KR101590255B1 - 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 제조된 고리형 다이펩타이드의 제조방법 - Google Patents

미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 제조된 고리형 다이펩타이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주의 고체발효분으로부터 고리형 다이펩타이드를 분리 정제하고 그 화학구조를 규명한 것으로써, 미생물 발효액으로부터 분리하여 확보하는 제조 방법에 관한 것이다.

Description

미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 제조된 고리형 다이펩타이드의 제조방법 {Cyclic Dipeptide purified from fermented liquor of Bacillus vallismortis BS07M and Method for producing the same}
본 발명은 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 의학적으로나 농학적으로 유용성을 가질 수 있는 고리형 다이펩타이드를 분리하고 그 화학구조를 규명하여 제시함으로써, 이 미생물 발효액으로부터 고리형 다이펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
고리형 다이펩타이드 화합물은 다양한 생물학적 작용을 가지고 있다. 고리형 다이펩타이드 화합물은 암세포, 바이러스, 곰팡이 등에 의학적 효과를 나타낸다고 보고되었으며 (문헌 1. Martins, M, B.; Carvalho, I. Tetrahedron, 2007, 9923-9932), 식물면역증강 효과를 나타내서 농업용약제로도 사용가능하다고 보고되었으며 (대한민국 등록특허 ; 제10-1278140호), 다이펩타이드 유도체를 활성 성분으로 함유하는 농업용 작물 보호제 (대한민국 등록특허 ; 제10-1352566호) 에서는 식물병 방제 효능, 식물 생육 촉진 효능, 및 식물 면역 증강 효능을 가지는 다이펩타이드 유도체 또는 농약학적으로 허용 가능한 이의 염을 활성성분으로 하는 농업용 작물 보호제로서 알려져 있다.
이러한 고리형 다이펩타이드는 곰팡이나 이스트 등의 발효액에서도 존재하는 것으로 밝혀지고 있으며 (문헌 2. Prasad, C. Peptides, 1995, 16, 151-164), 여러 가지 화학적 방법으로도 제조가 가능한 것으로 알려져 있다. (문헌 3. Dinsmore, C.; Beshore, D. C. Tetrahedron, 2002, 58, 3297-3312).
이에 본 발명에서는 작물의 생육촉진 및 내한성 증강 효과를 나타내는 미생물 균주 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M (대한민국 공개특허 제10-2013-0032100호)의 발효액으로부터 대사물질들을 분리 및 동정하여 구조를 규명하였는바, 식물에 전신 병저항성을 유도하는 효능을 나타낼 수 있는 고리형 다이펩타이드의 존재를 확인함으로써, 미생물 자체에 존재하는 화합물보다 타켓 화합물을 분리 정제하여 좀 더 안정적이면서 산업적으로 활용할 수 있도록 하였다.
대한민국 등록등록 제101278140호 대한민국 공개특허 제1020130032100호 대한민국 등록특허 제101352566호
문헌 1. Martins, M, B.; Carvalho, I. Tetrahedron, 2007, 9923-9932 문헌 2. Prasad, C. Peptides, 1995, 16, 151-164 문헌 3. Dinsmore, C.; Beshore, D. C. Tetrahedron, 2002, 58, 3297-3312
본 발명의 목적은 공지된 미생물 균주 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M를 이용하여 그 미생물의 발효액으로부터 고리형 다이펩타이드를 분리 및 정제한 후 그 구조를 확인하고, 본 미생물 발효액에 고리형 다이펩타이드의 존재성을 밝히는 것을 목적으로 하였으며, 또한 그 발효액으로부터 이들 물질을 효과적으로 정제하여 안정적으로 확보하는 방법을 제시하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 미생물 균주 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M를 tryptic soybean agar에 28℃에서 배양하고, 이 배양액을 메탄올로 추출하여 용매를 날린 농축액을 확보한 다음, 부탄올을 이용한 용매 분획 및 실리카겔 크로마토그라피 법으로 순수한 물질을 분리하여 얻는다. 상기 과정에 의해 분리동정된 물질은 핵자기공명법 등의 유기분광학적 방법으로 분자구조를 규명하고 알려진 합성법에 따라 재차 구조를 확인하였고, 발효액에 존재하는 물질의 존재를 규명한다. 이렇게 확립된 물질들은 아래 화학식 1과 화학식 2로 표시되는 고리형 다이펩타이드 계열 물질들이다.
[화학식 1]
Figure 112014059897423-pat00001

