CN105368744A - 一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法 - Google Patents

一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法，该腐熟剂由重量比为3-4:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，所述微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，所述绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，所述纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1-2:1-2:1-2。本发明达到了双重降解秸秆的作用，使生物降解更加高效彻底，更大程度的提高了对秸秆的降解速率，缩短了降解时间，一周左右就能完全分解农作物秸秆还田，不影响下茬作物的种植和移栽。

Description

一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法
技术领域
本发明属于农作物秸秆处理技术领域，具体涉及一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法。
背景技术
我国是农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，秸秆年产量达7亿多吨。随着农村能源问题的解决，秸秆不再作为主要燃料使用，被集中焚烧的现象日益突出，不仅污染环境，危害人们的身体健康，而且烟雾弥漫，影响陆地交通和飞行安全。秸秆的主要成分是纤维素( 约含42％ )、半纤维素( 约含32％ ) 和木质素( 约8％ )，并含有氮、磷、钾、钙、镁和有机质等。因此，合理的开发利用农作物秸秆显得尤为重要。
目前，针对秸秆无害化处理，使用秸秆腐熟剂利用微生物发酵代谢作用将秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素等分解为葡萄糖等养分后再重新施回土壤是一项简单实用的方法。但是目前的秸秆腐熟剂存在着菌剂混配单一，功能性菌株偏少，腐熟温度低，腐熟效果不良好，周期长，很多要在地下降解几年才能彻底降解，影响下茬作物生长，没有很好的起到促进作物增产增收的良好效果的诸多情况。
另外，由于纤维素是葡萄糖脱水、通过β-1,4 葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体，纤维素分子间通过大量的氢键连接在一起形成晶体结构的纤维素束，纤维素束主要被半纤维素包围，其次是被木质素的环鞘包围，由此形成了天然复杂致密的结构。尽管许多微生物能分解单独存在的纤维素，但由于上述原因，利用微生物分解秸秆受到限制。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的技术问题，提供一种绿色环保，秸秆腐熟快速、彻底、高效，能彻底分解秸秆生物大分子，改善土壤质量，减少化肥施用量，同时及时补给接茬作物生长所需多种营养的酶-菌双联秸秆腐熟剂。
本发明的另一个目的是为了提供一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法和使用方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种酶-菌双联秸秆腐熟剂，由重量比为3-4:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，所述微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，所述绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，所述纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1-2:1-2:1-2。
一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
A、制备微生物复合菌剂
a、制备绿色木霉菌原粉：将绿色木霉菌孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得绿色木霉菌原粉；
b、制备黑曲霉原粉：将黑曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得黑曲霉原粉；
c、制备米曲霉原粉：将米曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得米曲霉原粉；
d、制备侧孢短芽孢杆菌原粉：将侧孢短芽孢杆菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32℃培养18-24小时后再转入三角瓶培养18-24小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养8小时后，开始取样镜检，当芽孢形成率达到90-95％时培养完成；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40% 的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的侧孢短芽孢杆菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的侧孢短芽孢杆菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；
e、制备酵母融合菌原粉：将酵母融合菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32℃培养24-72小时后再转入三角瓶培养24-72小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养24-72小时后，完成发酵；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40% 的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的酵母融合菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；
f、复合菌剂组配：将制得的绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、侧孢短芽孢杆菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1-2:1-2:1-2:2-3:2-3进行复合组配，各组份混合均匀得到复合菌剂；
B、制备复合酶剂
a、制备纤维素酶：
（1）种子的活化：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上30℃下培养5-6天备用；
（2）液体种子培养：用孢子接种器在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；
