CN117431194A - 一株解淀粉芽孢杆菌、组合物及其在切花芍药中的应用 - Google Patents
一株解淀粉芽孢杆菌、组合物及其在切花芍药中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌、组合物及其在切花芍药中的应用。本发明从芍药根际土壤中筛选出了一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36，经试验证明，该菌株能够显著促进芍药的生长和成花，具有较强的应用潜力。同时本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌G36在切花芍药栽培中的应用方法，解淀粉芽孢杆菌G36与印度梨形孢的联合应用使切花芍药的产量和品质大幅提高，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌、组合物及其在切花芍药中的应用。
背景技术
芍药（Paeonia lactifloraPall.）为芍药科、芍药属多年生宿根草本植物，是我国传统“六大名花”之一，素有“花相”之称，其花姿、花色、花型多样，具有较高的观赏价值，为重要的切花材料。近年来，芍药鲜切花产业发展迅速，产业链条迅速延伸。因此，加快芍药培育，提高芍药品质成为研发人员关注的重点。
植物根际促生菌( plant growth promoting rhizobacteria，PGPR) 是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。接种PGPR被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量和品质的方法。然而，发明人发现，目前关于芍药根际促生菌株的筛选和应用的研究极少，芍药PGPR菌株资源十分匮乏。同时，印度梨形孢（Serendipita indica）是一种多功能的、具有广泛适用性的内生真菌，定殖后起到生物生长调节刺激剂的作用。然而，同样未见有将其应用于芍药中的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌、组合物及其在切花芍药中的应用。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No. 26108的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36。
本发明从芍药根际土壤中筛选出了一株解淀粉芽孢杆菌G36，该菌株能够显著促进芍药的生长和成花，具有较强的应用潜力。该菌株已于2022年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其生物保藏号为CGMCC No. 26108。
本发明还提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂至少包含上述解淀粉芽孢杆菌G36。
所述微生物菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为菌剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。
本发明还提供一种组合物，所述组合物至少包含如下（a1）-（a2）中的任意一种：
（a1）上述解淀粉芽孢杆菌G36和印度梨形孢；
（a2）上述微生物菌剂和印度梨形孢。
其中，印度梨形孢（Serendipita indica）是一种多功能的、具有广泛适用性的内生真菌，定殖后起到生物生长调节刺激剂的作用。本发明具体使用的印度梨形孢CGMCC3.17686购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明还提供上述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36、微生物菌剂和/或组合物在切花芍药中的应用。
具体的，所述应用具体为如下任意一种或多种：
（b1）促进芍药生长；
（b2）提高芍药鲜切花的质量。
其中，
所述（b1）具体为：提高现蕾期芍药的茎部长、茎部粗以及地上部鲜重。
所述（b2）具体为：提高盛花期芍药的茎粗、蕾径、花朵直径、花朵鲜重、花朵干重及切花等级。
本发明还提供一种促进芍药生长的方法，所述方法包括：向芍药根系周围土壤中施加上述解淀粉芽孢杆菌G36或微生物菌剂。
更具体的，上述施加时间控制为芍药定植时。
其中，所述促进芍药生长具体表现为提高现蕾期芍药的茎部长、茎部粗以及地上部鲜重。
本发明还提供一种提高芍药鲜切花的质量的方法，所述方法包括：在芍药苗萌芽时，向芍药根系周围土壤中施加上述解淀粉芽孢杆菌G36或微生物菌剂；以及茎叶生长期开始时，在芍药根系周围土壤中施加印度梨形孢。
其中，所述提高芍药鲜切花的质量具体表现为提高盛花期芍药的茎粗、蕾径、花朵直径、花朵鲜重、花朵干重及切花等级。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
（1）上述技术方案提供的解淀粉芽孢杆菌G36，能够定殖于芍药根际土壤，并能够促进芍药生长。
（2）上述技术方案提供的解淀粉芽孢杆菌G36在切花芍药栽培中的应用方法，以及解淀粉芽孢杆菌G36与印度梨形孢的联合应用技术，经试验证明，二者联用能够有效提高切花芍药品质，具有良好的实际应用之价值。
生物保藏说明
生物材料G36，分类命名：解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens，于2022年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 26108。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明解淀粉芽孢杆菌G36在LB-苯胺蓝固体培养基上的平板图。
图2为本发明解淀粉芽孢杆菌G36的镜检图，比例尺为10 μm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，目前关于芍药根际促生菌株的筛选和应用的研究极少，芍药PGPR菌株资源十分匮乏。更未有将芍药PGPR菌株与印度梨形孢联用的报道。
有鉴于此，本发明从芍药根际土壤中筛选出了一株解淀粉芽孢杆菌G36，该菌株能够显著促进芍药的生长和成花，同时解淀粉芽孢杆菌G36与印度梨形孢的联合应用还能使切花芍药的产量和品质得到大幅提高。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
各实施例中使用菌株的培养方法及具体选用培养基如下：
（1）试管种子培养
解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌试管斜面培养基配方为：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH7.0-7.2。
印度梨形孢试管斜面培养基配方为：土豆200g，葡萄糖20g，自然pH。
将不同菌分别接种到各自的试管斜面培养基上，印度梨形孢在28℃恒温养72小时，其他菌均在30～35℃恒温培养24小时，获得试管种。
（2）液体发酵培养
解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵培养基配方为：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH7.0-7.2。
印度梨形孢液体发酵培养基配方为：马铃薯滤液100mL（100mL水，20g马铃薯）、麦芽汁4.370mL、酵母粉0.052g、七水硫酸镁0.040g。
将活化后的解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌接种到250mL三角瓶液体培养基中，接种量1%，每瓶装100ml，于30℃摇床培养，转速180r/min，培养24小时。
将活化后的印度梨形孢接种到500mL三角瓶液体培养基中，每瓶装300ml于30～32℃摇床培养，转速180r/min，培养72小时。
实施例中使用的印度梨形孢（CGMCC 3.17686）购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，它的培养和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。其他菌株为本实验室筛选获得。
实施例1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36的筛选及鉴定过程
（1）筛选过程：
通过梯度稀释法，从山东盛世芍花智慧农业有限公司牡丹区种植基地的芍药根际土壤中分离出156株分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备用。通过测定各细菌分离物产胞外多糖、解无机磷以及产蛋白酶的能力，筛选出8株效果较好的菌株，结合育苗试验，最终筛选出1株具有良好促生效果的细菌。经菌落特征及菌体形态、生理生化及16S rDNA等综合判定，该菌株属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
（2）菌落特征及菌体形态
Bacillus amyloliquefaciensG36在 LB 平板上培养 24 h 后形成有淡黄色菌落，圆形，不透明；表面粗糙，有隆起，边缘不规则；菌体细胞大小为 (0.7~0.8) μm × (2~3) μm；产芽孢，G+, 细胞呈杆状。
（3）生理生化特征
明胶液化试验阳性，淀粉水解试验阳性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇(V-P)试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，甲基红(MR)试验阴性、硫化氢试验阴性。
（4）解磷能力测定
将Bacillus amyloliquefaciensG36用灭菌牙签接种于无机磷细菌培养基平板，28℃培养3d后，测量溶磷圈与菌落直径，并计算溶磷圈与菌落直径之比。
菌株在无机磷细菌培养基平板上培养后，可产生透明的溶磷圈。经测量与计算，溶磷圈直径为7.5mm，菌落直径为3.5mm，溶磷圈与菌落比为2。
（5）产蛋白酶能力测定
将Bacillus amyloliquefaciensG36用灭菌牙签接种于脱脂奶粉培养基平板上，37℃培养2d后，可产生透明圈。经测量与计算，透明圈直径为16.2mm，菌落直径为5mm，透明圈与菌落比达3.24。
（6）产胞外多糖的能力测定
将菌株接种到PDA液体培养基中，培养获得发酵液。发酵液在4℃，10000 rpm条件下离心10min，将上清液转移到新离心管中。上清液置于沸水中水浴10 min，使蛋白质变性，自然冷却后在4℃，10000 rpm条件下离心15min去蛋白，保留上清液。
