CN104646411B - 固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，将固定化芽孢杆菌用于克百威污染的土壤进行修复；土壤采用泥浆，水土比为3:1，溶液部分为芽孢杆菌培养液(pH=7)，克百威的初始浓度为100 mg·L‑1；固定化芽孢杆菌投入土壤中的量3g/100ml，温度为15~35℃，pH值为5~10，时间为72 h。本发明可以在较宽的pH、温度及盐浓度范围内处理中高浓度的污染物，使克百威污染的土壤得到有效修复。
Description
技术领域：
本发明涉及固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，属于土壤修复领域。
背景技术：
芽孢杆菌(Bacillaceae)是能形成(内生孢子)的杆菌或球菌。在孢子状态下稳定性好，能耐氧化，耐挤压，耐高温，耐酸碱，繁殖速度快，抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气及动物肠道等处。芽孢杆菌的有机分解力强，增殖的同时会释放出高活性的分解酵素，将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物质；且可以产生丰富的代谢生成物，可以合成多种有机酸、酶、生理活性等物质及其它多种被利用的养分。芽孢杆菌在固定化技术领域有着重要的应用价值。
与直接利用微生物处理污染物相比：固定化芽孢杆菌杆菌拥有以下优点：①降解效率高。②适应性强。固定化芽孢杆菌可以在较宽的温度、pH、污染物初始浓度及盐浓度范围内处理污染物，一般微生物仅适合处理较低浓度的污染物。③毒性小，易操作。固定化芽孢杆菌的反应产物在环境中及易进一步被生物分解，且对环境友好。④可反复使用。微生物一般降解一次后降解效果会降低或失去降解能力，但固定化芽孢杆菌可进行多次降解，效果仍比较好。
发明内容：
发明目的：
本发明涉及一种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，其目的是利用固定化芽孢杆菌来降解土壤中的克百威，通过两种不同固定化芽孢杆菌的方法，探求在不同的温度，不同的pH和不同的盐度条件下，来考查污染物的降解效果。
技术方案：
一种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，其特征在于：具体步骤如下：将固定化芽孢杆菌用于克百威污染土壤进行修复；土壤采用泥浆，水土比为3:1，溶液部分为pH=7的细菌培养液，克百威污染物的初始浓度为100mg·L-1；固定化蜡状芽孢杆菌投入土壤中的量3g/100ml，温度为15～35℃，pH值为5～10，时间为72h。
对蜡状芽孢杆菌固定的方法如下：
载体为：10.0%的聚乙烯醇、1.0%的海藻酸钠或10.0%的聚乙烯醇、1.0%的海藻酸钠和0.3%的高岭土；交联剂为：6%的硼酸，1%的氯化钙和1%的氯化铁，先包埋后交联的固定化方法。
载体为10.0%的聚乙烯醇和1.0%的海藻酸钠时，先包埋后交联的固定化方法，具体操作是：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁；将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右；再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线；将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球；交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用；取固定化蜡状芽孢杆菌小球放入含有克百威的泥浆中，降解。
载体为10.0%的聚乙烯醇、1.0%的海藻酸钠和0.30g高岭土时，先包埋后交联的固定化方法，具体操作是：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，0.30g高岭土，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁；将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右；再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线；将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球；交联6h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定10h，再增殖三次备用；取固定化蜡状芽孢杆菌小球放入含有克百威的泥浆中，降解。
优点及效果：
本发明提出了一种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，具有如下优点：
1.成本低：选择聚乙烯醇，海藻酸钠，高岭土作为固定化载体是基于它来源丰富、具有亲水性、生物相容性以及抗微生物分解特性等。选用其作为芽孢杆菌固定化载体是基于它在自然界中资源丰富，价格低廉，化学性质稳定，与其它天然材料相比更抗拒微生物分解，具有良好的热稳定性和机械操作性等优点。采用硼酸、氯化铁和氯化钙作交联剂，反应条件温和，操作简便，因而应用广泛。硫酸钠做固化剂，使载体具有体型或网状结构，性质比较稳定。
2.效果好：固定化芽孢杆菌可以在较宽的pH、温度、盐浓度、污染物初始浓度范围内处理污染物，而一般微生物仅适用于处理较低浓度的污染物。
具体实施方式：
本发明采用两种方式对芽孢杆菌进行固定化，在不同的初始浓度，不同的温度，不同的pH下，用于克百威污染土壤的修复，目的是通过固定芽孢杆菌对克百威的降解，为农药污染土壤的修复开辟一条新的途径。
一种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，其特征在于具体方法如下：将固定化芽孢杆菌用于克百威污染土壤进行修复；土壤采用泥浆，水土比为3:1，溶液部分为细菌培养液(pH=7)，污染物的初始浓度为100mg·L-1；固定化芽孢杆菌投入土壤中的量3g/100ml，温度为15～35℃，pH值为5～10，时间为72h。同时以游离的芽孢杆菌作为对照。考虑到固定化芽孢杆菌在环境中应用时，可能会遇到的一些环境影响因子进行研究。
首先是不同的温度，包括15℃和35℃，此时pH为4；其次为不同的pH值，设定为4和6，温度为35℃。实验的运行时间为72h。
对芽孢杆菌进行固定的第一种方法如下：
以聚乙烯醇和海藻酸钠为载体的固定化方法，具体操作是：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，降解72h，得到降解率为85.68%。