（3）发酵罐发酵：将液体种子按5-10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60-80%，于28℃培养，控制通气量为0.2-1vvm，转速为120-150r/mim，发酵液pH值大于4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为纤维素酶粗酶液；
（4）纤维素酶固体粉末：取纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得纤维素酶固体粉末；
b、制备半纤维素酶：
（1）种子的活化：将4℃冷藏的枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，37℃恒温培养24h，进行菌种活化；
（2）液体种子培养：在已活化的斜面培养基上挑取一环菌体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于37℃、120-150rmp震荡培养24h，即为种子液；
（3）发酵罐发酵：将液体种子按10%的接种量接种于发酵罐，发酵罐的装液量为70%，pH为7.5，温度37℃，控制前期通气量为1:0.8，后期通气量为1:1，加入消泡剂，培养48小时后收集发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为半纤维素酶粗酶液；
（4）半纤维素酶固体粉末：取半纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得半纤维素酶固体粉末；
c、制备木质素酶：
（1）种子的活化：将糙皮侧耳菌接种到PDA固体培养基上28℃下培养5-6天；
（2）液体种子培养：在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；
（3）通气罐发酵：将液体种子按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60%-80%，于28℃培养，控制通气量为0.2-1vvm，转速为120-150r/mim，发酵液pH值为4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为木质素酶粗酶液；
（4）木质素酶固体粉末：取木质素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得木质素酶固体粉末；
d、复合酶剂组配：将上述纤维素酶固体粉末、半纤维素酶固体粉末、木质素酶固体粉末按重量比1-2:1-2:1-2进行混合，制成复合酶剂；
C、腐熟剂组配：将制得的微生物复合菌剂和复合酶剂按重量比3-4:1混合，制成酶-菌双联秸秆腐熟剂。
进一步地，所述步骤A中制备绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉和米曲霉原粉时的培养基制备方法为：将以下各原料按重量比混合均匀：麸皮66％、豆粕粉15％、玉米皮15％、硫酸镁0.3％、硫酸铵3.5%、磷酸二氢钾0.2%，加入混合物料重量30-40%的水搅拌均匀。
进一步地，所述步骤A中制备侧孢短芽孢杆菌原粉时的斜面培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入玉米粉15g、黄豆饼粉11.5g、玉米浆10g、酵母膏0.7g、K2HPO4 1g、CaCO3 0.5g。。
进一步地，所述步骤A中制备酵母融合菌原粉时的斜面培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g；发酵罐培养基为：发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入酵母粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、 NaCl 5g，pH值7.0~7.2。
进一步地，所述步骤B中制备纤维素酶时PDA固体培养基的制备方法为：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15-20g，加水至1000mL，121℃灭菌；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨1g、Mandels营养盐浓缩液100mL、Mandels微量元素浓缩液1mL、1mol/L柠檬酸缓冲液50mL， PH为5.5-6.0；其中：Mandels营养盐浓缩液为：每升蒸馏水中加入 (NH4)2SO4 14 g、尿素 3 g、KH2PO4 20 g、CaCl2·2H2O 4 g、MgSO4·7H2O 3 g；Mandels微量元素浓缩液为：每升蒸馏水中加入FeSO4·7H2O 5 g、ZnSO4·7H2O 1.4 g、CoCl2·6H2O 3.7 g、MnSO4·H2O 1.6 g；
发酵罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、（NH4）2SO4 2g、KH2PO4 4g、CaCl2·2H2O 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纤维素20g、小麦麸皮30g，121 ℃灭菌20 min 后使用。
进一步地，所述步骤B中制备半纤维素酶时斜面培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g、琼脂20g，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
发酵培养基：每升蒸馏水中加入糖蜜10g、鱼粉10g、NaCl 2.5g、CaCl2 1g、MgSO4·7H2O 1.25g、KH2PO4 0.38g、K2HPO4 0.74g、麦麸5.20 g、玉米粉6.49 g， pH7.0-7.2。
进一步地，所述步骤B中制备木质素酶时PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15-20g，加水至1000mL，121℃灭菌；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入马铃薯200g、蛋白胨4g、酵母膏2g、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO41.5g、VB1 2mg、营养盐溶液70mL，调PH为4.8，121℃灭菌20 min；
通气罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入麦草粉20g、酒石酸铵5g、Tween- 80 1mL、藜芦醇600ul、营养盐溶液70mL，调PH为4.5，121 ℃灭菌20 min ；
其中液体种子培养基和通气罐产酶培养基中营养盐溶液为：每升蒸馏水中加入氨基乙酸0.6g、MnSO4·H2O 0.5g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、CoSO4·7H2O 0.22g、CaCl2·2H2O 1.56g、ZnSO4·7H2O 0.1g、CuSO4·5H2O 1g、Al2(SO4)3·12H2O 10mg、HBO2 10mg、Na2MoO4·2H2O 0.01g。
