KR102638877B1 - 아스퍼질러스 몬테네그로이 sfc20200425-m27 균주로부터 유래된 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
아스퍼질러스 몬테네그로이 sfc20200425-m27 균주로부터 유래된 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주로부터 유래한 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 다양한 식물병에 대하여 우수한 식물병 방제효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주로부터 유래된 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용하는 식물병 방제방법에 관한 것이다.
세계인구는 가파르게 증가하여 2050년에는 97억 명에 도달할 것으로 예측됨에 따라 적어도 50% 내지 110%의 식량 증산이 필요한 실정이다. 그러나 제한된 농경지에서 식량의 생산을 증가시키기 위해서는 식물병에 의한 작물 수확량의 손실을 최소화하는 노력이 필요하다. 농약은 식물병 방제에 있어 가장 효과적인 수단이지만, 화학 농약의 과다사용은 약제내성, 인축독성, 환경오염 등의 문제를 야기한다. 따라서 화학 농약의 사용을 줄이거나 이를 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제수단의 개발이 절실히 요구된다. 이러한 목적에서 화학 농약의 대체제로 식물 추출물이나 미생물, 또는 미생물의 이차대사산물 등의 천연소재가 새로운 식물병 방제제로써 적극적으로 개발되고 있다.
지금까지 알려진 2만3천여종 이상의 미생물 이차대산산물 가운데 42% 정도가 곰팡이에 의해 생산한다. 페니실리움(Penicillium) 속 곰팡이에서 페니실린(penicillin)을 발견한 이래 지난 몇 년간 곰팡이는 의학적인 가치나 다방면에 있어서의 활용성 덕에 많은 주목을 받아왔으며, 다양한 항균 물질들이 곰팡이로부터 분리되었다. 특히 목재부후 담자균이 생산하는 스트로빌루린(strobilurin)은 식물병원균의 미토콘드리아 호흡을 저해하는 독특한 작용기작을 가지고 있으며, 다양한 유도체 화합물이 합성되어 현재 글로벌 살균제 시장의 23% 이상을 점유하고 있다. 자낭균 페니실리움 그리세오풀범(Penicillium griseofulvum)이 생산하는 그리세오풀빈(griseofulvin)은 양파 잿빛곰팡이병균(Botrytis allii)의 정상적인 포자 발아를 저해하는 활성의 식물병 방제제로 주목 받았었고, 페스탈로티옵시스 에이더스타(Pestalotiopsis adusta)가 생산하는 페트탈라클로라이드 A―C는 푸자리움(Fusarium)과 버티실리움(Verticillium) 속 식물병원균에 대하여 항균활성을 가지며, 스타고노스포라 노도럼(Stagonospora nodorum)이 생산하는 (+)-4'메톡시-(2S)-메틸부틸로페논(methylbutyrophenone), 알터나리올(alternariol), (3R)-(―)-멜레인메틸에스터(mellein methyl ester)는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대하여 항균활성을 나타내고, 스페롭시스 사피니아(Sphaeropsis sapinea)가 생산하는 (3R,4R)-(―)-4-하이드록시멜레인(hydroxymellein)은 고추 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 양파 흰비단병균(Sclerotium rolfsii), 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea) 등 다양한 식물병원균에 대하여 항균활성을 나타낸다.
아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi)는 1996년 일본에서 토양 시료로부터 처음 분리되었고, 처음에는 에메리셀라 몬테네그로이(Emericella montenegroi)로 명명되었다. 2016년 한국 근해에서 해양미생물로 발견된 바 있다. 하지만 지금까지 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi)가 생산한 이차대사물질에 대한 화학적 특성이나 생물학적 활성에 대하여 알려진 바는 없다.
곰팡이는 다양한 종류의 항균 활성 이차대사산물을 생산하기 때문에 새로운 작물보호제를 개발하는데 적극적으로 이용될 수 있다.
본 발명자는 친환경 식물병 방제제를 개발하기 위하여 해양으로부터 분리한 다양한 균주의 여러 식물병에 대한 방제효과를 조사하던 중 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) KACC 83033BP (SFC20200425-M27), 이의 배양액, 이의 배양여액 또는 상기 배양여액의 유기용매 추출물 및 이로부터 분리한 살균활성 화합물이 다양한 식물병에 방제효과가 우수하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주로부터 유래된 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물을 이용하는 식물병 방제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제조하는 방법 및 상기 화합물이 대량생산되는 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주의 배양액으로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 배양액은 상기 균주를 배양한 배양액, 배양상등액 또는 배양상등액의 추출물일 수 있다.
상기 배양상등액의 추출물은 에틸아세테이트 또는 부탄올을 용매로 하여 추출될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 따른 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 식물병 방제용으로 허용되는 염은 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 1 중량%로 포함될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병은 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병에서 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병은 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes) 및 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병 원인균에 의해 발생하는 식물병일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병 방제용 조성물은 담체, 계면활성제 및 보조제에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 2]
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 이용하는 식물병 방제방법을 제공한다. 상기 식물병 방제방법은 직접 또는 간접 살포처리법, 휘발처리법 또는 종자처리법인 식물병 방제방법을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 3 내지 15일 동안 진탕배양하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물이 대량생산되는 식물병 방제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 4]
또한, 본 발명은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 15 내지 35일 동안 진탕배양하여 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이 대량생산되는 식물병 방제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 2]
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주로부터 유래된 화합물을 포함하여 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병 등의 다양한 식물병에 대하여 높은 방제효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물의 유효성분으로 포함되는 화합물은 특정기간동안 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 진탕배양하여 최대량으로 생산이 가능하다.