对芽孢杆菌进行固定化的第二种方法如下：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，0.30g高岭土，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联6h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定10h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，降解72h，得到降解率为84.45%。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不受实施例的限制。
实施例1，温度对固定化芽孢杆菌降解效果的影响：
固定化芽孢杆菌经过72h培养后，在两种不同的温度下对克百威的降解效果都可达到50%以上，自由芽孢杆菌的降解效果也比较理想，方法二的效果略好于方法一。这初步说明，从降解率的角度来看，芽孢杆菌用于修复克百威污染的土壤是可行的。
表1不同温度下固定化芽孢杆菌的相关参数
实施例2，pH对固定化芽孢杆菌降解效果的影响：
两个不同pH条件下，固定化芽孢杆菌和自由芽孢杆菌对污染物的降解都取得较好的效果，这初步说明芽孢杆菌在接近中性或偏碱性的条件下能够保持一定的活性。
表2不同pH值下固定化芽孢杆菌的相关参数
实施例3：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，2%氯化钙。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，调节pH为6.0，温度为35℃，降解72h，得到降解率为82.39%。
实施例4：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定12h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有300mg/L克百威的泥浆中，调节pH为7.0，温度为35℃，降解72h，得到降解率为80.62%。
实施例5：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，0.3g高岭土，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联6h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定10h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，调节pH为7.0，温度为20℃，降解72h，得到降解率为73.43%。
实施例6：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，调节pH为7.0，温度为35℃，降解72h，得到降解率为83.28%。
实施例7：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，调节pH为7.0，温度为35℃，加入10g氯化钠，降解72h，得到降解率为78.03%。
实施例8：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，0.3g高岭土，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁。将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右。再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线。将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球。交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用。取3g固定化芽孢杆菌小球放入含有100mg/L克百威的泥浆中，调节pH为7.0，温度为35℃，加入10g氯化钠，降解72h，得到降解率为76.67%。
结论：采用本发明这种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，使有机污染土壤得到了有效的修复。
Claims (3)
1.一种固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，其特征在于：具体步骤如下：将固定化芽孢杆菌用于克百威污染土壤进行修复；土壤采用泥浆，水土比为3:1，溶液部分为pH=7的细菌培养液，克百威污染物的初始浓度为100 mg·L-1；固定化蜡状芽孢杆菌投入土壤中的量3g/100ml，温度为15~35℃，pH值为5~10，时间为72 h；
对蜡状芽孢杆菌固定的方法如下：
载体为：10.0%的聚乙烯醇、1.0%的海藻酸钠或10.0%的聚乙烯醇、1.0%的海藻酸钠和0.3%的高岭土；交联剂为：6%的硼酸，1%的氯化钙和1%的氯化铁，先包埋后交联的固定化方法。
2.按权利要求1所述的固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，其特征在于：载体为10.0%的聚乙烯醇和1.0%的海藻酸钠时，先包埋后交联的固定化方法，具体操作是：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁；将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右；再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线；将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球；交联24h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定24h，再增殖三次备用；取固定化蜡状芽孢杆菌小球放入含有克百威的泥浆中，降解。
3.按权利要求1所述的固定化芽孢杆菌对克百威污染土壤的修复方法，其特征在于：载体为10.0%的聚乙烯醇、1.0%的海藻酸钠和0.30g高岭土时，先包埋后交联的固定化方法，具体操作是：
准确称取10.00g聚乙烯醇，1.00g海藻酸钠，0.30g高岭土，放置在100mL的烧杯中，加入60mL的蒸馏水；另外准备一个2000mL的锥形瓶，加入300mL蒸馏水和6%硼酸，1%氯化钙，1%氯化铁；将装有载体的烧杯与交联剂的锥形瓶在110℃，1.01325*105Pa条件下灭菌30分钟，待温度下降至40℃左右；再在100mL烧杯中加入20mL菌液，轻轻地沿同一个方向均匀搅拌，加无菌水至100mL刻度线；将液体通过灭菌后的制粒器流入装有交联剂2000mL的锥形瓶中，制成直径为4.0mm的固定化小球；交联6h，然后在灭菌后装有10%的硫酸钠溶液中固定10h，再增殖三次备用；取固定化蜡状芽孢杆菌小球放入含有克百威的泥浆中，降解。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |