CN107873017A - 用于在高溶解氧水平下脱氮的微生物组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于脱氮的组合物和方法。

Description

用于在高溶解氧水平下脱氮的微生物组合物和方法
相关申请
本申请要求2015年5月5日提交的美国临时申请号62/157,327的优先权和权益，其内容以其整体通过引用并入本文。
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发明领域
本发明涉及含有微生物的水处理组合物和使用所述组合物以去除水中的硝酸盐水平的方法。
发明背景
从水系统实施生物去除无机含氮化合物诸如铵(NH4 +)和硝酸盐(NO3 -)长期是废水工程师和其他水处理专业人员感兴趣的话题。这些化合物促成富营养化，并且对许多水生生物有毒；因此，它们在经处理的废水和清洁水系统(诸如池塘、湖泊和水库)中的存在是不希望的(Shannon等人，2008)。在过去，自养硝化和脱氮细菌(将NH4 +转化为N2，以NO3 -作为中间体)的组合被认为是实现此类补救的唯一方法。然而，20世纪后半叶期间几种细菌分类群中新型代谢途径的发现迫使重新评估该范式(Schmidt等人，1987)。
硝化和脱氮细菌是行星的氮循环的组成部分。三种主要类型的细菌催化以上所示转化。氨氧化细菌(AOB)是属于变形菌门的需氧化学自养型，其含有菌种诸如亚硝化单胞菌（Nitrosomonas）、亚硝化球菌 （Nitrosococcus）和硝化螺菌（Nitrospira）(Koops和Pommererening-Röser, 2001)。这些通过氨单加氧酶的作用将氨(NH4 +)转化为羟胺(NH2OH)(反应式1)。然后羟胺通过羟胺氧化还原酶转化为亚硝酸盐(NO2 -)(反应式2)。这些生物体的倍增时间范围为8-24小时，这取决于营养物可用性(Hommes等人，2003)。
NH3 + O2 + 2H+ + 2e− → NH2OH + H2O (1)
NH2OH + H2O → NO2 - + 5H+ + 4e− (2)
然后，第二组变形菌门，称为亚硝酸盐氧化细菌(NOB)，用酶亚硝酸盐氧化还原酶将亚硝酸盐转化为硝酸盐(反应式3)(Prosser，1989)。这些也是需氧化学自养型，最常见的是硝化细菌属的成员。这些生物体具有20小时的最大倍增时间(Tramper和Grootjen, 1986)。
NO2 - + H2O → NO3 - + 2H+ + 2e− (3)
然后在被称为脱氮的过程中将硝酸盐转化为N2(反应式4)，其长期被认为受限于细菌诸如硫球形菌属、副球菌属和假单胞菌属，以及真核生物诸如藻类和真菌(Shapleigh，2006)。然而，最近的研究已发现，芽孢杆菌属的成员(属于厚壁菌门的异养生物体)同样可以进行脱氮(Verbaendert，2011)。在脱氮期间，硝酸盐取代氧作为末端电子受体；因此，因为氧是极为优选的电子受体，所以脱氮一般在缺氧环境中发生。硝酸盐转化为亚硝酸盐，然后最终转化为N2。
2 NO3 − + 10 e− + 12 H+ → N2 + 6 H2O (4)
浮霉菌门的统称为“厌氧氨氧化”细菌且属于例如Brocadia的属的厌氧氨氧化细菌的发现提供了用于补救废水中的无机含氮化合物的新方法(Strous等人，1999)。生物体诸如B. anammoxidans使用氨作为电子供体以H2O和N2作为终产物进行亚硝酸盐的脱氮(反应式5)。尽管它们的氨代谢被认为是相当新型的，但这些细菌是非常缓慢生长的(倍增时间接近11天)，并且它们的厌氧氨代谢完全、尽管可逆地被浓度低至2μM的氧抑制(Jetten等人，2001 )。
NH4 + + NO2 − → N2 + 2H2O (5)
这些细菌系统的实际应用是众多的。在部分硝化反应器(Hellinga等人，1998)中，利用AOB将氨转化为亚硝酸盐。不是允许通过NOB(其在这些系统中必须通过温度和pH控制来抑制)将亚硝酸盐转化为硝酸盐，而是将亚硝酸盐富集的废水加入脱氮反应器中，并通过脱氮细菌转化为N2。这使得脱氮细菌能够保存能量，因为它们不需要从NO3 -得到它们的NO2 -。部分脱氮方法还可以与已知为SHARON(用于相对于亚硝酸盐去除高活性铵的单一反应器系统)的方法中的厌氧氨氧化反应器相偶联，后者允许厌氧氨氧化浮霉菌同时利用NH4 +和NO2 -来实现脱氮(Hellinga等人，1998)。Canon(相对于亚硝酸盐完全自养去除氮)反应器采用来自变形菌门的需氧硝化细菌用于硝化和厌氧浮霉菌用于脱氮(Third等人，2001)。需氧AOB在消耗氧气的同时将NH4 +氧化成NO2 -，其产生缺氧环境，在所述缺氧环境中厌氧氨氧化细菌可以旺盛生长。除了被浮霉菌的延长启动时间所阻碍之外，该系统还在过量O2存在的情况下易于积聚NO2 -。最后，NOx方法(Bock等人1996)涉及用氮氧化物增强需氧变形菌诸如亚硝化单胞菌的培养，所述氮氧化物刺激细菌同时进行硝化和脱氮(Bock等人，1996)。
异养硝化涉及通过异养细菌将NH4 +转化为NO2 -，所述异养细菌与自养亚硝化单胞菌不同，依赖于作为碳源和能源的有机化合物(Schreiber，2009)。尽管已知在一些细菌诸如泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)中和假单胞菌（Pseudomonas）属中的一些菌种中发生，但观察到硝化和脱氮的速率在异养生物中较慢(Schmidt等人，2003)。因此，自养生物被视为用于补救废水中的无机含氮化合物的优异生物体。然而，Kim等人(2005年)观察到在几种芽孢杆菌（Bacillus）(厚壁菌门)的菌株中的需氧硝化和脱氮速率比以前在异养生物中观察到的更高。氮平衡揭示，一些氨氮已经从系统中完全丧失，据推测作为N2。这表明在芽孢杆菌中比变形菌和浮霉菌中存在的较少复杂的代谢途径，以及目前以自养生物为主的硝化和脱氮系统的潜在替代方案。
发明概述
在各个方面，本发明提供了含有微生物的混合物的组合物，所述微生物基于它们在高溶解氧(DO)水平的模拟废水环境中降解硝酸盐的能力而选择。构成所述混合物的各细菌基于它们在DO水平处于或高于3ppm时的模拟废水环境中以至少0.005 mM/hr的速率降解硝酸盐的能力来选择。
微生物基于它们在“模拟”废水环境中在高DO水平下降解硝酸盐的能力来选择。“模拟”废水通过将碳源(呈右旋糖的形式)和氮源(呈氨的形式)与已知有助于微生物生长的其它营养物一起添加至pH调节至7.0的去离子水来产生。介质中的C:N比率为1:1至10:1。将呈硝酸钠的形式的硝酸盐添加至该“模拟”系统，并且当添加微生物时随着时间监测浓度。从基于ln(Ct/C0)/t形式的硝酸盐浓度相对于时间数据的回归分析的拟一阶速率估计硝酸盐降解的速率。在该测定中，在高于约3ppm的DO水平下，具有高于约0.005 mM/hr的脱氮速率的任何微生物都是对于使用是可接受的。
