CN110029071A - 一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异养硝化‑好氧反硝化复合菌剂，应用在含氮废水处理领域，所述复合菌剂包括粪产碱杆菌15‑25份、门多萨假单胞菌15‑25份、枯草芽孢杆菌15‑25份、地衣芽孢杆菌10‑20份、施氏假单胞菌10‑20份和凝结芽孢杆菌10‑20份。相应地，本发明还提供了一种异养硝化‑好氧反硝化复合菌剂的制备方法和应用。本发明将上述好氧反硝化菌按一定比例进行组合，在发挥各菌功能的同时，并使不同菌种优势互补，不仅有效除去废水中的总氮，还可以适应各种复杂水体和环境。

Description

一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
氮素是水体污染中的一类重要污染物，对环境以及人体健康造成严重威胁。氮素以有机氮和无机氮的形式存在。水中的有机氮包括蛋白质、多肽和氨基酸等，有机氮可经微生物作用转化为无机氮。水中的无机氮主要包括氨氮、亚硝态氮及硝态氮等。随着人们生活水平的不断提高，大量污染物未经处理便排入水体，导致水体中氮素污染日益严重，最终导致水体富营养化和一系列环境问题。因此，治理水体中的氮素污染刻不容缓。
若水体的pH较高时，氮素主要以NH3形式存在，NH3具有一定毒性。此外，亚硝酸氮则是另一重要有害污染物，且在物理化学作用下各种形式氮可以发生转化。因此，无论什么形式的氮素存在于水体中，都存在风险，最有效的治理氮素污染的方法是去除总氮。在目前的工业废水处理过程中，硝化作用和反硝化作用所需菌种和处理条件均不相同，因此需要在2个不同的反应器中进行，这无疑加重了污水处理的成本。而且在河道湖泊和养殖水体中难以满足严格厌氧环境，因此传统反硝化细菌很难在该环境中起作用，这将造成大量亚硝酸盐积累，对人类和水生动物造成巨大影响。
传统的生物脱氮方法包括硝化作用与反硝化作用。其中，硝化作用是指自养菌在好氧条件下将氨氮转化为硝态氮的过程。而反硝化作用是指在缺氧环境条件下由兼性异养的反硝化菌将硝态氮或亚硝态氮转化为氮气的过程。而异养硝化-好氧反硝化的发现突破了传统的脱氮理论，硝化和反硝化可以在异养和好氧条件下同时发生。与传统脱氮工艺相比，异养硝化-好氧反硝化具有如下优点：(1)可以在同一反应器中完成硝化作用和反硝化作用，节省了占地面积和成本；(2)异养硝化-好氧反硝化菌的多样性使其对环境的耐受能力较强，从而扩大了其应用范围；(3)异养硝化过程对有机碳的需求克服了传统硝化池不耐有机负荷的缺陷。
目前对于异养硝化-好氧反硝化菌的研究很多，但目前现有技术还停留在单菌研究，单一菌剂显然难以实现商业化，不适用于各类含氮污水及多种复杂环境。由于污水种类众多，环境因素对微生物生长代谢影响巨大，光靠一种菌很难实现各行各业含氮污水的脱氮。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，适用范围广，有效除去废水中的总氮。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，提升菌剂对各类含氮污水的综合治理能力。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，包括：
相应地，本发明还提供了一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(11)分别将粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵；
(12)将步骤(11)所得的各个菌体进行混合、离心，得到混合菌体，将混合菌体和保护剂混合进行真空冷冻干燥，得固体复合菌剂；其中，
所述固体混合菌剂包括：
作为上述方法的改进，所述保护剂包括蔗糖、脱脂奶粉和明胶。
作为上述方法的改进，所述保护剂包括蔗糖2-6份、脱脂奶粉2-6份和明胶0.5-2.5份。
作为上述方法的改进，所述粪产碱杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(21)将保存在冰箱中的粪产碱杆菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(22)挑取单菌落接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养16-24h，得到粪产碱杆菌菌液；
(23)将粪产碱杆菌菌液接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-20h；
(24)将步骤(23)所得的粪产碱杆菌菌液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为28-35℃，通气量为20-30L/min，pH为7-8，搅拌速度为400-600rpm的条件下培养24-36h，使得发酵罐中粪产碱杆菌的含量≥1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖12-20g/L、玉米浆干粉6-10g/L、NH4Cl 1-2g/L、KH2PO42-4g/L、K2HPO4·3H2O 1-2g/L和MgSO4·7H2O 0.5-1g/L。
作为上述方法的改进，所述门多萨假单胞菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(31)将保存在冰箱中的门多萨假单胞菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(32)挑取单菌落接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养15-20h，得到门多萨假单胞菌菌液；
(33)将门多萨假单胞菌菌液接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-18h；
(34)将步骤(33)所得的门多萨假单胞菌菌液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为28-35℃，通气量为20-30L/min，pH为7-8，搅拌速度为500-700rpm的条件下培养20-30h，使得发酵罐中门多萨假单胞菌的含量≥1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L、(NH4)2SO4 2-5g/L、K2HPO4·3H2O 4-8g/L和MgSO4·7H2O 0.5-2g/L。
作为上述方法的改进，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(41)将保存在冰箱中的枯草芽孢杆菌种、地衣芽孢杆菌种和凝结芽孢杆菌种分别在营养肉汤固体培养基上活化；
(42)挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的单菌落分别接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为30-40℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养16-22h，得到枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液；
(43)将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为30-40℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-18h；
(44)将步骤(43)所得的将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为32-42℃，通气量为25-35L/min，pH为7-8，搅拌速度为350-550rpm的条件下培养22-32h，使得发酵罐中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的含量均≥109CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖10-20g/L、玉米浆干粉6-10g/L、NH4Cl 1-2g/L、K2HPO4·3H2O 2-4g/L和MgSO4·7H2O 1-2g/L。
相应地，本发明还提供了上述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
作为上述方法的改进，所述含氮废水中的氮源包括氨氮、硝态氮和亚硝态氮。
作为上述方法的改进，每升含氮废水投加0.01-10g/L异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，温度为15-40℃，pH为6-10，碳氮比为(3-20):1。
实施本发明，具有如下有益效果：
1、本发明提供的一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，应用在含氮废水处理领域，所述复合菌剂包括粪产碱杆菌15-25份、门多萨假单胞菌15-25份、枯草芽孢杆菌15-25份、地衣芽孢杆菌10-20份、施氏假单胞菌10-20份和凝结芽孢杆菌10-20份。本发明将上述好氧反硝化菌按一定比例进行组合，在发挥各菌功能的同时，并使不同菌种优势互补，不仅有效除去废水中的总氮，还可以适应各种复杂水体和环境。
2、本发明提供的一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，分别将粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵；然后将所得的各个菌体进行混合、离心，得到混合菌体，将混合菌体和保护剂混合进行真空冷冻干燥，得固体复合菌剂。本发明通过保护剂来减少菌体蛋白在冷冻过程中冻伤死亡率，提高冷冻后菌剂的活菌数量。此外，采用上述方法制备的微生物菌剂，可以便于储存和运输，并有效提高活菌数量，降低成本。
3、本发明提供的一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。本发明所述异养硝化-好氧反硝化复合菌可以同步降解氨氮、硝态氮和亚硝态氮，脱氮效果显著且无硝态氮和亚硝态氮积累，可大幅节约水处理成本，具有广阔的应用前景。
此外，本发明将上述好氧反硝化菌按一定比例进行组合，在发挥各菌功能的同时，并使不同菌种优势互补，不仅有效除去废水中的总氮，还可以适应各种复杂水体和环境。
进一步地，本发明的异养硝化-好氧反硝化复合菌将多种好氧反硝化菌按一定比例进行组合，通过多种菌的互补，可以减少菌剂的添加量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供的一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，所述复合菌剂应用在含氮废水处理领域。
所述复合菌剂包括粪产碱杆菌15-25份、门多萨假单胞菌15-25份、枯草芽孢杆菌15-25份、地衣芽孢杆菌10-20份、施氏假单胞菌10-20份和凝结芽孢杆菌10-20份。
本发明的粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌均为好氧反硝化菌，其中，粪产碱杆菌主要用于降解氨氮，其降解硝酸盐和亚硝酸盐的能力一般；枯草芽孢杆菌主要降解氨氮和硝酸盐；地衣芽孢杆菌主要降解氨氮和硝酸盐，但会累积少量的亚硝酸盐；施氏假单胞菌均可以降解氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐；凝结芽孢杆菌主要降解氨氮，并能降解少量的硝酸盐；门多萨假单胞菌主要将硝酸盐和亚硝酸盐分解成氮气。另外，本发明的粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌均为异养菌，均可以利用有机氮作为氮源。本发明将上述好氧反硝化菌按一定比例进行组合，在发挥各菌功能的同时，并使不同菌种优势互补，不仅有效除去废水中的总氮，还可以适应各种复杂水体和环境。