[화학식 2]
Figure 112014059897423-pat00002
본 발명은 암세포, 바이러스, 곰팡이 등에 의학적 효과를 나타내고, 식물면역증강 효과를 나타내서 농업용약제로도 사용가능하며, 식물병 방제 효능, 식물 생육 촉진 효능, 및 식물 면역 증강 효능을 가지는 다이펩타이드 유도체인 고리형 다이펩타이드 화합물을 미생물 균주인 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M으로부터 고리형 다이펩타이드를 분리 정제하고 그 화학구조를 규명함으로써, 이들 고리형 다이펩타이드 화합물질이 상기 미생물 균주에 의해서 생산됨을 밝히는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 대상 미생물인 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M으로부터 분리 추출되어 제조된 고리형 다이펩타이드 물질들은 항암, 항바이러스, 항진균 효과, 전신 식물면역증강 효과 등이 보고되고 있는바, 더 나은 부가가치의 의약 또는 농업용 약제로 활용될 수 있다.
도 1은 고리형 다이펩타이드를 분리 제조하는 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 고리형 다이펩타이드 화합물 1 ~ 화합물 11의 분리 정제 과정을 나타내는 도식도이다.
도 3은 고리형 다이펩타이드 화합물 1 ~ 화합물 9를 포함하는 분석 HPLC 스펙트럼이다.
이하에서는 도면을 참고하여 본 발명의 실시를 위한 상세한 설명을 한다.
도 1에서와 같이 고리형 다이펩타이드를 분리 제조하는 과정에 따라 상세한 설명을 한다. (도 1)
본 발명은 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주의 tryptic soybean agar 배지에 발효한 고체발효분으로부터 고리형 다이펩타이드를 분리 정제하고 그 화학구조를 규명한 것으로써, 미생물 발효액으로부터 분리하여 확보하는 방법과 구조규명법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주를 발효하기 위해 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주를 tryptic soybean agar 배지 (20 L)에 접종한 후에, 28℃로 유지된 무균 상태의 배양기에서 1주일간 배양하였다.
상기 미생물 균주의 발효분을 유기용매로 추출한다. 상기 추출에 사용되는 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 등을 포함하는 지방족 알콜, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 또는 혼합 용매를 사용할 수 있다. 상기 유기용매 추출은 1회 내지 수십 회 반복하여 수행할 수도 있으며, 이렇게 얻은 추출액을 모아서 감압농축하여 갈색의 점성 액체를 얻게 된다.
이렇게 얻은 용매추출물을 C18 역상 실리카겔 크로마토그래피하여 활성 분획을 얻게 된다. 예를 들면, 메탄올 수용액 (0% ~ 100%)을 사용하여 극성을 감소시키면서 용출시켜서 분획을 얻는다. 이들 분획은 TLC로 분석하여 비슷한 것들 끼리 총 11개의 분획 (#B1 ~ #B11)을 모은다. (도 2)
세 번째의 분획 (#B3)을 비율 80:20:0 에틸 아세테이트/메탄올/물을 사용하여 비율 30:63:7까지 극성을 증가시키면서 융출시켜서 나온 것들을 TLC로 비슷한 것들끼리 모아서 19개의 그룹(#B3A ~ #B3W)을 얻었다. (도 2)
상기에서 얻은 추출물 중 두 번째 분획(#B3B)을 25 ~ 30%의 수용성 메탄올로 용출시키면서 C22 역상 HPLC 하였다. 머무름 시간 (1) 5.857, (2) 12.466, (3) 13.271, (4) 14.422, (5) 18.609, (6) 19.661, (7) 21.825, (8) 25.819, (9) 31.102 min의 피크들은 화합물 1인 물질 cyclo(L-Met-D-Pro), 화합물 2인 cyclo(L-Tyr-L-Pro), 화합물 3인 cyclo(L-Val-D-Pro), 화합물 4인 cyclo(L-Val-L-Pro), 화합물 5인 cyclo(L-Met-L-Pro), 화합물 6인 cyclo(L-Ala-L-Ile), 화합물 7인 cyclo(L-Ala-L-Leu), 화합물 8인 cyclo(L-Ile-D-Pro), 화합물 9인 cyclo(L-Leu-L-Pro)으로 규명되었다. (도 2)
두 번째 분획(#B3B)에서 추출된 화합물의 각 피크들에 대한 분취 HPLC 농축된 분석스펙트럼은 도 3과 같다. (도 3)
상기에서 얻은 추출물 중 열세번째 분획 #B3M으로부터 화합물 10인 cyclo(L-Phe-D-Pro)과 화합물 11인 cyclo(L-Phe-L-Pro)를 분리하였다 (도 2).
이들 물질의 화학구조는 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 해석하여 규명하였다. 또한 이들은 알려진 문헌의 합성법에 따라 합성하여 물질의 구조를 확인하였다 (Thajudeen, H.; Park, K.; Moon, S-S,; Hong, I. S. Tetrahedron Lett. 2010, 51, 1303-1305).