一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的使用方法，该方法包括以下步骤：使用腐熟剂前将农作物秸秆平铺于田间，按农作物秸秆重量1-2‰的用量将酶-菌双联秸秆腐熟剂均匀撒入，然后添加农作物秸秆重量1-2%的尿素以调整C/N比，保证微生物在最适生长代谢条件下发酵秸秆，之后灌水泡田7天，将半腐熟的秸秆和酶-菌双联秸秆腐熟剂一同翻入地下继续腐熟，深度在10-15厘米左右。
本发明相对现有技术具有以下有益效果：
1、本发明的酶-菌双联秸秆腐熟剂由微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，其中含有纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶以及产这三类酶的微生物和微生物复合菌剂，由于作物秸秆的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，本发明通过筛选高产纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的微生物，将纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶分离提纯制成复合酶剂，并与微生物复合菌剂联合配伍制作成酶-菌双联秸秆腐熟剂，利用酶的催化特性和微生物复合菌剂的多功能性，将可成倍提高秸秆降解的速率，彻底分解秸秆的生物大分子，改善土壤质量，减少化肥施用量，同时及时补给接茬作物生长所需要的多种营养。
2、本发明通过微生物复合菌剂和复合酶剂的组合制备的酶-菌双联秸秆腐熟剂，相对于单一的微生物腐熟剂，达到了双重降解秸秆的作用，使生物降解更加高效彻底，更大程度的提高了对秸秆的降解速率，缩短了降解时间，一周左右就能完全分解农作物秸秆还田，不影响下茬作物的种植和移栽；同时还可以改良土壤，提高土壤有机质，提高肥料利用率，减肥增效，提高作物产量，减少秸秆焚烧污染，综合效益显著，可广泛用于水稻、小麦、玉米等作物秸秆还田。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种酶-菌双联秸秆腐熟剂，由重量比为4:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为2:1:1:3:3，复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1:1:1。
本发明酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法包括以下步骤：
1、制备微生物复合菌剂：
本发明直接腐熟作物秸秆的微生物复合菌剂包括绿色木霉菌，黑曲霉，米曲霉，侧孢短芽孢杆菌，酵母融合菌。
1.1制备绿色木霉原粉：
1.1.1培养基：将以下各原料按重量比混合均匀：麸皮66％、豆粕粉15％、玉米皮15％、硫酸镁0.3％、硫酸铵3.5%、磷酸二氢钾0.2%，加入混合物料重量30-40%的水搅拌均匀。
1.1.2操作步骤：将制备好的培养基在121℃下灭菌30min后自然冷却，将200g绿色木霉孢子粉与100kg 面粉混匀后，接种到发酵罐内的培养基混合物料上；然后放入无菌发酵室内的曲盘上，铺平厚度6-8cm，温度控制在30℃，温度超过30℃时进行翻堆、通风降温补氧，发酵时间为35-40 小时，在发酵的培养基混合物料上长满绿色孢子粉，发酵完成，然后在75℃温度下进行干燥，水分重量百分比含量控制在10％以下保存备用，成为绿色木霉原粉。
1.2制备黑曲霉原粉：
1.2.1培养基：与制备绿色木霉原粉的培养基相同。
1.2.2操作步骤：将制备好的培养基在121℃下灭菌30min后自然冷却，将200g黑曲霉孢子粉与100kg 面粉混匀后，接种到发酵罐内的培养基混合物料上；然后放入无菌发酵室内的曲盘上，铺平厚度6-8cm，温度控制在30℃，温度超过30℃时进行翻堆、通风降温补氧，发酵时间为35-40 小时，在发酵的培养基混合物料上长满黑色或褐色孢子粉，发酵完成，然后在75℃温度下进行干燥，水分重量百分比含量控制在10％以下保存备用，成为黑曲霉原粉。
1.3制备米曲霉原粉：
1.3.1培养基：与制备绿色木霉原粉的培养基相同。
1.3.2操作步骤：将制备好的培养基在121℃下灭菌30min后自然冷却，将200g米曲霉孢子粉与100kg 面粉混匀后，接种到发酵罐内的培养基混合物料上；然后放入无菌发酵室内的曲盘上，铺平厚度6-8cm，温度控制在30℃，温度超过30℃时进行翻堆、通风降温补氧，发酵时间为35-40 小时，在发酵的培养基混合物料上长满黄褐色孢子粉，发酵完成，然后在75℃温度下进行干燥，水分重量百分比含量控制在10％以下保存备用，成为米曲霉原粉。
1.4 制备侧孢短芽孢杆菌原粉：
1.4.1培养基：斜面培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入玉米粉15g、黄豆饼粉11.5g、玉米浆10g、酵母膏0.7g、K2HPO4 1g、CaCO3 0.5g。
1.4.2操作步骤：将侧孢短芽孢杆菌转接到事先准备好的试管斜面上，28℃培养18小时后再转入三角瓶培养18小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养8小时后，开始取样镜检，当芽孢形成率达到90-95％时培养完成；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20%的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，进风口温度控制在195-200℃，出风口温度控制75-78℃，保持喷出的侧孢短芽孢杆菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的侧孢短芽孢杆菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用。
1.5制备酵母融合菌原粉：
1.5.1培养基：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入酵母粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、 NaCl 5g，pH值7.0~7.2。
1.5.2 操作步骤：将酵母融合菌（已在公开号为CN105039194A的专利文件中公开）转接到事先准备好的试管斜面上，28℃培养72小时后再转入三角瓶培养24小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养24小时后，完成发酵；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20%的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，进风口温度控制在195-200℃，出风口温度控制75-78℃，保持喷出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的酵母融合菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用。
