CN112175879A - 一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法及应用 - Google Patents

一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同步异养硝化‑好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法及应用，其中，所述步骤为：A、菌株的收集与保存，B、菌株培养，本发明的门多萨假单胞菌不仅具备优良的好氧反硝化性能，同时还具异养硝化作用作用，在生活污水及其他各种污染水体治理中具有较高的应用价值，运用到膜生物反应器中，能有效降低膜生物反应器生活污水中的硝态氮和总氮的含量，对开发脱氮微生物制剂或污水处理剂具有广阔的应用前景。

Description

一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法 及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法及应用。
背景技术
当今，因人类活动影响，城市河道及相对开放的水域氨氮指标高居不下。由此引发的生态环境问题已经对人类居家环境和城市形象产生重大影响。微生物修复水环境成为目前研究的热点领域，目前在针对污水水体氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐的去除也正在随着对硝化细菌，反硝化细菌的研究而逐渐提升到新的层次。
废水中存在着有机氮、氨氮、硝态氮等形式的氮，其中以氨氮和有机氮为主要形式。在生物梳理过程中，有机氮被一样微生物氧化分解，即通过氨化作用转化为氨氮，而后经硝化过程转化为亚硝态氮和硝态氮，最好通过反硝化作用使硝态氮转化为氮气，逸入大气，从而降低废水中N的含量。
传统的生物脱氮由硝化细菌和反硝化细菌共同完成，本世纪以来，逐步发现某些可实现同步异养硝化和好氧反硝化的细菌，异养硝化和好氧反硝化的发现打破了相对传统的生物脱氮理论，使得同步异养硝化和好氧反硝化成为可能，该技术不仅较少工艺上的冗余操作，同时也降低了运行成本。
传统同步异养硝化和好氧反硝化细菌发酵效率低，活菌数少，且培养成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法及应用，以解决上述的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，所述步骤为：
A、菌株的收集与保存：
a1、由好氧曝气池分离得到门多萨假单胞菌，将门多萨假单胞菌保存于LB固体平板中，并在4℃条件下冷藏储存于冰箱中，备用；
B、菌株培养：
b1、对保存的门多萨假单胞菌单菌进行挑取并接种于LB培养基中，培养条件为30℃，溶解氧为3-4mg/l，培养18h,离心，得沉淀菌体，菌体通过无菌水洗涤得到菌悬液；
b2、将菌悬液通过无菌操作接种到种子培养基中，进行培养，培养条件为35℃，溶解氧为3-6mg/l，pH为6-8；
b3、待种子培养基培养18-24h后，按5％-10％的接种量移液至灭菌过的发酵培养基中，培养条件为35℃，溶解氧为3-6mg/l，pH为6-8；
b4、待发酵8-10h后，于发酵培养基中进行第一次补料培养基添加，且补料培养基为发酵液体积的8％-12％；
b5、待连续发酵10h后，于发酵培养基中进行第二次补料培养基添加，补料体积为发酵液体积的3％-7％；
b6、继续发酵培养8h，结束后，即得到纯种发酵液。
优选的，所述种子培养基包括：乙酸钠5-10g/l，蛋白胨5-10g/l，酵母粉1-5g/l，氯化钠1-5g/l，磷酸氢二钾2-4g/l,硫酸镁0.05-0.5g/l，硫酸锰0.05-0.5g/l。
优选的，所述发酵培养基包括：淀粉5-10g/l，蛋白胨5-10g/l,磷酸氢二钾2-5g/l，硫酸铵2-5g/l，硫酸镁0.05-0.5g/l，硫酸锰0.05-0.5g/l。
优选的，所述补料培养基包括：淀粉50-100g/l，蛋白胨10-50g/l,磷酸氢二钾5-10g/l，硫酸铵5-10g/l。
优选的，所述步骤B中，通过30％氢氧化钠对pH值进行调节。
优选的，所述细菌的浓度检测均通过稀释涂布的方法进行检测。
本发明还提供了所述的同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。
优选的，将所述发酵菌液投入好氧池及反硝化池中进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。
优选的，将所述发酵菌液投入膜生物反应器中进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明的门多萨假单胞菌不仅具备优良的好氧反硝化性能，同时还具异养硝化作用作用，在生活污水及其他各种污染水体治理中具有较高的应用价值，运用到膜生物反应器中，能有效降低膜生物反应器生活污水中的硝态氮和总氮的含量，对开发脱氮微生物制剂或污水处理剂具有广阔的应用前景。
2、可实现门多萨假单胞菌的高密度培养，经过连续接种和补料发酵，使最终活菌数为1×1011CFU/ml，高于目前市场上大多数产品的活菌数。
3、培养方法简单，不易染杂菌，成本低，可实现工业化生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明提供了一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其中，所述步骤为：
A、菌株的收集与保存：
a1、门多萨假单胞菌来源由本实验室于2020年3月从南京市胜科水务有限公司好氧曝气池分离得到，经过形态学和PCR鉴定，并经过序列比对确认为门多萨假单胞菌，将门多萨假单胞菌保存于LB固体平板中，并在4℃条件下冷藏储存于冰箱中，备用；
B、菌株培养：
b1、对保存的门多萨假单胞菌单菌进行挑取并接种于LB培养基中，培养条件为30℃，溶解氧为3-4mg/l，培养18h,离心，得沉淀菌体，菌体通过无菌水洗涤得到菌悬液；
b2、将菌悬液通过无菌操作接种到种子培养基中，进行培养，培养条件为35℃，溶解氧为3-6mg/l，pH为6-8；
b3、待种子培养基培养18-24h后，按5％-10％的接种量移液至灭菌过的发酵培养基中，培养条件为35℃，溶解氧为3-6mg/l，pH为6-8；
b4、待发酵8-10h后，于发酵培养基中进行第一次补料培养基添加，且补料培养基为发酵液体积的8％-12％；
b5、待连续发酵10h后，于发酵培养基中进行第二次补料培养基添加，补料体积为发酵液体积的3％-7％；