取2mL上清液，加入6mL的预冷的无水乙醇，4℃条件下低温萃取24h，使胞外多糖充分析出。将析出胞外多糖的上清液在10000 rpm，4℃条件下离心15min。去除上清液，保留胞外多糖沉淀；将含有胞外多糖沉淀离心管置于烘箱中50℃烘干，保存于-20℃冰箱备用。取提取的胞外多糖样品，溶解于1 mL蒸馏水中，充分震荡混匀。吸取0.2 mL于洁净试管中，用蒸馏水补充到2.5 mL，混匀后加入5 mL硫酸-蒽酮试剂，立刻塞上橡胶塞，防止水分蒸发。将试管放入沸水中水浴保温10 min，取出后自然冷却至室温。以加2.5 mL蒸馏水的试管为空白，测定在620 nm处吸光度。通过测定，该菌产胞外多糖含量为585.96mg/(L·OD 620)-1。
（5）16S rDNA序列分析
CGCGGGGGGGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTTGAACCCG（SEQ ID NO.1）。
实施例2解淀粉芽孢杆菌对芍药生长具有促生作用
选取本课题组已筛选获得并保藏的2株解淀粉芽孢杆菌Y14和GQJK49，1株蜡样芽孢杆菌L5和1株枯草芽孢杆菌GE1，与解淀粉芽孢杆菌G36一起，制备成5组接种剂。制备方法为：将各菌株在斜面培养基上活化，挑取一环接入液体培养基中，于32℃，180 rpm条件下振荡培养24h。发酵液 6000 rpm下离心5 min，无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液（108cfu/mL）制成接种剂。供试芍药品种“大富贵”，为三年实生苗。于芍药定植时，取20 ml接种剂用无菌水稀释10倍均匀浇灌于芍药根系周围。
于芍药现蕾期，观测芍药的情况，结果如表1所示，G36处理组的茎部长、茎部粗、地上部鲜重均显著增加。
表1 接种不同菌株芍药生长情况
实施例3应用试验
供试芍药为三年生“向天歌”，共设置3个处理。G36接种剂的制备方法同实施例2，按前文液体发酵培养的方法制备印度梨形孢发酵液，并调制成孢子含量105个/mL的接种剂。将接种剂与水按1:2比例混匀，按照每次每盆500mL施入。
处理1（G36+SI）：芍药苗萌芽时，在芍药根系周围施入解淀粉芽孢杆菌G36接种剂；于茎叶生长期开始时，在芍药根系周围施入印度梨形孢接种剂；
处理2（G36）：芍药苗萌芽时，在芍药根系周围施入解淀粉芽孢杆菌G36接种剂；于茎叶生长期开始时，在芍药根系周围施入1次解淀粉芽孢杆菌G36接种剂；
处理3（SI）：芍药苗萌芽时，在芍药根系周围施入印度梨形孢接种剂；于茎叶生长期开始时，在芍药根系周围施入1次印度梨形孢接种剂。
于盛花期测定各处理的茎粗、蕾径、花朵直径、花朵鲜重、花朵干重及切花等级，结果见下表2。可以看出，处理1可显著提高芍药鲜切花的质量。
表2 不同接种处理芍药切花生长情况
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36，其特征在于，该菌株已于2022年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No. 26108。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂至少包含权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36。
3.一种组合物，其特征在于，所述组合物至少包含如下（a1）-（a2）中的任意一种：
（a1）权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36和印度梨形孢；
（a2）权利要求2所述微生物菌剂和印度梨形孢。
4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36、权利要求2所述微生物菌剂和/或权利要求3所述组合物在切花芍药中的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用具体为如下任意一种或多种：
（b1）促进芍药生长；
（b2）提高芍药鲜切花的质量。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述（b1）具体为：提高现蕾期芍药的茎部长、茎部粗以及地上部鲜重；
所述（b2）具体为：提高盛花期芍药的茎粗、蕾径、花朵直径、花朵鲜重、花朵干重及切花等级。
7.一种促进芍药生长的方法，其特征在于，所述方法包括：芍药定植时向芍药根系周围土壤中施加权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36或权利要求2所述微生物菌剂。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述促进芍药生长具体表现为提高现蕾期芍药的茎部长、茎部粗以及地上部鲜重。
9.一种提高芍药鲜切花的质量的方法，其特征在于，所述方法包括：在芍药苗萌芽时，向芍药根系周围土壤中施加权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G36或权利要求2所述微生物菌剂；以及茎叶生长期开始时，在芍药根系周围土壤中施加印度梨形孢。
10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述提高芍药鲜切花的质量具体表现为提高盛花期芍药的茎粗、蕾径、花朵直径、花朵鲜重、花朵干重及切花等级。
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