优选的，所述复合菌剂包括：粪产碱杆菌18-22份、门多萨假单胞菌18-22份、枯草芽孢杆菌18-22份、地衣芽孢杆菌12-18份、施氏假单胞菌12-18份和凝结芽孢杆菌12-18份。
更优的，所述复合菌剂包括：粪产碱杆菌18-20份、门多萨假单胞菌18-20份、枯草芽孢杆菌18-20份、地衣芽孢杆菌15-18份、施氏假单胞菌15-18份和凝结芽孢杆菌15-18份。
本发明的另一目的是提供一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(11)分别将粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵；
(12)将步骤(11)所得的各个菌体进行混合、离心，得到混合菌体，将混合菌体和保护剂混合进行真空冷冻干燥，得固体复合菌剂；其中，
所述固体混合菌剂包括：粪产碱杆菌15-25份、门多萨假单胞菌15-25份、枯草芽孢杆菌15-25份、地衣芽孢杆菌10-20份、施氏假单胞菌10-20份和凝结芽孢杆菌10-20份。具体的，所述保护剂包括蔗糖、脱脂奶粉和明胶。其中，蔗糖属于渗透型保护剂，可渗透进细胞壁但不能透过细胞膜，渗透型保护剂在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，抑制微生物细胞干燥脱水过程中质膜的相变，从而达到了保护的目的。脱脂奶粉主要成分是蛋白质，属于大分子保护剂，大分子保护剂通过“包裹”的形式保护菌体，同时促进低分子保护剂发挥作用。明胶属于非渗透型保护剂，非渗透型保护剂不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。
现有的保护剂没有适用于不同微生物种类的通用配方，且现有的保护剂通常为复合配方。本发明所述保护剂种类及配方针对本发明微生物菌剂制定，用不同类型的保护剂组合可以增加保护效率，同时是良好的赋形剂，可以提升产品外观品质。
优选的，所述保护剂包括蔗糖2-6份、脱脂奶粉2-6份和明胶0.5-2.5份。更优的，所述保护剂包括蔗糖5份、脱脂奶粉3份和明胶1份。
此外，采用上述方法制备的微生物菌剂，可以便于储存和运输，并有效提高活菌数量，降低成本。
具体的，所述粪产碱杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(21)将保存在冰箱中的粪产碱杆菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(22)挑取单菌落接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养16-24h，得到粪产碱杆菌菌液；
(23)将粪产碱杆菌菌液接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-20h；
(24)将步骤(23)所得的粪产碱杆菌菌液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为28-35℃，通气量为20-30L/min，pH为7-8，搅拌速度为400-600rpm的条件下培养24-36h，使得发酵罐中粪产碱杆菌的含量≥1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖12-20g/L、玉米浆干粉6-10g/L、NH4Cl 1-2g/L、KH2PO42-4g/L、K2HPO4·3H2O 1-2g/L和MgSO4·7H2O 0.5-1g/L。
具体的，步骤(22)中，将1％粪产碱杆菌菌液接种到含有300ml发酵培养基的容器中；步骤(23)中，将2％粪产碱杆菌菌液接种到含有12L发酵培养基的容器中。
所述门多萨假单胞菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(31)将保存在冰箱中的门多萨假单胞菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(32)挑取单菌落接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养15-20h，得到门多萨假单胞菌菌液；
(33)将门多萨假单胞菌菌液接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-18h；
(34)将步骤(33)所得的门多萨假单胞菌菌液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为28-35℃，通气量为20-30L/min，pH为7-8，搅拌速度为500-700rpm的条件下培养20-30h，使得发酵罐中门多萨假单胞菌的含量≥1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L、(NH4)2SO4 2-5g/L、K2HPO4·3H2O 4-8g/L和MgSO4·7H2O 0.5-2g/L。
具体的，步骤(32)中，将1％门多萨假单胞菌菌液接种到含有300ml发酵培养基的容器中；步骤(33)中，将2％门多萨假单胞菌菌液接种到含有12L发酵培养基的容器中。
所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(41)将保存在冰箱中的枯草芽孢杆菌种、地衣芽孢杆菌种和凝结芽孢杆菌种分别在营养肉汤固体培养基上活化；