도 1은 PDA(potato dextrose agar) 배지에 배양한 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주의 균총을 나타낸 사진이다.
도 2는 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주의 Camodulin 유전자(CaM) 염기서열 분석을 바탕으로 작성된 계통수를 나타낸 도면이다.
도 3은 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주로부터 유래된 화합물을 수득하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 화합물 1의 in vivo 토마토 역병(TLB) 및 밀 붉은녹병(WLR) 방제 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주의 Camodulin 유전자(CaM) 염기서열 분석을 바탕으로 작성된 계통수를 나타낸 도면이다.
도 3은 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주로부터 유래된 화합물을 수득하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 화합물 1의 in vivo 토마토 역병(TLB) 및 밀 붉은녹병(WLR) 방제 활성을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주로부터 분리한 살균활성 화합물을 이용한 식물병 방제용 조성물에 대하여 상세히 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.
본 발명에 기재된, "포함한다"는 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
본 발명의 “방제”는 병이나 해충의 예방, 기피, 제거 또는 사멸의 의미를 포함한다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 식물병 방제용 조성물은 보다 뛰어난 식물병 방제효과를 나타낸다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주의 배양액으로부터 유래된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
수탁번호 KACC 83033BP로 기탁된 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27 균주는 서열번호 1의 calmodulin 유전자(CaM) 염기서열을 가질 수 있다. 상기 균주는 갯벌토양으로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 배양액은 상기 균주를 배양한 배양액, 배양상등액 또는 배양상등액의 추출물일 수 있다.
상기 배양상등액의 추출물은 에틸아세테이트 또는 부탄올을 용매로 하여 추출될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 아스퍼린(asperlin) 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 프로투락톤 A(protulactone A) 화합물일 수 있다.
[화학식 5]
일 실시예에 따른 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물은 농약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 농약학적으로 허용되는 염 뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
일 실시예에 따른 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 식물병 방제용으로 허용되는 염은 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 1 중량%가 포함될 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 식물병 방제용으로 허용되는 염은 조성물 총중량에 대하여 0.005 내지 0.1 중량%, 보다 바람직하게 0.01 내지 0.05 중량%일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병은 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes) 등 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀 및 고추로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 상기 식물병은 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes) 및 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병 원인균에 의해 발생하는 식물병에서 선택되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병 방제용 조성물은 담체, 계면활성제 및 보조제에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 담체는 액체 담체 또는 고체 담체일 수 있다. 액체 담체는 알코올, 케톤, 방향족 탄화수소, 지방족 탄화수소, 에스테르, 니트릴, 에테르, 아미드, 할로겐화 탄화수소, 디메틸 술폭시드, 식물성 오일 및 물에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 디에틸렌글리콜모노에틸에테르일 수 있으며, 상기 케톤은 아세톤, 시클로헥사논, 이소포론 또는 메틸에틸케톤일 수 있고, 상기 방향족 탄화수소는 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 또는 메틸나프탈렌일 수 있고, 상기 지방족 탄화수소는 헥산, 시클로헥산, 케로신 또는 라이트 오일일 수 있으며, 상기 에스테르는 에틸 아세테이트 또는 부틸 아세테이트일 수 있고, 상기 니트릴은 아세토니트릴 또는 이소부틸니트릴일 수 있고, 상기 에테르는 디이소프로필에테르 또는 디옥산일 수 있으며, 상기 아미드는 N,N-디메틸포름아미드 또는 N.N-디메틸아세트아미드일 수 있고, 상기 할로겐화 탄화수소는 디클로로메탄, 트리클로로에탄 또는 사염화탄소일 수 있고, 상기 식물성 오일은 대두유 또는 면실유일 수 있다.
또한 상기 고체 담체는 미세 분말 또는 과립을 제조시키는 물질로, 광물, 천연유기물질, 합성유기물질, 염(salt) 및 합성무기물질에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 광물은 카올린점토, 애터펄자이트점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드화이트점토, 필로필라이트, 탈크, 규조토 또는 탈사이트일 수 있으며, 상기 천연유기물질은 옥수수 잎대 분말 또는 월널 껍질 분말일 수 있고, 상기 합성유기물질은 우레아일 수 있으며, 상기 염은 탄산칼슘 또는 황산암모늄일 수 있으며, 합성무기물질은 합성 수화 산화규소일 수 있다.
상기 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 양이온성 계면활성제에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 음이온성 계면활성제는 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 또는 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물일 수 있고, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 또는 소르비탄 지방산 에스테르일 수 있으며, 상기 양이온성 계면활성제는 알킬트리메틸암모늄 염일 수 있다.
상기 보조제는 수용성 중합체, 다당류, 무기 물질, 보존제, 착색제 및 안정화제에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 수용성 중합체는 폴리비닐 알코올 또는 폴리비닐피롤리돈일 수 있고, 다당류는 아라비아 고무, 알길산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스) 또는 잔탄 고무일 수 있으며, 무기 물질은 알루미늄 마그네슘 실리케이트 또는 알루미나 졸(alumina sol)일 수 있다. 또한 보다 상세하게 상기 안정화제는 PAP(산 포스페이트 이소프로필) 또는 BHT(부틸히드록시톨루엔)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식물병 방제용 조성물은 상술된 담체, 계면활성제 및 보조제에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 더 포함하여 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 2]
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 이용하는 식물병 방제방법을 제공한다.