在各个方面，本发明提供了用于在水系统中降解硝酸盐的组合物和方法。所述组合物含有芽孢杆菌生物体的混合物或芽孢杆菌和乳酸杆菌生物体的混合物。芽孢杆菌生物体的混合物可包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。乳酸杆菌生物体的混合物可包括乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。优选地，所述组合物包括芽孢杆菌生物体的混合物和乳酸杆菌生物体的混合物。在一些实施方案中，所述组合物可以含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）、乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。在其它实施方案中，所述组合物含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌可以包括枯草芽孢杆菌34KLB和/或枯草芽孢杆菌亚种漠海威（Bacillus s subtilis subsp. Mojavensis）。将每种生物体各自需氧(芽孢杆菌属)或厌氧(乳酸杆菌属)发酵，收获，干燥和研磨以产生具有约200微米的平均粒径的粉末，其中超过60％的所述混合物的大小范围为100 - 800微米。在一些实施方案中，芽孢杆菌与乳酸杆菌的比率为1:10至10:1。优选地，芽孢杆菌与乳酸杆菌的比率为约1:3.3。在一些实施方案中，乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌的重量比为1:1:1。
在一些方面，所述组合物具有小于约5％的含水量和每克组合物约105至1011个菌落形成单位(CFU)的最终细菌浓度。
在各个方面，所述组合物还含有惰性载体诸如右旋糖一水合物。优选地，所述惰性载体浓度为约75至约95% (w/w)。
在一个优选实施方案中，所述组合物包含约87重量％的右旋糖、约1重量％的芽孢杆菌混合物# 1、约1重量％的芽孢杆菌混合物# 2、约1重量％的芽孢杆菌混合物#3和约10重量％的乳酸杆菌混合物#1。
本发明中还包括通过使所述系统与含有本发明的微生物混合物的组合物接触来处理水系统的方法。所述水系统是例如市政污水、住宅或商业腐烂物、工业废水、家畜废水池塘、水产养殖池塘、来自水果和蔬菜加工的废水、来自啤酒厂和蒸馏水、游泳池或水疗中心的废水。所述方法甚至在高DO水平下也导致硝酸盐浓度降低。
本发明还提供制造本发明的组合物的方法。微生物混合物通过如下制造：在最适于其生长的条件下各自发酵每种生物体；收获每种微生物，干燥收获的生物体；研磨干燥的生物体以产生粉末，然后将每种干燥的研磨的粉末合并以产生最终的优选组合物。最终的微生物混合物具有小于约5％的含水量；和约105至1011 CFU/克的最终细菌浓度。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于实施本发明，但下文描述合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献明确地以其整体通过引用并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，本文所述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在进行限制。
本发明的其它特征和优点通过以下详述、实例和权利要求将变得显而易见且由以下详述、实例和权利要求所涵盖。
附图简述
图1是表明废水样品中的脱氮的柱状图。对于每个柱对，左侧柱显示T=0处的硝酸盐水平，且右侧柱显示T=24小时。线条说明T = 0(蓝色)和T = 24(灰色)小时处的DO水平。数据显示所有芽孢杆菌菌株的显著脱氮，除了漠海威芽孢杆菌，其DO没有明显的损失。
图2是显示定轨振荡器中的部分通气实验设置的照片。
图3是显示对于40ppm硝酸盐的起始浓度，硝酸盐去除和DO水平随时间变化的图。
图4是显示对于硝酸盐的各种起始水平(10 – 1000 ppm)，需氧硝酸盐去除随时间变化的图。
发明详述
本发明提供了用于从溶解氧(DO)水平高于约3ppm的水系统中除去硝酸盐的微生物组合物和方法。根据本发明的产品中使用的微生物可能是任何常规的嗜冷、嗜常温或嗜热细菌。更优选的是选自乳酸杆菌科和芽孢杆菌科的细菌。最优选的是选自芽孢杆菌属和乳酸杆菌属的细菌。
来自芽孢杆菌属(Bacillus)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌提供了相对于变形菌门(Proteobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)的成员的许多潜在优势。芽孢杆菌形成内生孢子的能力提供了可以在比营养细胞的制备物更宽范围的环境条件下保持存活的更强的悬浮液(hardier suspensions)。另外，尽管变形菌门诸如亚硝化单胞菌属和硝化细菌（Nitrobacter）属具有8-24小时的倍增时间且厌氧氨氧化菌种(anammox species)具有超过七天的倍增时间，但芽孢杆菌属和乳酸杆菌属的成员在最佳条件下具有低至40分钟的倍增时间(Hageman等人，1984)。因此，这些细菌相对于其更常见的废水处理对应物可以提供几种经济优势。
组合物中的微生物基于它们在DO水平高于约3ppm的“模拟”废水环境中降解硝酸盐的能力来选择。“模拟”废水由缓冲至约pH 7.0的右旋糖、氨、大豆蛋白胨、酪蛋白消化物的水性混合物构成。该模拟系统的C:N比率范围为1:1至10:1。优选具有大于约0.005 mM/hr的硝酸盐降解速率的微生物，其中从ln(Ct/C0)/t数据的拟一阶线性拟合测定所述速率。根据本发明的组合物中的微生物可以具有大于约0.01 mM/hr、大于约0.02 mM/hr或大于约0.1 mM/hr的硝酸盐降解速率。根据本发明的组合物中的微生物可以具有约0.005mM/hr至约0.5mM/hr、约0.005mM/hr至约0.2mM/hr或约0.01mM/hr至约0.1 mM/hr范围内的硝酸盐降解速率。
如本文所用的术语“微生物的”、“细菌”或“微生物”是指赋予益处的微生物。根据本发明的微生物可以是存活的或不存活的。不存活的微生物是代谢活性的。“代谢活性的”意味着它们表现出对该类微生物特有的至少一些残留酶或次级代谢物活性。
如本文所用的术语“不存活的”意指在任何已知条件下不能复制的细菌群体。然而，应当理解，由于群体中的正常生物学变化，群体的小百分比(即5％或更少)可能仍然是存活的，并且因此能够在合适的生长条件下在另外定义为不存活的群体中复制。
如本文所用的术语“活细菌”意指能够在可能在其条件下复制的合适条件下复制的细菌的群体。不符合“不存活”的定义(如上所给出)的细菌群体被认为是“存活的”。
