效率的发酵。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种门多萨假单胞菌的培养基，其特征在于，包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基，其中，发酵培养基由下述组分组成：
淀粉15-30g/L，玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L；
所述补料培养基由下述组分组成：
淀粉150-300g/L、玉米浆干粉40-80g/L，磷酸氢二钾20-40g/L，硫酸铵10-25g/L，七水合硫酸镁0.5-2g/L。
2.如权利要求1所述的门多萨假单胞菌的培养基，其特征在于，所述种子培养基包括一级种子培养基，所述一级种子培养基由下述组分组成：
蛋白胨5-20g/L，葡萄糖5-20g/L，酵母粉3-7g/L，氯化钠3-7g/L。
3.如权利要求2所述的门多萨假单胞菌的培养基，其特征在于，所述种子培养基包括二级种子培养基，所述二级种子培养基由下述组分组成：
淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L。
4.一种门多萨假单胞菌的发酵方法，其特征在于，包括：
(1)发酵前对发酵培养基及二级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；
(2)按4-8％的接种量将二级种子液接入发酵罐中；
(3)发酵开始后5-7h进行第一次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的3-6％；发酵开始后15-17h进行第二次补料，流加的补料培养基为发酵液体积的0.1-3％；发酵结束时间为20-28h；
其中，发酵培养基由下述组分组成：
淀粉15-30g/L，玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L；
所述补料培养基由下述组分组成：
淀粉150-300g/L、玉米浆干粉40-80g/L，磷酸氢二钾20-40g/L，硫酸铵10-25g/L，七水合硫酸镁0.5-2g/L；
发酵过程的pH值设定为7.2-7.8，发酵温度设定为35-39℃。
5.如权利要求4所述的门多萨假单胞菌的发酵方法，其特征在于，发酵参数设定如下：转速500-700rpm，通气20-30L/min。
6.如权利要求4所述的门多萨假单胞菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的制备方法如下：
(1)对发酵罐进行灭菌；
(2)加入4-6L自来水到发酵罐，倒入玉米浆干粉6-14g/L，搅拌至充分溶解；
(3)加入发酵培养基中的淀粉15-30g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L，补加水至发酵罐总体积的60-70％；
(4)培养基组分充分溶解后，调pH至7.2-7.8后，灭菌，待温度下降到35-39℃时调pH至7.2-7.8，并校正溶氧为100％；
(5)灭菌后的培养基保温在30-40℃。
7.如权利要求4所述的门多萨假单胞菌的发酵方法，其特征在于，所述二级摇瓶种子液的制备方法如下：
(1)挑取新鲜培养的门多萨假单胞菌单菌落，接种至一级种子培养基中，于30-40℃，100-300rpm条件下培养10-14h作为一级摇瓶种子液；
(2)将一级摇瓶种子液确保无杂菌污染后，按0.1-3％的接种量将一级种子液接种于二级种子培养基中，于30-40℃，100-300rpm条件下培养14-20h作为二级种子液；
所述一级种子培养基由下述组分组成：
蛋白胨5-20g/L，葡萄糖5-20g/L，酵母粉3-7g/L，氯化钠3-7g/L；
所述二级种子培养基由下述组分组成：
淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L，磷酸氢二钾4-8g/L，硫酸铵2-5g/L，七水合硫酸镁0.1-0.4g/L。
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