이하에서는 상기 제조공정에 따른 본 발명의 실시예를 통해 보다 상세한 설명을 하기로 한다. 다만, 이들의 실시예는 본 발명의 내용의 이해를 돕기 위해 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니며, 단순한 제조방법의 치환 및 설계변경은 본 발명의 기술범위에 포함되어야 하며, 당업자에게 있어 본 발명을 통해 용이하게 실시할 수 있는 정도의 기술을 포함한다.
< 실시예 1. 미생물 균주의 발효 ( E1 )>
미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주를 tryptic soybean agar 배지 (20 L)에 접종한 후에, 28℃로 유지된 무균 상태의 배양기에서 1주일간 배양하였다.
< 실시예 2. 미생물 균주 발효분에 대한 유기용매로 추출 및 농축 ( E2 )>
이 tryptic soybean agar 배지 20 L를 메탄올 20 L로 으깨어 우러난 액을 모으고, 다시 한번 더 메탄올 20 L로 배지를 우려내서 나온 액을 앞의 것과 합쳐서 진공증발기에서 농축하였다. 이 농축액을 다시 200 mL의 50% 수용성 메탄올에 녹인 후에, 부탄올 2 L로 3회 추출하여 이 부탄올 층을 농축하였다.
상기의 미생물 균주의 발효분의 추출에 사용되는 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 등을 포함하는 지방족 알콜, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 또는 혼합 용매를 사용할 수 있다.
상기 유기용매 추출은 1회 내지 수십 회 반복하여 수행할 수도 있으며, 이렇게 얻은 추출액을 모아서 감압농축하면 갈색의 점성 액체를 얻게 된다.
< 실시예 3. C18 역상 실리카겔 크로마토그래피 1차 분리과정에 의한 11개 분획 분리 정제 ( E3 )>
상기 실시예 2의 추출 및 농축과정을 거쳐 얻은 갈색의 점성 농축물(43.5 g)을 역상 실리카겔 칼럼 (C18, 40 x 63 μm, 90 x 70 mm)에 올린 후에, 물 100%에서부터 10% 씩 메탄올의 양을 증가시키면서 용출시켜서 총 11개의 분획(#B1 ~ #B11)을 얻었다 (#B1, 28 g; #B2, 3 g; #B3, 2.0 g; #B4, 3 g; #B5, 2 g; #B6, 3 g; #B7, 1.5 g; #B8, 4.5 g; #B9, 2 g; #B10, 1.5 g; #B11, 1 g). (도 2)
< 실시예 4. #B3분획에 대한 2차 분리과정 ( E4 )>
상기 실시예 3에 의해 얻은 11개의 분획 중 분획 #B3을 실리카겔 크로마토그라피(Silica Redi Sep Rf, 50 x 220 mm, 80:20:0에서 30:63:7 비율의 EtOAc/MeOH/H2O)하여, 총 19개의 분획(#B3A ~ #B3W)을 얻었다.
< 실시예 5. #B3B 분획에 대한 C18 역상 실리카겔 크로마토그래피 분리과정 ( E5 )>
상기 실시예 4에 의해 얻은 19개의 분획(#B3A ~ #B3W) 중에서 #B3B (130 mg)을 HPLC (Cosmosil C22, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20-30% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm)하여, 도 3의 피크에 해당하는 피크를 모아서 농축하여 고리형 다이펩타이드 물질들 (화합물 1 ~ 화합물 9)을 얻었다. (도 3)
(분석 HPLC, YMC pak pro C18, 4.6 x 300 mm, 25-30% 수용성 메탄올, 40 분 동안 기울기 용출법, 0.7 mL/min)
화합물 1 (머무름시간 5.857 min, 2.7 mg),
화합물 2 (머무름시간 12.466 min, 32 mg),
화합물 3 (머무름시간 13.271 min, 4.0 mg),
화합물 4 (머무름시간 14.422 min, 19 mg),
화합물 5 (머무름시간 18.609 min, 12 mg),
화합물 6 (머무름시간 19.661 min, 6.0 mg),
화합물 7 (머무름시간 21.825 min, 12 mg),
화합물 8 (머무름시간 25.819 min, 6.0 mg),
화합물 9 (머무름시간 31.102 min, 2.5 mg).(도 2)
<실시예 6. #B3M 분획에 대한 C18 역상 실리카겔 크로마토그래피 분리과정 (E5)>
상기 실시예 4에 의해 얻은 11개의 분획 중 분획 #B3M (92 mg)을 다시 HPLC 하여 고리형 다이펩타이드 물질들 (화합물 10 ~ 11)을 얻었다.
(Chromosep C18, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20-40% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm)
화합물 10, cyclo(L-Phe-D-Pro) (머무름 시간 60 min, 8.5 mg)
화합물 11, cyclo(L-Phe-L-Pro) (머루름 시간 68 min, 9.3 mg) 얻었다 (도 2).
< 실시예 7. 고리형 다이펩타이드의 구조 분석>
상기의 실시예 5와 실시예 6에 얻은 각각의 화합물 1 ~ 화합물 9와 화학물 10 ~ 화합물 11을 규명하기 위하여 아래와 같이 수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 실시하였다.
< 실시예 7-1. 화합물 1: cyclo (L- Met -D- Pro )의 구조분석>