如本文所用的“废水”涉及来自住宅、商业建筑物、机构和农场的生活污水，其含有地下水、地表水和/或雨水。废水还包括在产品诸如水果和蔬菜的加工或洗涤期间产生的水。
如本文所用的“水系统”是指“废水”以及游泳池、水疗中心和水产养殖池塘。
如本文所用的“处理”意指用微生物接种“水系统”，所述微生物经设计用于增强高于约3ppm的硝酸盐和DO水平的有效降解。
如本文所用，结合数字的术语“约”是指数字及其在该数字的±10％的范围内的偏差。例如，短语“约100”是指90至110的范围。
根据本发明的优选组合物包括约85重量％至95重量％的右旋糖和剩余重量的微生物混合物。优选地，微生物混合物包括芽孢杆菌混合物和乳酸杆菌混合物。右旋糖可以是右旋糖一水合物、无水右旋糖或其组合。
在一些方面，微生物组合物含有芽孢杆菌的混合物。
优选的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌（B. coagulans）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）和多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。在优选的芽孢杆菌种中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌是最优选的。枯草芽孢杆菌可以包括漠海威。枯草芽孢杆菌可以包括枯草芽孢杆菌34KLB。
在其它方面，微生物组合物含有芽孢杆菌和乳酸杆菌细菌的混合物。优选的乳酸杆菌种包括乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。在此类组合物中，芽孢杆菌与乳酸杆菌的重量比范围为1:10至10:1 (例如，1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1)。优选地，芽孢杆菌与乳酸杆菌的重量比为约1:3.3。其它优选的组合物包括其中乳酸杆菌以1:1:1的比率混合在一起的那些。
枯草芽孢杆菌34KLB的氨基酸序列如下所示：
枯草芽孢杆菌34KLB
所述芽孢杆菌混合物包含约10-50重量％枯草芽孢杆菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。所述芽孢杆菌混合物包含约10-50重量％解淀粉芽孢杆菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。所述芽孢杆菌混合物包含约10-50重量％地衣芽孢杆菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。所述芽孢杆菌混合物包含约10-50重量％短小芽孢杆菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。
所述乳酸杆菌混合物包含约10-50重量％乳酸片球菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。优选地，所述混合物包括约30重量％至35重量％乳酸片球菌。所述乳酸杆菌混合物包含约10-50重量％戊糖片球菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。优选地，所述混合物包括约30重量％至35重量％戊糖片球菌。所述乳酸杆菌混合物包含约10-50重量％植物乳杆菌(例如，约10重量%，约15重量%，约20重量%，约25重量%，约30重量%，约35重量%，约40重量%，约45重量%，或约50重量％)。优选地，所述混合物包括约30重量％至35重量％植物乳杆菌。更优选地，所述乳酸杆菌以等量的重量存在于所述混合物中。最优选地，所述混合物含有约33.3重量％乳酸片球菌、33.3重量％戊糖片球菌和约33.3重量％植物乳杆菌。
第一优选芽孢杆菌混合物包括10重量％地衣芽孢杆菌、30重量％短小芽孢杆菌、30重量％解淀粉芽孢杆菌和30重量％枯草芽孢杆菌(本文称为芽孢杆菌混合物#1)。优选地，芽孢杆菌混合物#1中的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌亚种漠海威（Mojavenis）。
第二优选芽孢杆菌混合物包括20重量％地衣芽孢杆菌、30重量％短小芽孢杆菌、30重量％解淀粉芽孢杆菌和20重量％枯草芽孢杆菌(本文称为芽孢杆菌混合物#2)。
第三优选芽孢杆菌混合物包括枯草芽孢杆菌34KLB(本文称为芽孢杆菌混合物#3)。
优选的乳酸杆菌混合物包括等重量的乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌(本文称为乳酸杆菌混合物#1)。
根据本发明的优选组合物包括至少约85重量％的右旋糖、约0.1至5重量％的芽孢杆菌混合物# 1、约0.1至5重量％的芽孢杆菌混合物# 2、约0.1至5％芽孢杆菌混合物#3和约1至15重量％的乳酸杆菌混合物#1。优选地，根据本发明的组合物包括约0.1至4重量％、0.1至3重量％、0.1至2重量％或0.5至1.5重量％的芽孢杆菌混合物# 1，约0.1至4重量%、0.1至3重量%、0.1至2重量%或0.5至1.5重量%的芽孢杆菌混合物# 2，0.1至4重量%、0.1至3重量%、0.1至2重量%或0.5至1.5重量%的芽孢杆菌混合物# 3和约1至14重量%、1至13重量%、1至12重量%、5至15重量%、6至15重量%、7至15重量%或8至12重量%的乳酸杆菌混合物#1。
另一种根据本发明的优选组合物包括约85重量％的右旋糖、约1重量％的芽孢杆菌混合物# 1、约1重量％的芽孢杆菌混合物# 2、约1％芽孢杆菌混合物#3和约10重量％的乳酸杆菌混合物#1。
根据本发明使用的细菌水平将取决于其类型。优选的是，本发明预期的产品含有约每克105至1011个菌落形成单位(CFU)的量的细菌。
根据本发明的细菌可以使用本领域已知的任何标准发酵工艺来生产。例如，固体底物或浸没液体发酵。发酵的培养物可以是混合培养物或单一分离株。
在一些实施方案中，所述细菌是需氧发酵的。对于能够形成孢子的那些细菌，发酵工艺包括驱动细菌进入孢子形式的“休克”步骤。本领域已知的任何“休克”方法适用于该工艺。例如，所述发酵可以被热休克以实现孢子形成。
在一些实施方案中，所述细菌在碳水化合物存在的情况下被厌氧发酵。合适的碳水化合物包括菊粉、果糖低聚糖和葡糖低聚糖。
所述细菌组合物呈粉末状干燥形式。或者，所述细菌组合物呈液体形式。
发酵之后，通过本领域中的任何已知方法收获细菌。例如，通过过滤或离心收获细菌。
通过本领域中已知的任何方法干燥细菌。例如，将细菌风干，或者通过在液氮中冷冻干燥，随后冻干。