1.6复合菌剂组配：
将上述各步骤制得的绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、侧孢短芽孢杆菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比2:1:1:3:3进行复合组配，各组份混合均匀得到复合菌剂。
2. 制备复合酶剂：
2.1制备纤维素酶：
2.1.1实验材料
菌种：里氏木霉cicc 13052。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15g，加水至1000mL，121℃灭菌。
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨1g、Mandels营养盐浓缩液100mL、Mandels微量元素浓缩液1mL、1mol/L柠檬酸缓冲液50mL， PH为5.5-6.0；
其中：Mandels营养盐浓缩液为：每升蒸馏水中加入 (NH4)2SO4 14 g、尿素 3 g、KH2PO4 20 g、CaCl2·2H2O 4 g、MgSO4·7H2O 3 g；Mandels微量元素浓缩液为：每升蒸馏水中加入FeSO4·7H2O 5 g、ZnSO4·7H2O 1.4 g、CoCl2·6H2O 3.7 g、MnSO4·H2O 1.6 g；
5m³通气罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、（NH4）2SO4 2g、KH2PO4 4g、CaCl2·2H2O 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纤维素20g、小麦麸皮30g，121℃灭菌20 min 后使用。
2.1.2 实验方法
2.1.2.1种子的活化：
将原始菌种里氏木霉用接种环接种到PDA固体培养基上30℃下培养5-6天备用。
2.1.2.2液体种子培养：
用孢子接种器在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃、150r/min摇床上培养2d，作为液体种子。
2.1.2.3 5m³通气罐发酵：
将培养48小时的液体种子，按5%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60%，于28℃培养，控制通气量为0.2vvm,用调频装置调整转速为120r/mim，并通过流加2mol/LNH4OH控制发酵液pH大于4.0；通过控制风量和转速，保持适当的溶氧饱和度，并通过流加消泡剂控制发酵过程中形成的泡沫。发酵过程中每4小时检测一次各项生化指标，包括还原糖浓度、菌体生长情况、pH不再下降或回升，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液。将发酵液经离心机3500r/min离心10min，取上清即为纤维素酶粗酶液。
2.1.2.4 纤维素酶固体粉末：
取纤维素酶粗酶液，向其中加入质量比10%的硫酸钠充分溶解，在经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内与经高效过滤的热空气接触，热空气进风温度为110℃，出口温度为60℃，如此迅速蒸发溶剂并形成细粉，经分离系统后得到的粉末状纤维素酶固体制剂的酶活回收率达到90%以上。所得酶粉中含有内切葡聚糖酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ，外切葡聚糖酶 CBHⅠ、CBHⅡ，β−葡萄糖苷酶 GB 。其中酶含量最高的是外切葡聚糖酶CBHⅠ，CBHⅠ是里氏木霉表达最多的纤维素酶，也是最主要的纤维素酶。
2.2制备半纤维素酶：
2.2.1实验材料
菌种：枯草芽孢杆菌cicc 10088。
斜面培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g、琼脂20g， pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
5m³发酵培养基：每升蒸馏水中加入糖蜜10g、鱼粉10g、NaCl 2.5g、CaCl2 1g、MgSO4·7H2O 1.25g、KH2PO4 0.38g、K2HPO4 0.74g、麦麸5.20 g、玉米粉6.49 g， pH7.0-7.2。
2.2.2实验方法
2.2.2.1 种子的活化
将4℃冷藏的枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，37℃恒温培养24h，进行菌种活化。
2.2.2.2液体种子培养
在已活化的斜面培养基上挑取一环菌体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于37℃、120-150rmp震荡培养24h，即为种子液。
2.2.2.3发酵罐发酵
将上述液体种子按10%的接种量接种于5L发酵罐，发酵罐的装液量为70%，pH为7.5，温度37℃，控制前期通气量为1:0.8，后期通气量为1:1，加两滴乳化硅油作为消泡剂，培养48小时后收集发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为半纤维素酶粗酶液。
2.2.2.4 半纤维素酶固体粉末
取半纤维素酶粗酶液，向其中加入质量比10%的硫酸钠充分溶解，在经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内与经高效过滤的热空气接触，热空气进风温度为110℃，出口温度为60℃，如此迅速蒸发溶剂并形成细粉，经分离系统后得到的粉末状半纤维素酶固体制剂的酶活回收率达到90%以上。所得酶粉中主要含有甘露聚糖酶、木聚糖酶这两种半纤维素酶，其中甘露聚糖酶含量较高。
2.3制备木质素酶：
2.3.1实验材料
菌种：糙皮侧耳菌。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15-20g，加水至1000mL，121℃灭菌；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入马铃薯200g、蛋白胨4g、酵母膏2g、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO41.5g、VB1 2mg、营养盐溶液70mL，调PH为4.8，121℃灭菌20 min；
5m³通气罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入麦草粉20g、酒石酸铵5g、Tween- 80 1mL、藜芦醇600ul、营养盐溶液70mL，调PH为4.5，121 ℃灭菌20 min ；
其中液体种子培养基和通气罐产酶培养基中营养盐溶液为：每升蒸馏水中加入氨基乙酸0.6g、MnSO4·H2O 0.5g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、CoSO4·7H2O 0.22g、CaCl2·2H2O 1.56g、ZnSO4·7H2O 0.1g、CuSO4·5H2O 1g、Al2(SO4)3·12H2O 10mg、HBO2 10mg、Na2MoO4·2H2O 0.01g；