b6、继续发酵培养8h，结束后，即得到纯种发酵液。
具体的，所述种子培养基包括：酸钠10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉1g/l，氯化钠1g/l，磷酸氢二钾2g/l,硫酸镁0.05g/l，硫酸锰0.05g/l。
具体的，所述发酵培养基包括：淀粉10g/l，蛋白胨10g/l,磷酸氢二钾2g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.05g/l，硫酸锰0.05g/l。
具体的，所述补料培养基包括：淀粉100g/l，蛋白胨50g/l,磷酸氢二钾10g/l，硫酸铵5g/l。
具体的，所述步骤B中，通过30％氢氧化钠对pH值进行调节。
具体的，所述细菌的浓度检测均通过稀释涂布的方法进行检测，测得同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌最终的活菌数为1×1011CFU/ml。
实施例二：
本发明还提供了同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。
将发酵液应用于南京市六合区旭光河生活污水处理泵站中，该泵站日处理污水600立方，将本发明的发酵液投加入好氧池及反硝化池中，初始投加量为100L，第5日投加50L，第10日投加50L，实时监测水质变化，记录亚硝酸盐及硝酸盐的含量。
结果如下所示：
门多萨假单胞菌治理生活污水总氮的的效果：
Figure BDA0002731221670000051
对照组(不添加门多萨假单胞菌)：
Figure BDA0002731221670000052
Figure BDA0002731221670000061
有此可以得出结论，在投加门多萨假单胞菌后，在第10天时，总氮去除率已经达到94.1％，而对照组未出现总氮的显著降低。由此可见门多萨假单胞菌在对总氮的去除上，效果尤为显著。
实施例三：
本发明还提供了同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。
将发酵液加入离心管，6000r/min离心15min，弃上清，用生理盐水重悬菌体，得到菌悬液。
将菌悬液按照1％的体积比，投加至膜生物反应器中，该膜生物反应器主要由高效沉淀区和膜生物处理区组成，进水为城市生活污水的原水，处理规模为1m3/d，设计的水力停留时间为1h，曝气方式为采用间歇曝气，气水比为30：1，水温为25-30℃。
监测投加门多萨假单胞菌前后膜生物反应器的总氮去除率变化情况：
Figure BDA0002731221670000062
由此可以得出结论，在投加菌悬液后总氮的去除率均有提高投加后10天的总氮去除率比投加时提高34.2％。
由上述实施例可以看出，菌株不仅具备优良的好氧反硝化性能，同时还具异养硝化作用作用，在生活污水及其他各种污染水体治理中具有较高的应用价值，运用到膜生物反应器中，能有效降低膜生物反应器生活污水中的硝态氮和总氮的含量，对开发脱氮微生物制剂或污水处理剂具有广阔的应用前景。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，所述步骤为：
A、菌株的收集与保存：
a1、由好氧曝气池分离得到门多萨假单胞菌，将门多萨假单胞菌保存于LB固体平板中，并在4℃条件下冷藏储存于冰箱中，备用；
B、菌株培养：
b1、对保存的门多萨假单胞菌单菌进行挑取并接种于LB培养基中，培养条件为30℃，溶解氧为3-4mg/l，培养18h,离心，得沉淀菌体，菌体通过无菌水洗涤得到菌悬液；
b2、将菌悬液通过无菌操作接种到种子培养基中，进行培养，培养条件为35℃，溶解氧为3-6mg/l，pH为6-8；
b3、待种子培养基培养18-24h后，按5％-10％的接种量移液至灭菌过的发酵培养基中，培养条件为35℃，溶解氧为3-6mg/l，pH为6-8；
b4、待发酵8-10h后，于发酵培养基中进行第一次补料培养基添加，且补料培养基为发酵液体积的8％-12％；
b5、待连续发酵10h后，于发酵培养基中进行第二次补料培养基添加，补料体积为发酵液体积的3％-7％；
b6、继续发酵培养8h，结束后，即得到纯种发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，所述种子培养基包括：乙酸钠5-10g/l，蛋白胨5-10g/l，酵母粉1-5g/l，氯化钠1-5g/l，磷酸氢二钾2-4g/l,硫酸镁0.05-0.5g/l，硫酸锰0.05-0.5g/l。
3.根据权利要求1所述的一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：淀粉5-10g/l，蛋白胨5-10g/l,磷酸氢二钾2-5g/l，硫酸铵2-5g/l，硫酸镁0.05-0.5g/l，硫酸锰0.05-0.5g/l。
4.根据权利要求1所述的一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，所述补料培养基包括：淀粉50-100g/l，蛋白胨10-50g/l,磷酸氢二钾5-10g/l，硫酸铵5-10g/l。
5.根据权利要求1所述的一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于：所述步骤B中，通过30％氢氧化钠对pH值进行调节。
6.根据权利要求1所述的一种同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于：所述细菌的浓度检测均通过稀释涂布的方法进行检测。
7.根据权利要求1所述的同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌在污水处理中的应用。
8.根据权利要求7所述的同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌在污水处理中的应用，其特征在于：将所述发酵菌液投入好氧池及反硝化池中进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。
9.根据权利要求7所述的同步异养硝化-好氧反硝化门多萨假单胞菌在污水处理中的应用，其特征在于：将所述发酵菌液投入膜生物反应器中进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。
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