根据本发明的组合物已被干燥至含水量小于20重量%、15重量%、10重量%、9重量%、8重量%、7重量%、6重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%或1重量%。优选地，根据本发明的组合物已被干燥至含水量小于5重量％。
在一些实施方案中，研磨干燥的粉末以减小粒径。通过在低于10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、1℃、0℃或更低的温度下进行圆锥研磨来研磨细菌。优选地，研磨温度小于约4℃。
所得粉末状产品具有小于1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100微米的粒径。优选地，研磨冷冻干燥的粉末以减小粒径，使得粒径小于约800微米。最优选的是小于约400微米的粒径。在最优选的实施方案中，干燥的粉末具有200微米的平均粒径，其中60％的混合物大小范围在100-800微米之间。在各个实施方案中，将冷冻干燥的粉末均质化。
在各个实施方案中，将所述细菌组合物与惰性载体诸如右旋糖一水合物混合。所述惰性载体浓度为至少60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、95重量%或更多。优选地，所述惰性载体浓度为约75％至95％(wt/wt)。优选地，所述惰性载体是右旋糖一水合物。更优选地，所述右旋糖一水合物浓度为约80– 95 % (w/w)，例如约80– 90 % (w/w)。
此外，如果需要，可以将细菌组合物包封以进一步增加存活的概率；例如，在糖基质、脂肪基质或多糖基质中。
本发明的细菌组合物用于处理商业、市政、工业和住宅废水、家畜池塘、水产养殖池塘、游泳池、水疗中心和水族馆。
一个或多个实施方案一般涉及水系统的处理。在典型操作期间，水系统可含有来自社区、工业或居民来源的废水。例如，所述废水可以递送自市政或其它大规模污水系统。或者，所述废水可以例如在家畜围栏的冲洗期间或由食品加工或纸浆和造纸厂产生。
水系统通常可以是含有溶解氧水平高于约3ppm、高于约5ppm、高于约10ppm、高于约20ppm、高于约50ppm或约3-50ppm(例如，3-40 ppm、3-30 ppm或3-20 ppm)的高硝酸盐水平的任何水室。
所述组合物通常作为固体递送至水系统。然而，在一些应用中，可优选将所述组合物预先溶解于水中并将该预混物添加至最终水系统。在其它应用中，所述组合物可以并入固体支持物(例如，过滤器)上，待脱氮的水经过所述固体支持物(例如，过滤器)。
本发明的组合物通过适合于生产细菌组合物的任何方法制造。优选地，含有多种芽孢杆菌种的混合物或含有芽孢杆菌和乳酸杆菌的混合物的混合物通过如下制造：在对于该特定生物体的生长理想的条件下各自发酵每种生物体；收获每种生物体；干燥收获的生物体；研磨干燥的生物体以产生粉末；然后，将每种单独的生物体组合成最终的混合物。对于仅包含芽孢杆菌种的混合物的组合物，将各芽孢杆菌生物体以相等的水平混合在一起。对于包含芽孢杆菌和乳酸杆菌的混合物的组合物，芽孢杆菌与乳酸杆菌的比率范围为1:10至10:1。本发明的芽孢杆菌生物体包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌。本发明的乳酸杆菌生物体包括乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。所述微生物组合物具有小于约5％的含水量、约200微米的平均粒径和约105至1011 CFU/克组合物的最终细菌浓度。
可以用以下实施例给出对本发明的更好理解，所述实施例被记载以说明本发明，但其不被解释为限制本发明。
实施例
实施例1：微生物种的制备
使用本领域中已知的标准深槽浸没式发酵工艺使本发明的微生物生长。
芽孢杆菌种
根据以下通用方案使枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和漠海威芽孢杆菌的各自起始培养物生长：将2克营养肉汤、2克AmberFerm(酵母提取物)和4克麦芽糖糊精添加至250 mL锥形烧瓶。添加100mL蒸馏去离子水，并搅拌烧瓶，直到所有干成分都溶解。将烧瓶加盖并在121℃和15psi下操作的高压釜中放置30分钟。冷却后，用1mL纯微生物菌株之一接种烧瓶。将烧瓶密封并置于30℃的定轨振荡器上。允许培养物生长3-5天。对于所述混合物中的每种芽孢杆菌微生物重复该过程。以该方式制备枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和漠海威芽孢杆菌的起始培养物。
通过将18克营养肉汤、18克AmberFerm和36克麦芽糖糊精添加至具有900mL蒸馏去离子水的1升烧瓶来制备更多的培养物。将烧瓶密封并如上灭菌。冷却之后，添加100mL来自250mL锥形烧瓶的微生物介质。将1升烧瓶密封，置于定轨振荡器上，并在30℃下再生长3-5天。
在引入发酵罐之前的最后生长阶段中，将来自1升烧瓶的培养物在无菌条件下转移至预灭菌的全尺寸发酵罐，并在每种生物体的pH和温度最佳值下在通气的情况下继续发酵，直到达到稳定阶段。一旦细菌生长已稳定在约1011 CFU/mL，则将发酵罐热休克以促进孢子形成。然后将各个发酵罐倒空，过滤并离心以获得细菌孢子，将其在真空下干燥，直到水分降至5％以下，然后研磨至约200微米的粒径。以该方式制备枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和漠海威芽孢杆菌孢子的各自的干燥培养物。各自的干燥样品的最终微生物计数范围为109至1011 CFU/g。
乳酸杆菌种
在分离的发酵罐中，使用标准厌氧浸没式发酵方案在各菌种的pH和温度最佳值下，使乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌的各自的纯化分离株生长：
微生物 pH最佳值 温度最佳值
乳酸片球菌 5.5 37oC
戊糖片球菌 5.5 37oC
植物乳杆菌 6.0 35oC
发酵之后，将各培养物过滤，离心，冷冻干燥至小于约5％的水分水平，然后研磨至约200微米的粒径。以该方式制备乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌的各自的干燥培养物。各自的干燥样品的最终微生物计数范围为108至1010 CFU/g。
实施例2：模拟废水的制备
制备几升具有以下组成的模拟废水并将其储存在无菌容器中：
成分 量(克/L)
右旋糖 0.282
酪蛋白消化物 0.282
大豆蛋白胨 0.150
氨 0.012
pH 7.0
根据需要在无菌条件下移取样品用于脱氮实验。
实施例3：模拟废水中的脱氮实验