2.3.2实验方法
2.3.2.1种子的活化
将原始菌种糙皮侧耳菌接种到PDA固体培养基上28℃下培养5天。
2.3.2.2液体种子培养
在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子。
2.3.2.3 5m³通气罐发酵
将上述液体种子按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60%，于28℃培养，控制通气量为0.2vvm，转速为120r/mim，控制风量和转速，保持适当的溶氧饱和度在20%，通过流加2mol/LNH4OH自动控制发酵液pH为4.0，并通过流加消泡剂控制发酵过程中形成的泡沫，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10min，取上清即为木质素酶粗酶液。
2.3.3.4 木质素酶固体粉末
取木质素酶粗酶液，向其中加入质量比10%的硫酸钠充分溶解，在经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内与经高效过滤的热空气接触，热空气进风温度为110℃，出口温度为60℃，如此迅速蒸发溶剂并形成细粉，经分离系统后得到的粉末状木质素酶固体制剂的酶活回收率达到90%以上。所得酶粉中含有漆酶、木质素过氧化物酶、赖锰木质素过氧化物酶，其中漆酶含量较高，其他两种酶含量较低，说明糙皮侧耳菌主要产漆酶，而漆酶也是主要的木质素降解酶。
2.4复合酶剂组配
将上述纤维素酶固体粉末、半纤维素酶固体粉末、木质素酶固体粉末按重量比1:1:1进行混合，制成复合酶剂。
3.腐熟剂组配
将上述制得的微生物复合菌剂和复合酶剂按重量比4:1混合，制成酶-菌双联秸秆腐熟剂。
本发明酶-菌双联秸秆腐熟剂的使用方法包括以下步骤：
使用腐熟剂前将农作物秸秆平铺于田间，按农作物秸秆重量1‰的用量将酶-菌双联秸秆腐熟剂均匀撒入，然后添加农作物秸秆重量1%的尿素以调整C/N比，保证微生物在最适生长代谢条件下发酵秸秆，之后灌水泡田7天，将半腐熟的秸秆和酶-菌双联秸秆腐熟剂一同翻入地下继续腐熟，深度在10-15厘米左右。
实施例2
一种酶-菌双联秸秆腐熟剂，由重量比为3:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为1:2:2:2:2，复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1:2:2。
本发明酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法包括以下步骤：
1、制备微生物复合菌剂：
本发明直接腐熟作物秸秆的微生物复合菌剂包括绿色木霉菌，黑曲霉，米曲霉，侧孢短芽孢杆菌，酵母融合菌。
1.1制备绿色木霉原粉：
1.1.1培养基：将以下各原料按重量比混合均匀：麸皮66％、豆粕粉15％、玉米皮15％、硫酸镁0.3％、硫酸铵3.5%、磷酸二氢钾0.2%，加入混合物料重量30-40%的水搅拌均匀。
1.1.2操作步骤：将制备好的培养基在121℃下灭菌30min后自然冷却，将200g绿色木霉孢子粉与100kg 面粉混匀后，接种到发酵罐内的培养基混合物料上；然后放入无菌发酵室内的曲盘上，铺平厚度6-8cm，温度控制在30℃，温度超过30℃时进行翻堆、通风降温补氧，发酵时间为35-40 小时，在发酵的培养基混合物料上长满绿色孢子粉，发酵完成，然后在75℃温度下进行干燥，水分重量百分比含量控制在10％以下保存备用，成为绿色木霉原粉。
1.2制备黑曲霉原粉：
1.2.1培养基：与制备绿色木霉原粉的培养基相同。
1.2.2操作步骤：将制备好的培养基在121℃下灭菌30min后自然冷却，将200g黑曲霉孢子粉与100kg 面粉混匀后，接种到发酵罐内的培养基混合物料上；然后放入无菌发酵室内的曲盘上，铺平厚度6-8cm，温度控制在30℃，温度超过30℃时进行翻堆、通风降温补氧，发酵时间为35-40 小时，在发酵的培养基混合物料上长满黑色或褐色孢子粉，发酵完成，然后在75℃温度下进行干燥，水分重量百分比含量控制在10％以下保存备用，成为黑曲霉原粉。
1.3制备米曲霉原粉：
1.3.1培养基：与制备绿色木霉原粉的培养基相同。
1.3.2操作步骤：将制备好的培养基在121℃下灭菌30min后自然冷却，将200g米曲霉孢子粉与100kg 面粉混匀后，接种到发酵罐内的培养基混合物料上；然后放入无菌发酵室内的曲盘上，铺平厚度6-8cm，温度控制在30℃，温度超过30℃时进行翻堆、通风降温补氧，发酵时间为35-40 小时，在发酵的培养基混合物料上长满黄褐色孢子粉，发酵完成，然后在75℃温度下进行干燥，水分重量百分比含量控制在10％以下保存备用，成为米曲霉原粉。
1.4 制备侧孢短芽孢杆菌原粉：
1.4.1培养基：斜面培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入玉米粉15g、黄豆饼粉11.5g、玉米浆10g、酵母膏0.7g、K2HPO4 1g、CaCO3 0.5g。
1.4.2操作步骤：将侧孢短芽孢杆菌转接到事先准备好的试管斜面上,32℃培养24小时后再转入三角瓶培养24小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养8小时后，开始取样镜检，当芽孢形成率达到90-95％时培养完成；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量40% 的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，进风口温度控制在195-200℃，出风口温度控制75-78℃，保持喷出的侧孢短芽孢杆菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的侧孢短芽孢杆菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用。
1.5制备酵母融合菌原粉：
1.5.1培养基：斜面培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入酵母粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、 NaCl 5g，pH值7.0~7.2。
1.5.2 操作步骤：将酵母融合菌转接到事先准备好的试管斜面上， 32℃培养24小时后再转入三角瓶培养72小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养72小时后，完成发酵；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量40% 的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，进风口温度控制在195-200℃，出风口温度控制75-78℃，保持喷出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的酵母融合菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用。
1.6复合菌剂组配：
将上述各步骤制得的绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、侧孢短芽孢杆菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1:2:2:2:2进行复合组配，各组份混合均匀得到复合菌剂。
2. 制备复合酶剂：
2.1制备纤维素酶：
2.1.1实验材料
菌种：里氏木霉cicc 13052。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂20g，加水至1000mL，121℃灭菌。
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨1g、Mandels营养盐浓缩液100mL、Mandels微量元素浓缩液1mL、1mol/L柠檬酸缓冲液50mL， PH为5.5-6.0；
其中：Mandels营养盐浓缩液为：每升蒸馏水中加入 (NH4)2SO4 14 g、尿素 3 g、KH2PO4 20 g、CaCl2·2H2O 4 g、MgSO4·7H2O 3 g；Mandels微量元素浓缩液为：每升蒸馏水中加入FeSO4·7H2O 5 g、ZnSO4·7H2O 1.4 g、CoCl2·6H2O 3.7 g、MnSO4·H2O 1.6 g；
5m³通气罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、（NH4）2SO4 2g、KH2PO4 4g、CaCl2·2H2O 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纤维素20g、小麦麸皮30g，121 ℃灭菌20 min 后使用。
2.1.2 实验方法
2.1.2.1种子的活化：
将原始菌种里氏木霉用接种环接种到PDA固体培养基上30℃下培养5-6天备用。
2.1.2.2液体种子培养：
用孢子接种器在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃、150r/min摇床上培养2d，作为液体种子。
2.1.2.3 5m³通气罐发酵：
将培养48小时的液体种子，按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为80%，于28℃培养，控制通气量为1vvm,用调频装置调整转速为150r/mim，并通过流加2mol/LNH4OH控制发酵液pH大于4.0；通过控制风量和转速，保持适当的溶氧饱和度，并通过流加消泡剂控制发酵过程中形成的泡沫。发酵过程中每4小时检测一次各项生化指标，包括还原糖浓度、菌体生长情况、pH不再下降或回升，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液。将发酵液经离心机3500r/min离心15min，取上清即为纤维素酶粗酶液。
2.1.2.4 纤维素酶固体粉末：
取纤维素酶粗酶液，向其中加入质量比10%的硫酸钠充分溶解，在经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内与经高效过滤的热空气接触，热空气进风温度为110℃，出口温度为60℃，如此迅速蒸发溶剂并形成细粉，经分离系统后得到的粉末状纤维素酶固体制剂的酶活回收率达到90%以上。所得酶粉中含有内切葡聚糖酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ，外切葡聚糖酶 CBHⅠ、CBHⅡ，β−葡萄糖苷酶 GB 。其中酶含量最高的是外切葡聚糖酶CBHⅠ，CBHⅠ是里氏木霉表达最多的纤维素酶，也是最主要的纤维素酶。
2.2制备半纤维素酶：
2.2.1实验材料
菌种：枯草芽孢杆菌cicc 10088。
斜面培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g、琼脂20g， pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
5m³发酵培养基：每升蒸馏水中加入糖蜜10g、鱼粉10g、NaCl 2.5g、CaCl2 1g、MgSO4·7H2O 1.25g、KH2PO4 0.38g、K2HPO4 0.74g、麦麸5.20 g、玉米粉6.49 g， pH7.0-7.2。
2.2.2实验方法
2.2.2.1 种子的活化
将4℃冷藏的枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，37℃恒温培养24h，进行菌种活化。
2.2.2.2液体种子培养
在已活化的斜面培养基上挑取一环菌体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于37℃、120-150rmp震荡培养24h，即为种子液。
2.2.2.3发酵罐发酵
将上述液体种子按10%的接种量接种于5L发酵罐，发酵罐的装液量为70%，pH为7.5，温度37℃，控制前期通气量为1:0.8，后期通气量为1:1，加两滴乳化硅油作为消泡剂，培养48小时后收集发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为半纤维素酶粗酶液。
2.2.2.4 半纤维素酶固体粉末
取半纤维素酶粗酶液，向其中加入质量比10%的硫酸钠充分溶解，在经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内与经高效过滤的热空气接触，热空气进风温度为110℃，出口温度为60℃，如此迅速蒸发溶剂并形成细粉，经分离系统后得到的粉末状半纤维素酶固体制剂的酶活回收率达到90%以上。所得酶粉中主要含有甘露聚糖酶、木聚糖酶这两种半纤维素酶，其中甘露聚糖酶含量较高。
2.3制备木质素酶：
2.3.1实验材料
菌种：糙皮侧耳菌。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15-20g，加水至1000mL，121℃灭菌；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入马铃薯200g、蛋白胨4g、酵母膏2g、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO41.5g、VB1 2mg、营养盐溶液70mL，调PH为4.8，121℃灭菌20 min；
5m³通气罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入麦草粉20g、酒石酸铵5g、Tween- 80 1mL、藜芦醇600ul、营养盐溶液70mL，调PH为4.5，121 ℃灭菌20 min ；
其中液体种子培养基和通气罐产酶培养基中营养盐溶液为：每升蒸馏水中加入氨基乙酸0.6g、MnSO4·H2O 0.5g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、CoSO4·7H2O 0.22g、CaCl2·2H2O 1.56g、ZnSO4·7H2O 0.1g、CuSO4·5H2O 1g、Al2(SO4)3·12H2O 10mg、HBO2 10mg、Na2MoO4·2H2O 0.01g；
2.3.2实验方法
2.3.2.1种子的活化
将原始菌种糙皮侧耳菌接种到PDA固体培养基上28℃下培养6天。
2.3.2.2液体种子培养
在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子。
2.3.2.3 5m³通气罐发酵
将上述液体种子按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为80%，于28℃培养，控制通气量为1vvm，转速为150r/mim，控制风量和转速，保持适当的溶氧饱和度在20%，通过流加2mol/LNH4OH自动控制发酵液pH为4.0，并通过流加消泡剂控制发酵过程中形成的泡沫，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心15min，取上清即为木质素酶粗酶液。
2.3.3.4 木质素酶固体粉末
取木质素酶粗酶液，向其中加入质量比10%的硫酸钠充分溶解，在经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内与经高效过滤的热空气接触，热空气进风温度为110℃，出口温度为60℃，如此迅速蒸发溶剂并形成细粉，经分离系统后得到的粉末状木质素酶固体制剂的酶活回收率达到90%以上。所得酶粉中含有漆酶、木质素过氧化物酶、赖锰木质素过氧化物酶，其中漆酶含量较高，其他两种酶含量较低，说明糙皮侧耳菌主要产漆酶，而漆酶也是主要的木质素降解酶。
2.4复合酶剂组配
将上述纤维素酶固体粉末、半纤维素酶固体粉末、木质素酶固体粉末按重量比1:2:2进行混合，制成复合酶剂。
3.腐熟剂组配
将上述制得的微生物复合菌剂和复合酶剂按重量比3:1混合，制成酶-菌双联秸秆腐熟剂。
本发明酶-菌双联秸秆腐熟剂的使用方法包括以下步骤：
使用腐熟剂前将农作物秸秆平铺于田间，按农作物秸秆重量2‰的用量将酶-菌双联秸秆腐熟剂均匀撒入，然后添加农作物秸秆重量2%的尿素以调整C/N比，保证微生物在最适生长代谢条件下发酵秸秆，之后灌水泡田7天，将半腐熟的秸秆和酶-菌双联秸秆腐熟剂一同翻入地下继续腐熟，深度在10-15厘米左右。

Claims (9)

1.一种酶-菌双联秸秆腐熟剂，其特征在于：由重量比为3-4:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，所述微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，所述绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，所述纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1-2:1-2:1-2。
2.一种根据权利要求1所述的酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
A、制备微生物复合菌剂
a、制备绿色木霉菌原粉：将绿色木霉菌孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得绿色木霉菌原粉；
b、制备黑曲霉原粉：将黑曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得黑曲霉原粉；
c、制备米曲霉原粉：将米曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得米曲霉原粉；
d、制备侧孢短芽孢杆菌原粉：将侧孢短芽孢杆菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32℃培养18-24小时后再转入三角瓶培养18-24小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养8小时后，开始取样镜检，当芽孢形成率达到90-95％时培养完成；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40% 的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的侧孢短芽孢杆菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的侧孢短芽孢杆菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；
e、制备酵母融合菌原粉：将酵母融合菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32℃培养24-72小时后再转入三角瓶培养24-72小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养24-72小时后，完成发酵；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40% 的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的酵母融合菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；
f、复合菌剂组配：将制得的绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、侧孢短芽孢杆菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1-2:1-2:1-2:2-3:2-3进行复合组配，各组份混合均匀得到复合菌剂；
B、制备复合酶剂
a、制备纤维素酶：
（1）种子的活化：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上30℃下培养5-6天备用；
（2）液体种子培养：用孢子接种器在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；
（3）发酵罐发酵：将液体种子按5-10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60-80%，于28℃培养，控制通气量为0.2-1vvm，转速为120-150r/mim，发酵液pH值大于4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为纤维素酶粗酶液；
（4）纤维素酶固体粉末：取纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得纤维素酶固体粉末；
b、制备半纤维素酶：
（1）种子的活化：将4℃冷藏的枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，37℃恒温培养24h，进行菌种活化；
（2）液体种子培养：在已活化的斜面培养基上挑取一环菌体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于37℃、120-150rmp震荡培养24h，即为种子液；
（3）发酵罐发酵：将液体种子按10%的接种量接种于发酵罐，发酵罐的装液量为70%，pH为7.5，温度37℃，控制前期通气量为1:0.8，后期通气量为1:1，加入消泡剂，培养48小时后收集发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为半纤维素酶粗酶液；
（4）半纤维素酶固体粉末：取半纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得半纤维素酶固体粉末；
c、制备木质素酶：
（1）种子的活化：将糙皮侧耳菌接种到PDA固体培养基上28℃下培养5-6天；
（2）液体种子培养：在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；
（3）通气罐发酵：将液体种子按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60%-80%，于28℃培养，控制通气量为0.2-1vvm，转速为120-150r/mim，发酵液pH值为4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为木质素酶粗酶液；
（4）木质素酶固体粉末：取木质素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得木质素酶固体粉末；
d、复合酶剂组配：将上述纤维素酶固体粉末、半纤维素酶固体粉末、木质素酶固体粉末按重量比1-2:1-2:1-2进行混合，制成复合酶剂；
C、腐熟剂组配：将制得的微生物复合菌剂和复合酶剂按重量比3-4:1混合，制成酶-菌双联秸秆腐熟剂。
3.根据权利要求2所述的一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A中制备绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉和米曲霉原粉时的培养基制备方法为：将以下各原料按重量比混合均匀：麸皮66％、豆粕粉15％、玉米皮15％、硫酸镁0.3％、硫酸铵3.5%、磷酸二氢钾0.2%，加入混合物料重量30-40%的水搅拌均匀。
4.根据权利要求2所述的一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A中制备侧孢短芽孢杆菌原粉时的斜面培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入玉米粉15g、黄豆饼粉11.5g、玉米浆10g、酵母膏0.7g、K2HPO4 1g、CaCO3 0.5g。
5.根据权利要求2所述的一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A中制备酵母融合菌原粉时的斜面培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g；三角瓶培养基为：每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g；发酵罐培养基为：每升蒸馏水中加入酵母粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、 NaCl 5g，pH值7.0~7.2。
6.根据权利要求2所述的一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B中制备纤维素酶时PDA固体培养基的制备方法为：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15-20g，加水至1000mL，121℃灭菌；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨1g、Mandels营养盐浓缩液100mL、Mandels微量元素浓缩液1mL、1mol/L柠檬酸缓冲液50mL， PH为5.5-6.0；其中：Mandels营养盐浓缩液为：每升蒸馏水中加入 (NH4)2SO4 14 g、尿素 3 g、KH2PO4 20 g、CaCl2·2H2O 4 g、MgSO4·7H2O 3 g；Mandels微量元素浓缩液为：每升蒸馏水中加入FeSO4·7H2O 5 g、ZnSO4·7H2O 1.4 g、CoCl2·6H2O 3.7 g、MnSO4·H2O 1.6 g；
发酵罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、（NH4）2SO4 2g、KH2PO4 4g、CaCl2·2H2O 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纤维素20g、小麦麸皮30g，121 ℃灭菌20 min 后使用。
7.根据权利要求2所述的一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B中制备半纤维素酶时斜面培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g、琼脂20g， pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；
发酵培养基：每升蒸馏水中加入糖蜜10g、鱼粉10g、NaCl 2.5g、CaCl2 1g、MgSO4·7H2O 1.25g、KH2PO4 0.38g、K2HPO4 0.74g、麦麸5.20 g、玉米粉6.49 g， pH7.0-7.2。
8.根据权利要求2所述的一种酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B中制备木质素酶时PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min,然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15-20g，加水至1000mL，121℃灭菌；
液体种子培养基：每升蒸馏水中加入马铃薯200g、蛋白胨4g、酵母膏2g、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO41.5g、VB1 2mg、营养盐溶液70mL，调PH为4.8，121℃灭菌20 min；
通气罐产酶培养基：每升蒸馏水中加入麦草粉20g、酒石酸铵5g、Tween- 80 1mL、藜芦醇600ul、营养盐溶液70mL，调PH为4.5，121 ℃灭菌20 min ；
其中液体种子培养基和通气罐产酶培养基中营养盐溶液为：每升蒸馏水中加入氨基乙酸0.6g、MnSO4·H2O 0.5g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、CoSO4·7H2O 0.22g、CaCl2·2H2O 1.56g、ZnSO4·7H2O 0.1g、CuSO4·5H2O 1g、Al2(SO4)3·12H2O 10mg、HBO2 10mg、Na2MoO4·2H2O 0.01g。
9.一种根据权利要求1所述的酶-菌双联秸秆腐熟剂的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤：使用腐熟剂前将农作物秸秆平铺于田间，按农作物秸秆重量1-2‰的用量将酶-菌双联秸秆腐熟剂均匀撒入，然后添加农作物秸秆重量1-2%的尿素以调整C/N比，保证微生物在最适生长代谢条件下发酵秸秆，之后灌水泡田7天，将半腐熟的秸秆和酶-菌双联秸秆腐熟剂一同翻入地下继续腐熟，深度在10-15厘米左右。
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