일 실시예에 따른 식물병 방제방법은 상기 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 식물병 방제방법은 직접 또는 간접 살포처리법, 휘발처리법 또는 종자처리법일 수 있다. 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물은 상기 식물병 방제방법을 이용하여 보다 용이하고 높은 방제효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로 상기 살포처리법은 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물을 식물체에 직접 살포하는 직접 살포처리법 또는 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포처리법을 일컫는다. 이러한 방제방법은 토양과 같은 식물이 성장하는 장소의 처리, 식물의 줄기 및 잎의 처리, 종자 멸균 또는 종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
보다 구체적으로 상기 줄기 및 잎의 처리는 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면상의 적용이 포함될 수 있다.
또한 보다 구체적으로 상기 토양의 처리는 토양 상 분무, 토양과의 혼합 또는 액체 처리계의 토양 내로의 살포방법인 액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입 또는 액체 처리제의 적하가 포함될 수 있다. 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이 또는 모판일 수 있다.
보다 상세하게 상기 토양의 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 또는 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 토양의 처리는 유효성분이 식물에 동시에 적용될 수 있으며, 유효성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 관개 튜브, 관개 파이프 또는 스프링클러 등과 같은 관개 시설에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
구체적으로 상기 휘발처리법은 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
또한 구체적으로 상기 종자처리법은 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법, 본 발명의 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액 또는 유동화제를 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법일 수 있다. 이 외에 상기 종자처리법은 종자를 특정 기간 동안 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법, 필름 코팅 처리법 또는 펠렛 코팅 처리법일 수 있다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간 또는 기후 조건에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량 %의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석 없이 처리에 사용된다.
일 실시예에 따른 식물병 방제방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물의 제조방법은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 배양하여 배양액을 형성하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 배양액은 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27 균주를 배지에 접종하여 진탕배양하여 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지는 감자 액체 배지(potato dextrose broth (PDB); 감자전분 4g, 포도당 20g, 증류수 1L) 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진탕배양은 15 내지 35℃에서 90 내지 210rpm으로 수행될 수 있으며, 구체적으로는 20 내지 30℃에서 120 내지 180rpm으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물의 제조방법은 상기 배양액으로부터 균주를 제거하여 배양상등액을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양상등액은 균주를 배양한 배양액을 원심분리하거나 가제 및 여과지로 거른 즉, 물리적으로 여과한 여액일 수 있다.
일 실시예에 따른 식물병 방제용 조성물의 제조방법은 상기 배양상등액에 추출용매를 처리하여 배양상등액의 추출물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 추출용매는 에틸아세테이트 또는 부탄올일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양상등액의 에틸아세테이트 추출물 및 부탄올 추출물은 모두 우수한 식물병 방제효과를 나타낸다.
상기 배양상등액의 에틸아세테이트 추출물 및 부탄올 추출물을 액체크로마토그래피 시스템의 역상컬럼을 통과시켜, 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 에틸아세테이트 추출물로부터 상기 화학식 1의 화합물이 분리될 수 있으며, 상기 부탄올 추출물로부터 상기 화학식 2 및 화학식 3의 화합물이 분리될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 3 내지 15일, 구체적으로는 5 내지 10일 동안 진탕배양하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물이 대량생산될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 4]
일 실시예에 있어서, 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 15 내지 35일, 구체적으로는 21 내지 28일 동안 진탕배양하여 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이 대량생산될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 2]
상기 화학식 4 및 2로 표시되는 화합물은 상기 진탕배양조건에서 제조되어 최대량으로 생산될 수 있으며, 이에따라 식물병 방제제의 공업적인 대량생산이 가능하다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 방제방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. 또한 본 발명에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
[실시예 1] SFC20150402-M24 균주의 분리
순천만 갯벌(전라남도 순천시 별량면 학신리)에서 채취한 토양 10g을 인공해수(0.48 M NaCl, 0.01 M KCl, 0.027 M MgCl2, 0.03 M MgSO4, 0.01 M CaCl2, NaHCO3) 10mL에 현탁시켰다. 현택액 100μL를 감자한천배지(potato dextrose agar; 감자전분 4g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1L)에 도말하여 25℃에서 1주간 배양하였다.
형성된 균총을 새로운 감자한천배지에 옮겨서 배양하여 SFC20200425-M27 균주를 획득하였다. 이후 SFC20200425-M27 균주는 멸균한 20% 글리세롤 수용액에 침지하여 -80℃에 보관하였다.
도 1에 감자 한천 배지에 배양한 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주의 균총을 나타내었다.
[실시예 2] SFC20200425-M27 균주의 분자계통학적 분석
실시예 1에서 분리한 SFC20200425-M27 균주를 감자액체배지(potato dextrose broth; 감자전분 4g, 포도당 20g, 증류수 1L)에 접종하여 25℃에서 1주간 150r/min으로 진탕배양하였다. AccuPrep DNA 추출 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여, 배양하여 얻은 균체로부터 유전체 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다.
PCR은 정방향 프라이머 CF1D(5′-CAGGTCTCCGAGTACAAG-3′), 역방향 프라이머 CF4(5′-CAGGTCTCCGAGTACAAG TTTYTGCATCATRAGYTGGAC-3′)와 Ex Taq polymerase(Takara, Otsu, Japan)를 이용하여 94℃에서 5분간 1회, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 34회 반복, 72℃에서 7분간 1회 조건에서 진행되었다. 수득한 PCR 수득물을 전기영동하고 Expin PCR purification kit(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 후, calmodulin 유전자(CaM) 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석 서비스(Macrogen, Daejeon, Korea)를 의뢰하였다.
시퀀싱된 CaM 염기서열 결과를 도 2에 나타내었다. 이의 결과를 바탕으로 NCBI BLASTn 데이터베이스에 등록된 다른 균주들의 CaM 염기서열과 비교 분석하였다. MAFFT 프로그램으로 염기서열을 정렬한 후 Kimura 2-parameter model과 1,000회의 부트스트랩(bootstrap) 법으로 MEGA 프로그램을 사용하여 계통수(neighbor-joining tree)를 작성하였다.
상기 서열번호를 이용하여 계통수를 작성한 결과, SFC20200425-M27 균주는 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi)에 속하는 CBM-FA-669 및 DTO 269C3 균주와 높은 상동성(99% 이상)을 가졌다. 도 3에 계통수를 나타내었다.
이러한 분석결과를 바탕으로 SFC20200425-M27 균주를 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주로 명명하고, 2020년 7월 31일자로 농촌진흥청 농업유전자원센터(KACC)에 수탁번호 KACC 83033BP로 기탁하였다.
[실시예 3] SFC20200425-M27 균주의 배양상등액의 제조
상기 실시예 1에 따른 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주를 감자한천배지(potato dextrose agar; 감자전분 4g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1L)에서 배양한 다음, 형성된 균총을 코르크 보러로 천공하여 균사 디스크(직경 8mm)를 제조하였다. 균사 디스크를 감자액체배지(potato dextrose broth; 감자전분 4g, 포도당 20g, 증류수 1L)에 접종 후 25℃에서 1주간 150r/min으로 진탕배양하여 배양액을 제조하였다. 배양액을 원심분리(10,000×g, 20분)한 후 여과지로 걸러서 배양상등액(900mL)을 제조하였다(도 3).
[실험예 1] SFC20200425-M27 균주의 배양상등액의 식물병 방제효과
상기 실시예 3에 따른 배양상등액 80mL에 트윈 20(Tween 20) 0.02g을 전착제로서 첨가하고, 이를 벼, 토마토, 밀 및 고추 유묘의 엽면에 살포하고 24시간 동안 풍건한 다음 4종의 병원균을 접종하였다. 4종의 병원균은 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)이다. 이 때, 각 식물병 당 4개의 포트를 이용하였고, 각 식물은 지름 4.5㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 20 내지 30℃의 온실에서 1주 내지 3주간 재배한 것을 이용하였다.
고추 탄저병은 접종 3일 후, 토마토 역병은 접종 4일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병은 접종 7일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다. 측정한 각 식물병의 병반면적율(%)을 다음과 같은 식에 대입하여 방제가(%)를 구하였다. 무처리구는 배양상등액이 포함되지 않은 증류수 80mL에 0.02g의 트윈 20을 처리한 것이다.
방제가(%) = [1 - (처리구의 병반면적율 / 무처리구의 병반면적율)] ×100
| 시료 | 방제가(%) | |||
| RCBa | TLB | WLR | PAN | |
| SFC20200425-M27 균주의 배양상등액 | 33 | 98 | 100 | 35 |
aRCB, 벼 도열병; TLB, 토마토 역병; WLR, 밀 붉은녹병; PAN, 고추 탄저병그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, SFC20200425-M27 균주의 배양상등액은 토마토 역병 및 밀 붉은녹병에 대하여 각각 98% 및 100%의 우수한 방제효과를 보였으며, 벼 도열병 및 고추 탄저병에 대해서는 각각 33% 및 35%의 방제효과를 나타냈다.
[실시예 4] SFC20150402-M24 균주 배양상등액의 추출물의 제조
분액여두(separatory funnel)에 실시예 3에 따른 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주의 배양상등액 800mL와 에틸아세테이트 800mL를 넣고 흔들어 준 다음 정치시켜 상층을 분리시켰다. 남은 하층에 다시 부탄올 800mL를 혼합하여 흔들어준 다음 정치시켜 상층을 분리시켜, 이들을 각각 감압농축하고 건조시켜 최종적으로 에틸아세테이트 추출물(169mg), 부탄올 추출물(169mg), 물층 추출물(1.5g)을 획득하였다(도 3).
[실험예 2] SFC20150402-M24 균주 배양상등액의 추출물의 식물병 방제효과
상기 실시예 4에 따른 에틸아세테이트 추출물(169mg), 부탄올 추출물(169mg), 물층 추출물(1.5g)을 1,000μg/mL의 농도로 준비하고, 추출물의 용해를 위해서 메탄올의 함량을 5%로 첨가한 것을 제외하고, 실험예 1과 동일한 방법으로 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제효과를 평가하였다.
| 시료 | 농도 (μg/mL) |
방제가(%) | |||||
| RCBa | TGM | TLB | WLR | BPM | PAN | ||
| 에틸아세테이트 추출물 | 1,000 | 79 | 7 | 84 | 100 | 58 | 85 |
| 부탄올 추출물 | 1,000 | 85 | 0 | 82 | 100 | 8 | 85 |
| 물층 | 1,000 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 |
aRCB, 벼 도열병; TGM, 토마토 잿빛곰팡이병; TLB, 토마토 역병; WLR, 밀 붉은녹병; BPM, 보리 흰가루병; PAN, 고추 탄저병그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트 추출물을 1,000μg/mL 농도로 식물에 처리했을 때, 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병에 대하여 각각 79%, 84%, 100%, 58% 및 85%의 우수한 방제효과를 나타냈다. 부탄올 추출물을 1,000μg/mL 농도로 식물에 처리했을 때, 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병과 고추 탄저병에 대하여 각각 85%, 82%, 100% 및 85%의 방제효과를 보였다. 물층에서는 유의미한 효과가 나타나지 않아 활성 물질은 에틸아세이트와 부탄올로 추출되는 비극성 물질임을 알 수 있었다. 그리고 추출물을 처리한 벼, 토마토, 밀, 보리, 고추 작물 모두에서 약해는 없었다.
[실시예 5] SFC20150402-M24 균주에서 유래한 화합물 1의 분리
상기 실시예 4에 따른 에틸아세테이트 추출물(169mg)을 고압액체크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography; HPLC) 시스템에 장착된 C18 역상컬럼(Phenomenex Capcell Pak C18 UG, 250mm × 20mm, 5μm)에 로딩하고, 30% 메탄올수용액을 분당 5mL의 유속으로 용출시켜, 31mg의 화합물 1(Rt = 29.7min)을 획득하였다(도 3).
화합물 1을 클로로포름-d(CDCl3, 99.96 atom% D, Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 Bruker AMX-500 핵자기공명(nuclear magnetic resonnance) 장치에서 분석하여 1H-NMR, 13C-NMR 결과를 얻었다. 하기 표 3은 화합물 1의 1H-NMR 및 13C-NMR 결과이며, 이러한 결과는 문헌에 나타난 epoxylactone계 화합물인 하기 화학식 4로 표시되는 아스퍼린(asperlin)의 NMR 결과와 일치하였다.
| 위치 | 화학적 이동 (δ in ppm) | |
| δ C, 타입 | δ H (J in Hz) | |
| 1 | 163.8, CO | |
| 2 | 125.4, CH | 7.15 d (9.7) |
| 3 | 142.2, CH | 6.27 dd (9.7, 5.8) |
| 4 | 63.3, CH | 5.45 dd (5.8, 2.8) |
| 5 | 79.3, CH | 4.48 dd (5.9, 2.8) |
| 6 | 56.6, CH | 3.20 qd (5.2, 2.1) |
| 7 | 54.7, CH | 3.09 dd (5.9, 2.1) |
| 8 | 17.3, CH3 | 1.40 d (5.2) |
| 1' | 171.3, CO | 2.17 s |
| 2' | 20.4, CH3 | |
[화학식 4]
[실시예 6] SFC20150402-M24 균주에서 유래한 화합물 3의 분리
상기 실시예 4에 따른 부탄올 추출물(169mg)을 중압액체크로마토그래피(mid-pressure liquid chromatography; MPLC) 시스템에 장착된 Biotage SNAP Ultra C18(60g) 컬럼에 로딩하고, 2%-100% 메탄올 수용액을 농도구배조건으로 5mL/min의 유속으로 용출시켜, 3mg의 화합물 3을 획득하였다(도3).
화합물 3을 DMSO-d6(99.9 atom% D, Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 Bruker AMX-500 핵자기공명(nuclear magnetic resonnance) 장치에서 분석하여 1H-NMR 및 13C-NMR 결과를 얻었다. 화합물 3의 1H-NMR 및 13C-NMR 분석 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타난 화합물 3의 1H-NMR 및 13C-NMR 결과 및 비선광도(optical rotation) 값 [α]D 23.5 = +6.2 (c 0.34, MeOH)을 문헌 데이터와 비교하여, 화합물 3은 하기 화학식 5로 표시되는 프로투락톤 A(protulactone A)임을 확인하였다.
| 위치 | 화학적 이동 (δ in ppm) | |
| δ C, 타입 | δ H (J in Hz) | |
| 1 | 175.4, CO | |
| 2 | 36.0, CH2 | 2.45, d (18.0); 2.87, dd (18.0, 5.0) |
| 3 | 77.6, CH | 4.72, t (4.6) |
| 4 | 90.1, CH | 4.75, t (4.7) |
| 5 | 75.1, CH | 4.16, d (4.7) |
| 6 | 88.2, CH | 3.73, t (4.5) |
| 7 | 69.0, CH | 4.93, m |
| 8 | 15.6, CH3 | 1.14, d (6.5) |
| 1' | 169.7, CO | |
| 2' | 20.9, CH3 | 1.95, s |
[화학식 5]
[실시예 7] SFC20150402-M24 균주에서 유래한 화합물 2의 분리
상기 실시예 6에 따른 컬럼을 통과한 여액을 다시 HPLC 시스템에 장착된 C18 역상컬럼(Phenomenex Capcell Pak C18 UG, 250mm × 20mm, 5μm)에 로딩하고, 8% 메탄올수용액을 분당 5mL의 유속으로 용출시켜, 12mg의 화합물 2(Rt = 50.1 min)를 획득하였다(도 3).
화합물 2를 메탄올-d4(CD3OD, 99.8 atom% D, Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 Bruker AMX-500 핵자기공명(nuclear magnetic resonnance) 장치에서 분석하여 1H-NMR, 13C-NMR 결과를 얻었다. ESI-MS(electrospray ionization-mass spectrometry)를 사용하여 화합물 2의 질량을 측정하였다. 화합물 2는 ESI-MS 분석에서 m/z 223.0581 [M+Na]+(Calc. m/z 223.0582)의 양이온으로 검출되었으며, 화합물 2의 화학식은 C9H12O5로 결정하였다.
표 4는 화합물 2의 1H-NMR 및 13C-NMR 결과와 HMBC 분석결과이다. 이들 결과를 바탕으로 화합물 2의 화학구조를 결정하여 하기 화학식 2로 표시하였으며, 화합물 2가 신규 화합물임을 확인하였다.
신규 화합물인 화합물 2의 13C-NMR 스펙트럼에서 5개의 쿼터너리 메틴 sp2 탄소(δ C 148.6, 145.8, 134.5, 132.2, 119.9), 1개의 메틴 sp2 탄소(δ C 104.9), 2개의 메틸렌 sp3 탄소(δ C 63.6, 56.6), 1개의 메틸 sp3 탄소(δ C 56.4)가 나타났다. HMBC 분석에서 방향족 수소 시그널(δ H 6.53)과 C-3, C-5, C-6, C-8(δ C 119.9, 134.5, 148.6, 63.6) 사이에 상관관계가 나타났고, 알코올 수소 시그널 (δ H 4.58)과 C-1, C-2, C-3(δ C 104.9, 132.2, 119.9) 사이에 상관관계가 나타났으며, 또 다른 알코올 수소 시그널(δ H 4.71)과 C-2, C-3, C-4(δ C 132.2, 119.9, 145.8) 사이에 상관관계가 나타났고, 수소 시그널(δ H 3.81)과 C-6(δ C 148.6) 사이에 상관관계가 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 신규 화합물인 화합물 2의 화학구조를 하기 화학식 2로 표시되는 4,5-하이드록실-6-메톡시-2,3-벤젠다이메탄올(4,5-hydroxyl-6-methoxy-2,3-benzendimethanol)로 결정하고 montenegrol로 명명하였다.
| 위치 | 화학적 이동 (δ in ppm) | HMBC | |
| δ C, 타입 | δ H (J in Hz) | ||
| 1 | 104.9, CH | 6.53 s | C-3, C-5, C-6, C-8 |
| 2 | 132.2, C | ||
| 3 | 119.9, C | ||
| 4 | 145.8, C | ||
| 5 | 134.5, C | ||
| 6 | 148.6, C | ||
| 7 | 56.4, CH3 | 3.81 s | C-6 |
| 8 | 63.6, CH2 | 4.58 s | C-1, C-2, C-3 |
| 9 | 56.6, CH2 | 4.71 s | C-2, C-3, C-4 |
[화학식 2]
[실험예 3] 화합물 1 내지 3의 최소억제농도 시험
식물 병원균으로 식물병원성 곰팡이인 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae) 및 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균인 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) 및 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum)을 준비하였다.
96-웰 플레이트의 100μl 웰에 곰팡이의 경우에는 포자가 1×104 spores/mL이 되도록, 그리고 세균의 경우에는 1×103 baceterial cells/mL의 농도로 포함하도록 각각 배양하였다. 실시예 5 내지 7에 따른 화합물 1 내지 3을 각각 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 31, 63, 125, 250μg/mL의 농도가 되도록 각 웰에 처리하였다. 이때 메탄올의 함량은 1% 미만이었고, 1% 메탄올만 첨가한 것을 무처리구로 사용하였다. 2-3일 동안 미생물 생장이 최적인 온도에서 배양한 다음, 육안으로 관찰했을 때 곰팡이 및 세균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)로 결정하였다.
| 식물병원균 | 최소억제농도 (μg/ml) | |||
| 화합물 1 | 화합물 2 | 화합물 3 | ||
| 곰팡이 | Alternaria brassicicola | >250 | >250 | >250 |
| Botrytis cinereal | >250 | >250 | >250 | |
| Colletotrichum coccodes | 250 | >250 | >250 | |
| Fusarium oxysporum | >250 | >250 | >250 | |
| Magnaporthe oryzae | 31 | >250 | >250 | |
| Phytophthora infestans | 1 | 250 | 125 | |
| 세균 | Agrobacterium tumefaciens | >250 | >250 | >250 |
| Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis | 125 | >250 | >250 | |
| Pseudomonas syringae pv. actinidiae | >250 | >250 | >250 | |
| Ralstonia solanacearum | >250 | >250 | >250 | |
그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 화합물 1인 아스퍼린(asperlin)은 식물병원성 곰팡이 중 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans)의 생장을 1μg/mL 농도에서 완전히 억제하는 강한 활성을 나타냈었다. 또한 화합물 1은 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae)은 31μg/mL 농도, 고추 탄저병균(Colletotricum coccodes)은 250μg/mL 농도 및 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)에 대하여 125μg/mL 농도에서 병원균의 생장을 완전히 억제했다. 한편, 화합물 2 및 3은 토마토 역병균(Phytophthora infestans)에 대하여 각각 250μg/mL와 125μg/mL의 최소억제농도값을 보였고, 동일농도에서 다른 곰팡이나 세균의 생장을 억제하는 효과는 나타나지 않았다.[실험예 4] 아스퍼린(asperlin)의 in vivo 토마토 역병과 밀 붉은녹병 방제효과 조사
상기 실시예 5 내지 7에서 얻은 화합물 1 내지 3 중 가장 우수한 활성을 나타낸 화합물 1의 식물병 방제효과를 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다(도 4).
화합물 1을 메탄올에 용해시킨 후 250μg/mL의 트윈 20 용액에 첨가하여 최종농도를 125, 250 또는 500μg/mL로 조절한 것을 제외하고, 실험예 1과 동일한 방법으로 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans) 및 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina)에 대한 방제효과를 조사하였다. 이때 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%이었다. 무처리구로 5% 메탄올과 250μg/mL의 트윈 20 용액을 사용하였으며, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병의 대조약제로 클로로탈로닐(100μg/mL) 및 플루실라졸(10μg/mL)을 사용하였다.
도 4의 A는 토마토 역병 및 밀 붉은녹병에 대한 화합물 1의 처리농도별 병방제가(%)를 나타내는 결과이고, B는 화합물 1의 상기 식물병의 방제활성을 나타내는 사진이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 화합물 1은 125μg/mL의 농도에서 토마토 역병을 90% 방제하였고, 그 이상의 처리농도에서는 방제가 95% 이상의 탁월한 식물병 방제효과를 나타냈다. 이는 상기 실험예 3에서 1μg/mL 농도의 화합물 1이 토마토 역병균(Phytophthora infestans)의 생장을 완전히 억제하는 강력한 살균 효과를 나타낸 결과와 일치하는 결과이다.
또한, 250μg/mL의 농도에서 밀 붉은녹병을 83% 방제하였고, 500μg/mL의 처리농도에서는 방제가 95%의 우수한 식물병 방제효과를 나타냈다. 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina)은 활물기생균으로 in planta 조건에서만 약효의 검정이 가능하기 때문에, 이 실험을 통해서 화합물 1의 살균활성 스펙트럼이 상기 실험예 3에서 나타난 식물병원성 곰팡이뿐만이 아니라 밀 붉은녹병균도 포함하는 것을 확인할 수 있다. 이 때 토마토와 밀 식물에 약해는 없었다.
[실험예 5] 최적 배양기간 조사
상기 실시예 1에 따른 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주를 감자한천배지(potato dextrose agar; 감자전분 4g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1L)에서 배양한 다음, 형성된 균총을 코르크 보러로 천공하여 균사 디스크(직경 8mm)를 제조하였다. 균사 디스크를 감자액체배지(potato dextrose broth; 감자전분 4g, 포도당 20g, 증류수 1L)에 접종 후 3, 5, 7, 10, 14, 21 또는 28일동안 25℃에서 150r/min으로 진탕배양하여 배양액을 제조하였다. 상기 배양액을 원심분리(10,000×g, 20분)한 후 실린지 필터(0.2μm pore size)로 걸러서 배양상등액(800mL)을 제조하였다.
균주 배양기간에 따른 화합물 1과 화합물2의 생산량을 조사하기 위하여, 20μl의 배양상등액을 Agilent Pursuit C18 A(250Х4.6mm) 컬럼이 조합된 HPLC 시스템에 로딩하고, 10%―100% 메탄올 수용액을 농도구배조건으로 1mL/min의 유속으로 용출시켜, 230nm에서 검출되는 화합물 1(RT 8.0min)과 화합물 2(RT 12.9 min)의 면적을 측정하였고, 사전에 준비한 각 화합물의 검량선을 사용하여 분석된 피크의 면적으로부터 검출되는 각 화합물의 양을 계산하였다.
또한, 배양기간에 따른 배양상등액의 항균활성을 조사하기 위해, 96-웰플레이트에 40μL의 상기 배양상등액, 50μL의 포자현탁액(4×104 spores/mL), 100μL의 감자 액체 배지, 10μL의 증류수를 넣었다. 이때, 배양상등액 대신 40μL의 증류수를 넣은 것을 무처리구로 사용하였다.
벼 도열병균(Magnaporthe oryzae)은 25℃에서, 토마토 역병균(Phytophthora infestans)는 20℃에서 1-2일간 배양한 후 OD600 값을 측정하였다. 다음 계산식에 따라 균사생장억제율(%)을 계산하였다.
균사생장억제율(%) = [1 - 처리구의 OD600 값 / 무처리구의 OD600 값] × 100
| 배양기간(일) | 생산량(μg/mL) | 균사생장억제율(%) | ||
| 화합물 1 | 화합물 2 | Magnaporthe oryzae | Phytophthora infestans | |
| 3 | 32 | 0 | 2 | 97 |
| 5 | 108 | 0 | 61 | 100 |
| 7 | 129 | 10 | 66 | 100 |
| 10 | 114 | 40 | 69 | 100 |
| 14 | 87 | 83 | 67 | 100 |
| 21 | 33 | 229 | 58 | 92 |
| 28 | 8 | 263 | 27 | 86 |
그 결과, 표 7에서 나타난 바와 같이, SFC20200425-M27 균주의 접종 7일 후의 배양상등액에서 가장 많은 양인 129μg/mL의 화합물 1이 검출되었고, 이후 배양 기간이 증가함에 따라 생산량이 감소하였다. 화합물 2는 화합물 1의 생산이 최대가 되는 접종 후 배양 7일째까지 거의 생산되지 않다가 그 후에는 배양 기간에 비례하여 생산량이 증가하였다. 따라서 화합물 1 및 2의 생산량은 서로 부의 상관관계가 있음을 알 수 있다.그리고 SFC20200425-M27 균주의 접종 후 7-10일 째의 배양상등액에서 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae)을 억제하는 활성이 최대치로, 66-69%의 균사생장억제율이 되었다. 또한, 접종 후 5-14일 째의 배양상등액에서 토마토 역병균(Phytophthora infestans)을 100% 억제하는 효과가 나타났다. 두 종류의 식물병원균에 대한 배양상등액의 억제활성은 배양 14일 이후에는 감소하는 경향을 나타냈다.
이러한 결과는 식물병 방제효과가 가장 우수한 배양상등액이 감자액체배지에서 접종한 SFC20200425-M27 균주를 25℃에서 7일 내지 14일 진탕배양할 때 생성되는 것을 나타낸다. 또한 실시예 5에 따른 화합물 1은 감자 액체 배지에서 접종한 SFC20200425-M27 균주를 25℃에서 5일 내지 10일 진탕배양할 때 가장 많이 생산되며, 실시예 7에 따른 화합물 2는 21일 내지 28일 진탕배양할 때 가장 많이 생산되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주의 배양상등액은 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에서 뛰어난 식물병 방제효과를 나타내었다. 또한 배양상등액의 에틸아세테이트 추출물 및 부탄올 추출물에서도 우수한 식물병 방제효과를 나타내었다. 이들 추출물을 컬럼분리하여 화합물 1 내지 3을 얻었으며, 화합물 1은 아스퍼린(asperlin)으로, 화합물 3은 프로투락톤 A(protulactone A)로 확인되었으며, 화합물 2는 신규물질인 것으로 확인되었다.
화합물 1의 아스퍼린(asperlin)은 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)에서 최초 발견된 물질로 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 곰팡이가 생산하는 화합물로 알려져 있다. 항세균, 항염증, 항암 활성과 더불어 인체병원성 곰팡이인 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergills fumigatus) 등 인체병원성 곰팡이에 대한 항균활성이 보고된 바 있으나, 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 항균효능은 알려진 바 없다. 화합물 3의 프로투락톤 A(protulactone A)는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 해양곰팡이 SF-5044에서 분리된 물질로 지금까지 알려진 생물 활성은 없다.
화합물 1이 포함된 에틸아세테이트 추출물과 화합물 2가 포함된 부탄올 추출물은 우수한 식물병 방제효과를 나타내었고, 아스퍼질러스 몬테네그로이(Aspergillus montenegroi) SFC20200425-M27 균주를 특정기간동안 진탕배양한 배양상등액을 이용한 경우, 가장 우수한 식물병 방제효과를 나타내었다. 또한 진탕배양하는 기간에 따라 우수한 식물병 방제효과를 지니는 화합물 1 또는 2의 최대 생산량을 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 이용하여 화합물 1 및 2를 산업적으로 대량생산 할 수 있다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> Composition for controlling plant diseases comprising compound
derived from Aspergillus montenegroi SFC20200425-M27 strain and
method for preparing the same
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> calmodulin gene (CaM)
<400> 1
ctgtttgtaa ggccattggt tactgttata tcaaattcga atttatattg agagtatact 60
aatgtattcc gcacttaaca ggacaaggat ggcgatggtt agtgcatttg tccccccaga 120
cctgatcgca ttcgcccagc gtgtctgctg tagctctata taaaccgatt ctgataaacg 180
gcgacaggcc agattaccac taaggagctt ggcactgtca tgcgctcgct cggtcagaat 240
ccttcagagt ctgagcttca ggacatgatc aacgaagtgg acgccgacaa caatggcacc 300
attgactttc caggtacgcg aactttcagt ctacttcgca ccaagctaga aaccgtacta 360
atgctaaaca gagttcctta ccatgatggc cagaaagatg aaggacaccg attccgagga 420
ggaaattcgg gaggcgttca aggtcttcga ccgtgacaac aatggtttca tctccgctgc 480
tgagctgcgt cacgtcatga cctct 505
Claims (7)
- 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주의 배양액으로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하고,
파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae) 및 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물병 원인균을 억제하는, 식물병 방제용 조성물.
[화학식 1]
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 유효성분은 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 1 중량%로 포함되는 식물병 방제용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 식물병 방제용 조성물은 담체, 계면활성제 및 보조제에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 더 포함하는 식물병 방제용 조성물. - 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항의 식물병 방제용 조성물을 이용하는 식물병 방제방법.
- 제 5항에 있어서,
상기 식물병 방제방법은 직접 또는 간접 살포처리법, 휘발처리법 또는 종자처리법인 식물병 방제방법. - 아스퍼질러스 몬테네그로이 SFC20200425-M27(수탁번호 : KACC 83033BP) 균주를 3 내지 15일 동안 진탕배양하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 대량생산하여 식물병 방제용 조성물을 제조하고,
상기 조성물은 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae) 및 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병 원인균을 억제하는, 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
[화학식 4]
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