将150mL来自实施例2的模拟废水与硝酸钠(≥ 99%, Sigma Aldrich)一起添加至无菌的500mL锥形烧瓶中，以达到25 mg/L的最终硝酸盐浓度。将来自实施例1的每种细菌分离株的接种物添加至反应器烧瓶中，使用无菌血清学移液管从其中立即无菌移取15mL样品(T =0)，并储存在无菌的、加螺旋盖的15mL离心管内。将反应器烧瓶放置在设为40℃(对于芽孢杆菌种)或35℃(对于乳酸杆菌和片球菌)的培养箱/振荡器中。在第2、3、4、5、6和24小时定期移取烧瓶用于取样。将样品管以6,000 rpm离心10分钟以除去悬浮细胞，所述悬浮细胞可能干扰分光光度分析。离心后，使用自动移液器从管中移取5mL等分样品，并分配至20mL闪烁小瓶中用于比色分析。
使用市售的测试试剂盒(MARS Fishcare)比色测定硝酸盐浓度。如测试试剂盒所示进行反应。在测量吸光度之前允许样品完全反应5-7分钟。在DU-520分光光度计(Beckman-Coulter)上在546nm处测量硝酸盐吸光度。在测量测试样品之前创建标准曲线。吸光度(Y值) vs. 添加的硝酸盐浓度(X值)的线性最佳拟合遵循方程Y = 1896.7X +0.0377，其中r2值为0.999。
如所指示使用商业溶解氧测试试剂盒(LaMotte)在反应器烧瓶内滴定溶解氧。样品在反应烧瓶孵育期间不保持气密。
筛选来自实施例1的四种选择的芽孢杆菌种(短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(2种菌株)、地衣芽孢杆菌和漠海威芽孢杆菌)和所有三种乳酸杆菌用于需氧脱氮。结果概述如下：
脱氮速率是基于ln(Ct/C0)/t形式的数据的回归分析的拟一阶速率的估计值，其中Ct是任何给定时间(t)的硝酸盐浓度，且C0是初始硝酸盐浓度。负值表明硝酸盐随着时间的降解。正值表明硝酸盐随着时间产生。
实施例4：废水提取物中的脱氮实验
在消毒的封盖塑料瓶(carboy)中从Sycamore Creek污水处理厂(Cincinnati, OH,USA)收集几加仑过滤的未处理的废水。将废水以6,000rpm离心10分钟以除去可见的生物固体，然后过滤通过0.22微米醋酸纤维素膜过滤器。将150mL等分样品与足够的硝酸钠一起分配至500mL锥形烧瓶中以获得25 mg/L的最终硝酸盐浓度。然后将烧瓶用箔加盖并在121℃、15psi下高压灭菌15分钟，以除去任何潜在的致病性肠细菌。将烧瓶密封并储存在4℃，直至需要。如实施例3中所概述进行脱氮实验。结果显示于下表中：
脱氮速率是基于ln(Ct/C0)/t形式的数据的回归分析的拟一阶速率的估计值。负值表明硝酸盐随着时间的降解。正值表明硝酸盐随着时间产生。
实施例5：在废水提取物中用混合微生物样品的脱氮实验
将在模拟(实施例3)和/或实际(实施例4)废水中显示最高脱氮速率的细菌分离株混合在一起，并评估在废水提取物中的脱氮能力。将短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，...以1:1:1…比率混合在一起，并根据实施例4中概述的方案测试。起始DO为7.2 ppm，且24小时之后的DO为5.8 ppm。初始硝酸盐水平为25 mg/L。该混合物的硝酸盐降解速率为-0.115 mM/hr。
实施例6：
将各种细菌分离株的接种物添加至一式两份废水反应器烧瓶中，使用无菌血清学移液管从其中立即无菌移取15mL样品(T = 0)，并储存在无菌的、加螺旋盖的15mL离心管内。然后将反应器烧瓶放置在设置为40℃的培养箱/振荡器内。如上所述在第2、3、4、5、6和24小时定期移取烧瓶用于取样。将样品管以6,000 x g离心10分钟以除去悬浮细胞，所述悬浮细胞可能干扰分光光度分析。离心后，使用自动移液器从管中移取5mL等分样品，并分配至20mL闪烁小瓶中用于比色分析。
使用水杨酸硝化方法(University of Wisconsin, Dept. of Agronomy, 1975)比色测定硝酸盐浓度。将0.2mL的样品等分样品分配至25mL锥形烧瓶中，然后将其与0.8mL浓硫酸(H2SO4)混合。还用蒸馏水、矿物质介质或废水制成空白，这取决于样品的介质。将样品放置20分钟，然后添加19mL 2M NaOH。将样品冷却至室温，然后用在410nm校准的AgilentCary-60分光光度计分析吸光度(y=0.00143x-0.00431; r2=0.999)。
如所指示使用商业溶解氧测试试剂盒(LaMotte)在反应器烧瓶内滴定溶解氧。这些数据是定性比较的近似趋势。样品在反应烧瓶孵育期间不保持气密。
来自废水样品的结果概述于图1中。
实施例7：
接种程序
通过在1L锥形烧瓶中混合15g BD BBL™脱水培养基：胰胨豆胨培养液与500mL的DI水混合来开始所有的部分通气实验的接种物。将溶液用磁力搅拌棒搅拌约5分钟，直到所有培养基都溶解。然后将混合物在121℃下高压灭菌15分钟。使培养液在环境温度下冷却，直到对于处理是安全的(约45分钟)。将包含枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌的微生物混合物在无菌培养基中剧烈旋转约30秒。然后将烧瓶用无菌、可透气盖盖上，并将其置于35℃培养箱中约18小时，然后在部分通气实验中使用。
部分通气实验程序
所有部分通气实验在35℃ Thermo Forma定轨振荡器中进行。将两个磁力搅拌板与电源条、YSI Pro-20溶解氧(DO)计量器和五个铝8” x 8”正方形烤盘一起置于振荡器中。使铝盘变形，使得剩余的振荡器底板表面积被合理地覆盖。将每个铝盘用DI水填充至可用容量，以减缓振荡器中的蒸发。将高压灭菌的8” x 8”正方形Pyrex®烤盘置于每个搅拌板的顶部。为了澄清设置，参见图2。
在第0天为每次运行制备含有葡萄糖((C6H12O6)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、氯化锰(MnCl2)、氯化铁(FeCl3)和硝酸钠(NaNO3)的生长溶液。制备两个2升瓶，每个含有1.35 L的生长溶液。每个瓶含有1.35 L DI水与1.5 g无水葡萄糖[FisherChemical, 葡萄糖(D-葡萄糖)(颗粒状粉末/Certified ACS)]、0.375 g KH2PO4 [FisherChemical, 磷酸二氢钾(结晶/Certified ACS)]、0.375 g K2HPO4 [Fisher Chemical, 无水磷酸氢二钾(结晶粉末/USP)]、4 mg MnCl2•4H2O(未知来源)、7.5 µL FeCl3 [FisherChemical, 氯化铁溶液, 40% w/v (Laboratory)]和227.7 mg NaNO3 [Fisher Chemical,硝酸钠(结晶/Certified ACS)]。
将磁力搅拌棒置于一个瓶中。将每个瓶子加箔，松散地盖上，并在121℃下高压灭菌24分钟。使每个瓶在环境温度下冷却，直到对于处理是安全的(约1.5小时)。然后将150mL的细菌接种物添加至每个瓶，得到1.5L的组合体积。在添加150mL接种物之后，生长溶液中的最终营养物浓度为1.5 g/L葡萄糖、0.25 g/L KH2PO4、0.25 g/L K2HPO4、2 mg/L MnCl2、2mg/L FeCl3和25 ppm NO3-N以及从TSB接种物剩余的任何额外营养物。将每个瓶轻轻混合约15秒。然后将具有搅拌棒的瓶小心地倒入左侧搅拌板上的Pyrex®皿中。将另一瓶小心地倒空至右侧搅拌板上的Pyrex®皿中。将含有搅拌棒的左侧搅拌板最初设定为约700rpm。
在开始时和其后约每8小时取样品。测量溶解氧、硝酸盐和亚硝酸盐。用离子色谱法使用Dionex IonPac AG9-HC Guard柱(4 x 50 mm)和Dionex IonPac AS9-HC分析柱(4 x250 mm)测量硝酸盐和亚硝酸盐。
图3是显示对于40ppm硝酸盐的起始浓度，硝酸盐去除和DO水平随时间变化的图。
图4是显示对于硝酸盐的各种起始水平(10–1000 ppm)，需氧硝酸盐去除随时间变化的图。
序列表
<110> 百通生物技术公司
<120> 用于在高溶解氧水平下脱氮的微生物组合物和方法
<130> BIOW-014/001WO 322049-2051
<150> US 62/157,327
<151> 2015-05-05
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1668
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
Ala Gly Cys Thr Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Thr Ala Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Thr
20 25 30
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys Cys Thr Thr
35 40 45
Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys
50 55 60
Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Gly Ala Thr
65 70 75 80
Ala Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys
85 90 95
Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr Cys Ala
100 105 110
Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly
115 120 125
Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Ala Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr
165 170 175
Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala Cys Gly Gly Gly
180 185 190
Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys
195 200 205
Cys Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys
210 215 220
Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly
225 230 235 240
Cys Gly Ala Thr Thr Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala Thr Thr Cys
245 250 255
Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly Thr Cys Gly
260 265 270
Ala Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Gly Ala Thr
275 280 285
Cys Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala
290 295 300
Thr Thr Thr Gly Thr Gly Arg Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr
305 310 315 320
Ala Ala Cys Cys Thr Cys Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr Cys Gly Cys
325 330 335
Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys
340 345 350
Cys Ala Thr Thr Gly Thr Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly
355 360 365
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370 375 380
Gly Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala
385 390 395 400
Cys Gly Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys
405 410 415
Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly
420 425 430
Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Thr
435 440 445
Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly
450 455 460
Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly
465 470 475 480
Gly Thr Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Cys Gly Gly
485 490 495