화합물 5의 수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 methionine과 proline으로 구성된 고리형 다이펩타이드로 추정되었으며, 1 M HCl로 110 ℃가수분해하여 표준 물질과 비교하였을 때, L-methionine과 D-proline임을 알았다 (1:1:4 비율의 MeOH/H2O/MeCN, chiral plate TLC, Alltech). 점성액체, 1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ 7.55 (1H, s), 4.05 (2H, m), 3.60 (1H, m), 3.48 (1H, m), 2.60 (2H, m), 2.35 (1H, m), 2.05 (3H, s), 2.01-1.80 (4H, m), 1.75 (1H, m) ppm.
< 실시예 7-2. 화합물 2: cyclo (L- Tyr -L- Pro )의 구조분석>
화합물 2의 수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 tyrosine과 proline의 구조가 분석되었고, 1 M HCl로 가수분해하여 L-tyrosine (Rf 0.74, 1:1:4 비율의 MeOH/H2O/MeCN, chiral plate TLC, Alltech)과 L-proline이 있음을 알아냈다.
백색고체, mp 147-149oC; UV (MeOH) λmax 221.8, 273.7 nm; 1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 7.03 (2H, d, J = 8.0 Hz), 6.69 (2H, d, J = 8.0 Hz), 4.35 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.04 (1H, dd, J = 10.8, 6.4 Hz), 3.54 (1H, dt, J = 12.0, 8.4 Hz), 3.35 (1H, q, J = 6.4 Hz), 3.08 (1H, dd, J = 14.4, 5.2 Hz), 3.03 (1H, dd, J = 14.4, 5.2 Hz), 2.09 (1H, sext, J = 5.4 Hz), 1.80 (2H, m), 1.22 (1H, quin, J = 10.5 Hz) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d 4) δ 169.6, 165.8, 156.5, 130.9 (two Cs), 126.4, 115.0 (two Cs), 58.9, 56.7, 44.7, 36.5, 28.2, 21.5 ppm.
< 실시예 7-3. 화합물 3: cyclo (L- Val -D- Pro )의 구조분석>
이 물질의 수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 isopropyl 그룹의 특징적인 피크가 1.01 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.98 (3H, d, J = 7.2 Hz) ppm에서 관찰되었으며, 앞에서와 같은 D-proline의 피크들도 관찰되었다. 1 M HCl로 가수분해하여 L-valine (Rf 0.64, 1:1:4 비율의 MeOH/H2O/MeCN, chiral plate TLC, Alltech)과 D-proline이 있음을 알아냈다.
1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 4.23 (1H, dd J = 10, 6.4 Hz), 3.64-3.57 (2H, m), 3.48 (H, m), 2.34 (1H, m), 2.13 (1H, sext, J = 6.6 Hz), 2.01 (1H, m), 1.86-1.90 (2H, m), 1.01 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.98 (3H, d, J = 7.2 Hz) ppm
< 실시예 7-4. 화합물 4: cyclo (L- Val -L- Pro )의 구조분석>
수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 isopropyl 그룹의 특징적인 피크가 1.09 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.93 (3H, d, J = 7.2 Hz) ppm에서 관찰되었으며, 앞의 cyclo(L-Val-D-Pro)와 이성질체인 것으로 판명되었다. 따라서 1 M HCl로 가수분해하여 chiral TLC로 L-valine과 L-proline이 있음을 알았다.
백색고체; mp 177-179oC, UV (MeOH) λmax end absorption, 1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 4.19 (1H, br t, J = 8.0 Hz), 4.03 (1H, brs), 3.46-3.59 (2H, m), 2.48 (1H, m), 2.31 (1H, m), 1.95 (1H, m), 1.89~2.04 (2H, m), 1.09 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.93 (3H, d, J = 7.2 Hz) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ 171.4, 166.4, 60.3, 58.8, 45.0, 28.7, 28.3, 22.1, 17.6, 15.5 ppm.
< 실시예 7-5. 화합물 5: cyclo (L- Met -L- Pro )의 구조분석>