(42)挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的单菌落分别接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为30-40℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养16-22h，得到枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液；
(43)将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为30-40℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-18h；
(44)将步骤(43)所得的将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为32-42℃，通气量为25-35L/min，pH为7-8，搅拌速度为350-550rpm的条件下培养22-32h，使得发酵罐中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的含量均≥109CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖10-20g/L、玉米浆干粉6-10g/L、NH4Cl 1-2g/L、K2HPO4·3H2O 2-4g/L和MgSO4·7H2O 1-2g/L。
具体的，步骤(43)中，将1％枯草芽孢杆菌菌液、1％地衣芽孢杆菌菌液和1％凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有300ml发酵培养基的容器中；步骤(44)中，将3％枯草芽孢杆菌菌液、3％地衣芽孢杆菌菌液和3％凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有12L发酵培养基的发酵罐中。
本发明的另一目的是提供一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。其中，所述含氮废水包括氨氮、硝态氮和亚硝态氮。
具体的，向每升含氮废水投加0.01-10g异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，温度为15-40℃，pH为6-10，碳氮比为(3-20):1。
需要说明的是，反硝化作用需要碳源作为电子供体，好氧反硝化菌脱氮的呼吸作用和反硝化作用均需要碳源。因此，含氮废水中碳源要上述比例才能有效脱氮。
本发明所述异养硝化-好氧反硝化复合菌可以同步降解氨氮、硝态氮和亚硝态氮，脱氮效果显著且无硝态氮和亚硝态氮积累，可大幅节约水处理成本，具有广阔的应用前景。
此外，本发明将上述好氧反硝化菌按一定比例进行组合，在发挥各菌功能的同时，并使不同菌种优势互补，不仅有效除去废水中的总氮，还可以适应各种复杂水体和环境。
进一步地，本发明的异养硝化-好氧反硝化复合菌将多种好氧反硝化菌按一定比例进行组合，通过多种菌的互补，可以减少菌剂的添加量。
本发明所述菌种均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)以及美国模式培养物集存库(ATCC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买得到。
下面将以具体实施例来进一步阐述本发明
实施例1
所述粪产碱杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(21)将保存在冰箱中的粪产碱杆菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(22)挑取单菌落接种于含50mL营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为30℃，搅拌速度为180rpm的条件下培养20h，得到粪产碱杆菌菌液；
(23)将1％粪产碱杆菌菌液接种到含有300ml发酵培养基的容器中，于温度为30℃，搅拌速度为180rpm的条件下培养18h；
(24)将步骤(23)所得的2％粪产碱杆菌菌液接种到含有12L发酵培养基的发酵罐中，于温度为30℃，通气量为25L/min，pH为7.5，搅拌速度为4500rpm的条件下培养30h，发酵罐中粪产碱杆菌的含量达到6.8×1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖16g/L、玉米浆干粉8g/L、NH4Cl 1.5g/L、KH2PO4 3g/L、K2HPO4·3H2O 1.5g/L和MgSO4·7H2O 0.8g/L。
所述门多萨假单胞菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(31)将保存在冰箱中的门多萨假单胞菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(32)挑取单菌落接种于含50mL营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为32℃，搅拌速度为170rpm的条件下培养16h，得到门多萨假单胞菌菌液；
(33)将1％门多萨假单胞菌菌液接种到含有300ml发酵培养基的容器中，于温度为32℃，搅拌速度为170rpm的条件下培养16h；
(34)将步骤(33)所得的2％门多萨假单胞菌菌液接种到含有12L发酵培养基的发酵罐中，于温度为32℃，通气量为28L/min，pH为7，搅拌速度为550rpm的条件下培养28h，发酵罐中门多萨假单胞菌的含量达到8.7×1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括淀粉22g/L、玉米浆干粉10g/L、(NH4)2SO4 3g/L、K2HPO4·3H2O6g/L和MgSO4·7H2O 1g/L。
所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(41)将保存在冰箱中的枯草芽孢杆菌种、地衣芽孢杆菌种和凝结芽孢杆菌种分别在营养肉汤固体培养基上活化；
(42)挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的单菌落分别接种于含50mL营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为37℃，搅拌速度为190rpm的条件下培养18h，得到枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液；
(43)将1％枯草芽孢杆菌菌液、1％地衣芽孢杆菌菌液和1％凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有300ml发酵培养基的容器中，于温度为37℃，搅拌速度为190rpm的条件下培养18h；
(44)将步骤(43)所得的将3％枯草芽孢杆菌菌液、3％地衣芽孢杆菌菌液和3％凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有12L发酵培养基的发酵罐中，于温度为37℃，通气量为30L/min，pH为7，搅拌速度为500rpm的条件下培养26h，发酵罐中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的含量均达到1×1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖16g/L、玉米浆干粉8g/L、NH4Cl 1.5g/L、K2HPO4·3H2O3g/L和MgSO4·7H2O 1.5g/L。
实施例2
一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
所述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂包括粪产碱杆菌15份、门多萨假单胞菌15份、枯草芽孢杆菌20份、地衣芽孢杆菌20份、施氏假单胞菌20份和凝结芽孢杆菌10份。
所述含氮废水由20.48g/L乙酸钠、0.72g/L硝酸钾、0.49g/L亚硝酸钠、0.47g/L硫酸铵、0.5g/L K2HPO4·3H2O和0.03g/L MgSO4·7H2O制备而成。
具体的，取200ml含氮废水于1L锥形瓶中，高温灭菌后投加0.002g上述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，在温度为40℃，pH为10，碳氮比为20：1，搅拌速度为120rpm的条件下处理48h；
将处理后的含氮废水取样离心(8000rpm，5min)后测量总氮，氨氮，硝态氮和亚硝态氮的含量，结果见表2。
表2实施例2处理前后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮的含量(mg/L)
总氮 氨氮 硝态氮 亚硝态氮
起始浓度 296.5 97.4 102.1 95.6
处理后浓度 19.1 4.6 8.3 6.4
由表2可知，实施例2的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂处理含氮废水，总氮去除率为93.6％，氨氮去除率为95.3％，硝态氮去除率为91.2％，亚硝态氮去除率为93.3％。
实施例3
一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
所述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂包括粪产碱杆菌25份、门多萨假单胞菌25份、枯草芽孢杆菌15份、地衣芽孢杆菌15份、施氏假单胞菌10份和凝结芽孢杆菌10份。
所述含氮废水由15.36g/L乙酸钠、0.72g/L硝酸钾、0.49g/L亚硝酸钠、0.47g/L硫酸铵、0.5g/L K2HPO4·3H2O和0.03g/L MgSO4·7H2O制备而成。
具体的，取200ml含氮废水于1L锥形瓶中，高温灭菌后投加0.02g上述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，在温度为30℃，pH为9，碳氮比为15：1，搅拌速度为120rpm的条件下处理48h；
将处理后的含氮废水取样离心(8000rpm，5min)后测量总氮，氨氮，硝态氮和亚硝态氮的含量，结果见表3。
表3实施例3处理前后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮的含量(mg/L)
总氮 氨氮 硝态氮 亚硝态氮
起始浓度 288.7 96.2 98.6. 94.9
处理后浓度 28.1 7.5 11.8 9.6
由表3可知，实施例3的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂处理含氮废水，总氮去除率为90.3％，氨氮去除率为92.2％，硝态氮去除率为88.0％，亚硝态氮去除率为89.9％。
实施例4
一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
所述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂包括粪产碱杆菌20份、门多萨假单胞菌25份、枯草芽孢杆菌20份、地衣芽孢杆菌10份、施氏假单胞菌10份和凝结芽孢杆菌15份。
所述含氮废水由10.24g/L乙酸钠、0.72g/L硝酸钾、0.49g/L亚硝酸钠、0.47g/L硫酸铵、0.5g/L K2HPO4·3H2O和0.03g/L MgSO4·7H2O制备而成。
具体的，取200ml含氮废水于1L锥形瓶中，高温灭菌后投加0.2g上述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，在温度为25℃，pH为7，碳氮比为10：1，搅拌速度为120rpm的条件下处理48h；