Gly Ala Cys Thr Thr Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys
500 505 510
Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala
515 520 525
Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala
530 535 540
Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys
545 550 555 560
Cys Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys Thr Ala
565 570 575
Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Thr Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys
625 630 635 640
Ala Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr
645 650 655
Gly Thr Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala
660 665 670
Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Thr Cys Ala
675 680 685
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Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Thr
705 710 715 720
Thr Ala Ala Thr Gly Cys Gly Thr Thr Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala
725 730 735
Gly Cys Ala Cys Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala
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755 760 765
Gly Cys Ala Cys Thr Cys Ala Thr Cys Gly Thr Thr Thr Ala Cys Gly
770 775 780
Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly
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Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr Thr Ala
835 840 845
Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys
850 855 860
Cys Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr
865 870 875 880
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Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Ala Thr
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Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
Ala Cys Gly Cys Cys Cys Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr Cys Cys
1025 1030 1035
Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala
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Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Gly Thr Ala
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Gly Thr Thr Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr
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Thr Thr Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Gly
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Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys
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Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys
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1220 1225 1230
Cys Cys Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys
1235 1240 1245
Cys Cys Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly
1250 1255 1260
Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Cys Cys Cys
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1280 1285 1290
Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Gly Cys Thr
1295 1300 1305
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1325 1330 1335
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Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr
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Gly Thr Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Gly
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Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly
1460 1465 1470
Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Ala
1475 1480 1485
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1490 1495 1500
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Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys
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Cys Gly Cys Thr Cys Gly Ala Cys Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly
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Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly Gly
1640 1645 1650
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1655 1660 1665

Claims (25)

1.用于在需氧条件下从水性介质中除去硝酸盐的组合物，其包含针对它们在溶解氧(DO)水平处于或高于3ppm时的模拟废水环境中以至少0.005 mM/hr的速率降解硝酸盐的能力来选择的微生物，其中将混合物中的每种微生物各自发酵，收获，干燥和研磨以产生具有约200微米的平均粒径的粉末，其中超过约60％的所述混合物大小范围为100 - 800微米。
2.权利要求1的组合物，其中所述微生物是一种至七种不同的芽孢杆菌菌株。
3.权利要求2的组合物，其中所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、枯草芽孢杆菌亚种漠海威（Bacillus subtilis subsp. mojavensis）或多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。
4.权利要求2的组合物，其中所述芽孢杆菌包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合物。
5.权利要求4的组合物，其中所述枯草芽孢杆菌包含枯草芽孢杆菌34KLB和/或枯草芽孢杆菌亚种漠海威。
6.权利要求2的组合物，其中所述芽孢杆菌包含枯草芽孢杆菌(菌株1)、枯草芽孢杆菌(菌株2)、漠海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合物。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，还包含选自乳酸杆菌属的细菌的混合物，其中所述混合物中的每种乳酸杆菌被各自厌氧发酵。
8.权利要求7的组合物，其包含一种至四种不同的乳酸杆菌菌株。
9.权利要求8的组合物，其中所述乳酸杆菌是乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌或动物双歧杆菌。
10.权利要求7-9中任一项的组合物，其中所述乳酸杆菌包含乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌的混合物。
11.前述权利要求中任一项的组合物，其还包含惰性载体。
12.权利要求11的组合物，其中惰性载体是无水右旋糖、右旋糖一水合物、树枝状盐、麦芽糖糊精、米糠、小麦麸、燕麦麸、大豆粉、稻壳或其混合物。
13.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含芽孢杆菌和乳酸杆菌的混合物。
14.权利要求13的组合物，其中芽孢杆菌与乳酸杆菌的比率范围为1:10至10:1。
15.权利要求13或14的组合物，其中所述组合物包含：
a. 枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和
b. 乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌；或
c. 巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌。
16.权利要求13或14的组合物，其中所述组合物包含：
a. 枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和
b. 乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。
17.权利要求15或16的组合物，其还包含惰性载体。
18.权利要求17的组合物，其中所述惰性载体是右旋糖一水合物。
19.前述权利要求中任一项的组合物，其特别用于水的脱氮。
20.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物具有小于约5％的含水量；和每克组合物约105至1011个菌落形成单位(CFU)的最终细菌浓度。
21.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述惰性载体占所述组合物的约75%至95%(wt/wt)。
22.权利要求1的组合物，其包含约87重量％的右旋糖、约1重量％的芽孢杆菌混合物#1、约1重量％的芽孢杆菌混合物# 2、约1重量％的芽孢杆菌混合物#3和约10重量％的乳酸杆菌混合物#1。
23.处理具有高于约3ppm的溶解氧水平的水系统的方法，其包括使所述水系统与前述权利要求中任一项的组合物接触。
24.权利要求23的方法，其中将所述组合物埋入固体支持物中。
25.权利要求23和24的方法，其中处理所述水系统导致硝酸盐水平的降低。
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