화합물 5의 수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 methionine 부분에 해당하는 피크들[1H NMR: 2.09 (3 H, s, S-methyl), 2.61 (2H, m, S-methylene), 2.18 (1H, m, β-proton), 2.06 (1H, m, β-proton), 4.27 (1H, m, α-proton); 13C NMR: 15.3, 30.5, 30.4, 55.6, 172.7 ppm)]이 관찰되었으며, proline 부분에 해당하는 피크들[1H NMR: 3.52 (2H, m,ε-proton), 1.98 (1H, m, γ-proton), 1.93 (1H, m, γ-proton), 2.29 (1H, m, β-proton), 1.96 (1H, m, β-proton), 4.24 (1H, m, α-proton); 13C NMR: 46.6, 23.6, 29.4, 60.5, 168.0 ppm)]구조가 분석되었다. HMBC 스펙트럼에서 proline의 α-proton이 methionine의 carbonyl그룹과, methionine의 α-proton이 proline의 carbonyl 그룹과 상관관계를 보였으므로, 이들 아미노산들이 서로 고리를 이루어서 만들어진 고리형 다이펩타이드로 규명한다. 이들은 1M HCl로 110 ℃가수분해하여 표준 물질과 비교하였을 때, L-methionine과 L-proline임을 알았다 (1:1:4 비율의 MeOH/H2O/MeCN, chiral plate TLC, Alltech).
1H NMR (400 MHz, methanol-d 4)δ 4.27 (1H, m), 4.24 (1H, m), 3.52 (2H, m), 2.61 (2H, m), 2.29 (1H, m), 2.18 (1H, m), 2.09 (3 H, s), 2.06 (1H, m), 1.98 (1H, m), 1.96 (1H, m), 1.93 (1H, m) ppm; 13C NMR: 172.7, 168.0, 60.5, 55.6, 46.6, 30.5, 30.4, 29.4, 23.6, 15.3 ppm.
< 실시예 7-6. 화합물 6: cyclo (L- Ala -L- Ile )의 구조분석>
1H NMR (400 MHz, methanol-d 4) δ 4.03 (1H, qd, J = 8.0, 1.2 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 3.2, 1.2 Hz), 1.95 (1H, m), 1.50 (1H, m), 1.44 (3H, d, J = 7.2 Hz), 1.25 (1H, m), 1.02 (3H, J = 2 Hz), 0.95 (3H, t, J = 7.2) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ: 169.8, 167.7, 59.5, 50.2, 38.8, 24.2, 19.5, 14.1, 10.8 ppm.
< 실시예 7-7. 화합물 7: cyclo (L- Ala -L- Leu )의 구조분석>
이 물질의 핵자기 공명자료는 아래와 같으며, 고리형 구조임을 지지하는 정보로는 HMBC 스펙트럼에서 Alanine의 알파 양성자가 leucine의 carbonyl 그룹과 상관관계이다.
1H NMR (400 MHz, methanol-d 4) δ 3.99 (1H, dd, J = 6.8, 0.8 Hz), 3.93 (1H, ddd, J = 8.4, 4.8, 0.8 Hz), 1.84 (1H, m), 1.73 (1H, ddd, J = 13.2, 8.4, 4.8 Hz), 1.63 (1H, ddd, J = 13.2, 8.4, 6.0 Hz), 1.44 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.95 (3H, d, J = 6.8 Hz) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ:171.6, 171.1, 54.9, 52.1, 45.2, 25.6, 23.7, 22.2, 21.0 ppm.
< 실시예 7-8. 화합물 8: cyclo (L- Ile -D- Pro )의 구조분석>
수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 sec-butyl 그룹의 특징적인 피크와 proline의 피크가 관찰되었으며, 가수분해결과 D-proline이 들어 있는 것을 알아냈다.
1H NMR (400 MHz, methanol-d 4) δ 4.23 (1H, dd J = 9.8, 6.8 Hz), 3.67 (1H, d, J= 6.4 Hz), 3.60 (1H, m), 3.48 (H, m), 2.34 (1H, m), 2.0 (1H, m), 1.86-1.90 (3H, m), 1.59 (1H, m), 1.22, (1H, m), 0.99 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.94 (3H, d, J = 7.6 Hz) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ 170.4, 167.7, 62.3, 58.5, 45.6, 39.8, 29.1, 24.8, 21.7, 14.5, 10.4 ppm.
< 실시예 7-9. 화합물 9: cyclo (L- Leu -L- Pro )의 구조분석>
수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 leucine과 proline이 있음을 알았으며, 가수분해하여 L-leucine과 L-proline의 존재를 확인하였다.
백색고체; mp 161-163oC; UV (MeOH) λmax end absorption; 1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 4.25 (1H, br t, J = 8.0 Hz), 4.12 (1H, m), 3.51 (2H, m), 2.30 (1H, m), 2.01 (1H, m), 1.89-2.01 (2H, m), 1.88 (1H, m), 1.85 (1H, m), 0.96 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.95 (3H, d, J = 6.8 Hz) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ 171.6, 167.7, 59.1, 53.4, 45.2, 38.2, 27.9, 24.6, 22.5, 22.1, 22.0 ppm.
< 실시예 7-10. 화합물 10: cyclo (L- Phe -D- Pro )의 구조분석>
수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과 aromatic 그룹이 있음을 알아냈으며, 가수분해하여 phenylalanine과 proline이 있음을 알아냈다. chiral TLC로 이들은 L과 D-형임을 알아냈다.
백색고체; mp 148-151oC; UV (MeOH) λmax end absorption, 255.9; 1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 7.28-7.31 (3H, m), 7.18 (2H, dd, J = 7.2, 2.4 Hz), 4.20 (1H, t, J = 4.8 Hz), 3.53 (1H, dt, J = 12.0, 8.4 Hz), 3.27-3.33 (1H, m), 3.19 (1H, dd, J = 14.0, 4.8 Hz), 2.99 (1H, dd, J = 14.0, 4.8 Hz), 2.60 (1H, t, J = 6.4 Hz), 2.02 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.67 (1H, m), 1.61 (1H, m) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ 170.1, 166.2, 135.5, 130.1 (two Cs), 128.5 (two Cs), 127.3, 58.6, 57.9, 45.0, 39.8, 28.6, 21.3 ppm.
< 실시예 7-11. 화합물 11: cyclo (L- Phe -L- Pro )의 구조분석>
수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정한 결과, aromatic 그룹이 있음을 알아냈으며, 가수분해하여 phenylalanine과 proline이 있음을 알아냈다. chiral TLC로 이들은 L과 L-형임을 알아냈다.
백색고체; mp 148-150oC; UV (MeOH) λmax end absorption, 257.1 nm; 1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 7.27 (2H, m), 7.20-7.26 (3H, m), 4.44 (1H, br t, J = 5.2 Hz), 4.05 (1H, dd, J = 11.2, 6.8 Hz), 3.53 (1H, m), 3.36 (1H, m), 3.15 (2H, m), 2.08 (1H, m), 1.20 (1H, m), 0.78 (2H, m) ppm; 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ 171.6, 167.0, 137.4, 131.2 (two Cs), 129.6 (two Cs), 128.2, 60.2, 57.8, 46.1, 38.4, 29.5, 22.9 ppm.
본 발명의 대상미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주로부터 실시예 1 ~ 실시예 3에 의한 C18 역상 실리카겔 크로마토그래피 1차 분리과정 (E3)에 의한 11개의 화합물 중 얻은 #B3분획에 대하여 2차 분리과정 (E4)을 통해 총 19개의 분획(#B3A ~ #B3W)을 얻었고, 그 중 #B3B 분획에 대한 C18 역상 실리카겔 크로마토그래피 분리과정 (E5)을 통해,
화합물 1: cyclo(L-Met-D-Pro),
화합물 2: cyclo(L-Tyr-L-Pro),
화합물 3: cyclo(L-Val-D-Pro),
화합물 4: cyclo(L-Val-L-Pro),
화합물 5: cyclo(L-Met-L-Pro),
화합물 6: cyclo(L-Ala-L-Ile),
화합물 7: cyclo(L-Ala-L-Leu),
화합물 8: cyclo(L-Ile-D-Pro),
화합물 9: cyclo(L-Leu-L-Pro)을 얻었고,
#B3M 분획에 대한 C18 역상 실리카겔 크로마토그래피 분리과정 (E6)을 통해
화합물 10: cyclo(L-Phe-D-Pro) 및
화합물 11: cyclo(L-Phe-L-Pro)을 얻었는바,
수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼 분석 (E7)을 통해 고리형 다이펩타이드임을 확인하였으므로, 본 발명의 실시예를 통한 대상 미생물인 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M으로부터 분리 추출되어 제조된 고리형 다이펩타이드 물질들은 항암, 항바이러스, 항진균 효과, 전신 식물면역증강 효과 등이 보고되고 있는바, 더 나은 부가가치의 의약 또는 농업용 약제로 활용될 수 있다.