将处理后的含氮废水取样离心(8000rpm，5min)后测量总氮，氨氮，硝态氮和亚硝态氮的含量，结果见表4。
表4实施例4处理前后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮的含量(mg/L)
总氮 氨氮 硝态氮 亚硝态氮
起始浓度 293.8 98.5 97.4 98.2
处理后浓度 72.8 18.5 28.6 24.3
由表4可知，实施例4的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂处理含氮废水，总氮去除率为75.2％，氨氮去除率为81.2％，硝态氮去除率为71.6％，亚硝态氮去除率为75.3％。
实施例5
一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
所述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂包括粪产碱杆菌15份、门多萨假单胞菌20份、枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌15份、施氏假单胞菌15份和凝结芽孢杆菌10份。
所述含氮废水由5.12g/L乙酸钠、0.72g/L硝酸钾、0.49g/L亚硝酸钠、0.47g/L硫酸铵、0.5g/L K2HPO4·3H2O和0.03g/L MgSO4·7H2O制备而成。
具体的，取200ml含氮废水于1L锥形瓶中，高温灭菌后投加2g上述异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，在温度为15℃，pH为6，碳氮比为3：1，搅拌速度为120rpm的条件下处理48h；
将处理后的含氮废水取样离心(8000rpm，5min)后测量总氮，氨氮，硝态氮和亚硝态氮的含量，结果见表5。
表5实施例5处理前后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮的含量(mg/L)
总氮 氨氮 硝态氮 亚硝态氮
起始浓度 297.8 97.9 100.2 99.6
处理后浓度 101.9 27.1 35.2 38.6
由表5可知，实施例5的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂处理含氮废水，总氮去除率为65.8％，氨氮去除率为72.3％，硝态氮去除率为64.9％，亚硝态氮去除率为61.2％。
实施例6
一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
所述含氮废水取自某印染厂，检测得到废水中起始总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度分别为285.9mg/L、64.5mg/L、200.7mg/L和17.9mg/L。
具体的，取11份200ml含氮废水于11个1L锥形瓶中，分别向含氮废水投加0.02g粪产碱杆菌、0.02g门多萨假单胞菌、0.02g枯草芽孢杆菌、0.02g地衣芽孢杆菌、0.02g施氏假单胞菌、0.02g凝结芽孢杆菌、0.02g实施例1的复合菌剂、0.02g实施例2的复合菌剂、0.02g实施例3的复合菌剂和0.02g实施例4的复合菌剂，剩余一个为空白试验，其中，均在温度为30℃，pH为7，碳氮比为10：1，搅拌速度为120rpm的条件下处理48h；
将处理后的含氮废水取样离心(8000rpm，5min)后测量总氮，氨氮，硝态氮和亚硝态氮的含量，结果见表6。
表6不同菌剂对印染废水处理后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮的含量(mg/L)
总氮 氨氮 硝态氮 亚硝态氮
空白对照 271.6 42.9 208.6 26.8
粪产碱杆菌 125.5 8.9 112.9 7.5
门多萨假单胞菌 119.6 8.1 106.3 5.9
枯草芽孢杆菌 145.9 10.6 125.4 15.9
地衣芽孢杆菌 153.6 12.8 128.4 13.8
施氏假单胞菌 122.5 9.6 109.3 6.9
凝结芽孢杆菌 135.6 18.6 100.4 16.9
实施例2复合菌剂 67.5 4.2 60.5 2.8
实施例3复合菌剂 78.6 5.9 68.5 3.8
实施例4复合菌剂 75.6 6.1 64.7 3.1
实施例5复合菌剂 71.2 5.7 61.2 2.3
由表6可知，单独粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌对该印染废水均有脱氮效果，但实施例1-4所提供的复合菌剂脱氮效果更佳，总氮去除率达71.1-75.1％。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，其特征在于，包括：
2.一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(11)分别将粪产碱杆菌、门多萨假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、施氏假单胞菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵；
(12)将步骤(11)所得的各个菌体进行混合、离心，得到混合菌体，将混合菌体和保护剂混合进行真空冷冻干燥，得固体复合菌剂；其中，
所述固体混合菌剂包括：
3.如权利要求2所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述保护剂包括蔗糖、脱脂奶粉和明胶。
4.如权利要求3所述的用于处理养殖废水的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述保护剂包括蔗糖2-6份、脱脂奶粉2-6份和明胶0.5-2.5份。