Claims (3)

  1. 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 제조된 고리형 다이펩타이드의 제조방법에 있어서,

    미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주를 tryptic soybean agar 배지 (20 L)에 접종한 후에, 28℃로 유지된 무균 상태의 배양기에서 1주일간 배양하는 미생물 균주의 발효단계 (E1);

    미생물 발효액을 추출하기 위하여, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 등을 포함하는 지방족 알콜, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어진 유기용매로부터 선택된 단일유기용매 내지 1종이상의 혼합 유기용매에 의한 추출단계;
    상기 유기용매 추출은 1회 내지 수십 회 반복하여 수행할 수도 있으며, 이렇게 얻은 추출액을 모아서 감압농축 과정을 포함하는 유기용매에 의한 추출 및 농축단계 (E2);

    상기 추출액 또는 농축액을 C18역상 실리카겔 칼럼 (C18, 40 x 63 μm, 90 x 70 mm) 하여 1차 분리정제하는 단계 (E3);

    상기 1차 분리단계 (E3)에서 얻은 분획 #B3를 실리카겔 크로마토그라피(Silica Redi Sep Rf, 50 x 220 mm, EtOAc/MeOH/H2O 의 80:20:0 ~ 30:63:7 중량% 비율)하는 2차 분리단계 (E4);

    상기 2차 분리단계 의해 얻은 분획 #B3B를 Cosmosil C22, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20-30중량% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm 조건에서 HPLC 하는 단계 (E5);

    상기 2차 분리단계 의해 얻은 분획 #B3M을 Chromosep C18, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20~40중량% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm 조건에서 HPLC 하는 단계 (E6);

    상기 분획 #B3B를 Cosmosil C22, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20-30중량% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm 조건에서 HPLC하여 얻은 화합물(E5) 또는 분획 #B3M을 Chromosep C18, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20~40중량% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm 조건에서 HPLC 하여 얻은 화합물(E6) 중에서 선택된 하나의 화합물을 수소와 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 통해 고리형 다이펩타이드의 구조를 분석하는 단계 (E7);

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 분리 정제된 고리형 다이펩타이드의 제조방법.
  2. 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 제조된 고리형 다이펩타이드의 제조방법에 있어서,

    미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주를 tryptic soybean agar 배지 (20 L)에 접종한 후에, 28℃로 유지된 무균 상태의 배양기에서 1주일간 배양하는 미생물 균주의 발효단계 (E1);

    미생물 발효액을 추출하기 위하여, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 등을 포함하는 지방족 알콜, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어진 유기용매로부터 선택된 단일유기용매 내지 1종이상의 혼합 유기용매에 의한 추출단계;
    상기 유기용매 추출은 1회 내지 수십 회 반복하여 수행할 수도 있으며, 이렇게 얻은 추출액을 모아서 감압농축 과정을 포함하는 유기용매에 의한 추출 및 농축단계 (E2);

    상기 추출액 또는 농축액을 C18역상 실리카겔 칼럼 (C18, 40 x 63 μm, 90 x 70 mm) 하여 1차 분리정제하는 단계 (E3);

    상기 1차 분리정제단계 (E3)에서 얻은 분획 #B3를 실리카겔 크로마토그라피(Silica Redi Sep Rf, 50 x 220 mm, EtOAc/MeOH/H2O 의 80:20:0 ~ 30:63:7 중량% 비율)하는 2차 분리단계 (E4);

    상기 2차 분리단계 의해 얻은 분획 #B3B를 Cosmosil C22, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20-30중량% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm 조건에서 HPLC 하는 단계 (E5); 에 의해 순수하게 정제분리된
    Figure 112016000618286-pat00017
    (R1 :(R)-H, R2 : methylthiorthyl) 구조의 cyclo(L-Met-D-Pro) 또는,
    Figure 112016000618286-pat00018
    (R1 :(S)-H, R2 : p-hydroxyphenylmethyl) 구조의
    cyclo(L-Tyr-L-Pro)또는,
    Figure 112016000618286-pat00019
    (R1 :(R)-H, R2 : isoprophyl) 구조의 cyclo(L-Val-D-Pro)또는,
    Figure 112016000618286-pat00020
    (R1 :(S)-H, R2 : isoprophyl) 구조의 cyclo(L-Val-L-Pro)또는,
    Figure 112016000618286-pat00021
    (R1 :(S)-H, R2 : methylthioethyl) 구조의 cyclo(L-Met-L-Pro)또는,
    Figure 112016000618286-pat00022
    (R1 :methyl, R2 : 1-methylprophyl) 구조의 cyclo(L-Ala-L-Ile)또는,
    Figure 112016000618286-pat00023
    (R1 :methyl, R2 : 2-methylprophyl) 구조의 cyclo(L-Ala-L-Leu)또는,
    Figure 112016000618286-pat00024
    (R1 :(R)-H, R2 : 1-methylpropyl) 구조의 cyclo(L-Ile-D-Pro)또는,
    Figure 112016000618286-pat00025
    (R1 :(S)-H, R2 : 2-methylpropyl) 구조의 cyclo(L-Leu-L-Pro) 의
    고리형 다이펩타이드의 제조방법
  3. 미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주 발효액으로부터 제조된 고리형 다이펩타이드의 제조방법에 있어서,

    미생물 Bacillus vallismortis BS07M 균주를 tryptic soybean agar 배지 (20 L)에 접종한 후에, 28℃로 유지된 무균 상태의 배양기에서 1주일간 배양하는 미생물 균주의 발효단계 (E1);

    미생물 발효액을 추출하기 위하여, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 등을 포함하는 지방족 알콜, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어진 유기용매로부터 선택된 단일유기용매 내지 1종이상의 혼합 유기용매에 의한 추출단계;
    상기 유기용매 추출은 1회 내지 수십 회 반복하여 수행할 수도 있으며, 이렇게 얻은 추출액을 모아서 감압농축 과정을 포함하는 유기용매에 의한 추출 및 농축단계 (E2);

    상기 추출액 또는 농축액을 C18역상 실리카겔 칼럼 (C18, 40 x 63 μm, 90 x 70 mm) 하여 1차 분리정제하는 단계 (E3);

    상기 1차 분리정제단계 (E3)에서 얻은 분획 #B3를 실리카겔 크로마토그라피(Silica Redi Sep Rf, 50 x 220 mm, EtOAc/MeOH/H2O 의 80:20:0 ~ 30:63:7 중량% 비율)하는 2차 분리단계 (E4);

    상기 2차 분리단계 의해 얻은 분획 #B3M을 Chromosep C18, 21.4 x 250 mm, Varian, 용출액 20~40중량% 수용성 메탄올, 100 분, 7mL/min, 220 nm 조건에서 HPLC 하는 단계 (E6); 에 의해 순수하게 정제분리된
    Figure 112016000618286-pat00026
    (R1 :(R)-H, R2 : Phenylmethyl) 구조의 cyclo(L-Phe-D-Pro)또는,
    Figure 112016000618286-pat00027
    (R1 :(S)-H, R2 : Phenylmethyl) 구조의 cyclo(L-Phe-L-Pro)의
    고리형 다이펩타이드의 제조방법
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