5.如权利要求2所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述粪产碱杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(21)将保存在冰箱中的粪产碱杆菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(22)挑取单菌落接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养16-24h，得到粪产碱杆菌菌液；
(23)将粪产碱杆菌菌液接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-20h；
(24)将步骤(23)所得的粪产碱杆菌菌液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为28-35℃，通气量为20-30L/min，pH为7-8，搅拌速度为400-600rpm的条件下培养24-36h，使得发酵罐中粪产碱杆菌的含量≥1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖12-20g/L、玉米浆干粉6-10g/L、NH4Cl 1-2g/L、KH2PO4 2-4g/L、K2HPO4·3H2O 1-2g/L和MgSO4·7H2O 0.5-1g/L。
6.如权利要求2所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述门多萨假单胞菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(31)将保存在冰箱中的门多萨假单胞菌种在营养肉汤固体培养基上活化；
(32)挑取单菌落接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养15-20h，得到门多萨假单胞菌菌液；
(33)将门多萨假单胞菌菌液接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为28-35℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-18h；
(34)将步骤(33)所得的门多萨假单胞菌菌液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为28-35℃，通气量为20-30L/min，pH为7-8，搅拌速度为500-700rpm的条件下培养20-30h，使得发酵罐中门多萨假单胞菌的含量≥1010CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L、(NH4)2SO4 2-5g/L、K2HPO4·3H2O 4-8g/L和MgSO4·7H2O 0.5-2g/L。
7.如权利要求2所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌进行高密度发酵，包括以下步骤：
(41)将保存在冰箱中的枯草芽孢杆菌种、地衣芽孢杆菌种和凝结芽孢杆菌种分别在营养肉汤固体培养基上活化；
(42)挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的单菌落分别接种于含营养肉汤液体培养基的容器中，于温度为30-40℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养16-22h，得到枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液；
(43)将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有发酵培养基的容器中，于温度为30-40℃，搅拌速度为150-200rpm的条件下培养12-18h；
(44)将步骤(43)所得的将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和凝结芽孢杆菌菌液分别接种到含有发酵培养基的发酵罐中，于温度为32-42℃，通气量为25-35L/min，pH为7-8，搅拌速度为350-550rpm的条件下培养22-32h，使得发酵罐中枯草草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的含量均≥109CFU/mL；其中，
所述发酵培养基包括葡萄糖10-20g/L、玉米浆干粉6-10g/L、NH4Cl 1-2g/L、K2HPO4·3H2O 2-4g/L和MgSO4·7H2O 1-2g/L。
8.权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂或权利要求2-7任一项所述方法制备的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用。
9.如权利要求8所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用，其特征在于，所述含氮废水中的氮源包括有机氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮。
10.如权利要求9所述的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在含氮废水中的应用，其特征在于，每升含氮废水投加0.01-10g/L异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，并对含氮废水进行调节，其中，温度为15-40℃，pH为6-10，碳氮比为(3-20):1。
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