TW200825182A - Novel bacillus bacterium strain capable of degrading/volume-reducing plant residue - Google Patents

Description

200825182 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於具有分解並減少植物殘渣容積能力之新 穎桿菌菌株、含其之分解並減少植物殘渣容積之資材、以 及使用此等之分解並減少植物殘渣容積之方法。 【先前技術】 關於庭院或高爾夫球場之綠地等，必須定期地修整草 坪，定期地產生草坪草之碎草。另外，已知枯死的碎草或 草坪草或其他植物的莖、葉、根等之殘渣以未分解的狀態 堆積於草坪上，形成茸草（thatch)。長期放置如此碎草或 茸草時，各種病原菌發生、增殖，或發生有害氣體，該結 果係引起草坪草枯死或生長發育不良等之受害。尤其，形 成孢子菌之病原菌一旦發生時，促進茸草層內孢子形成， 此成爲病原菌之新穎接種源，使受害更加嚴重。另外，已 知土壤上因刈草或茸草層堆積一定以上厚度，妨礙空氣、 水、營養源、農藥等移至土壤或草坪草根部，其結果係引 起草坪草生長發育障礙，或容易發生疾病。爲除去引起如 此問題之刈草或茸草，傳統上於高爾夫場等實施垂直切割 或曝氣（aeration)、鋪砂寺之物理手段。然而，此等方法 難稱得上係簡便的方法，定期實施時需要勞力，並亦有花 費成本等之問題。另外’藉由此等方法，不能充份地除去 刈草及茸草。 另外，發生於河川或道路之雜草之管理，至今係實施 -4- 200825182 雜草之割草、乾燥、集草、搬運、燒毁，但現在法律嚴格 規定簡易露天焚燒處理或掩埋處理。尤其龐大量的刈草處 理就環境、美觀、成本面上成爲大的問題。 另外’收穫農作物後所剩餘的殘渣等若直接放置於田 裡等，因爲成爲病原菌之發生來源，所以希望儘快地除去 或分解，但與上述雜草管理同樣地於環境、成本等上成爲 大的問題。

如此狀況下’揭示藉由使用細菌等之微生物分解並減 少刈草或茸草以除去之方法。例如已知具有分解纖維素能 力之青徽菌屬細菌或浸麻芽孢桿菌（Bacillus macerans)等 ，揭示施用此菌體於具有刈草或茸草層之土壤（專利文獻1 、2)。然而，含有此等細菌之微生物資材之刈草或茸草之 分解能力並不足夠，不能實際運用。另外，雖然上述任一 種細菌皆於一定之試驗條件下增殖，可分解刈草或茸草， 但於實際運用階段，日照、溫度、降雨等之自然條件對該 增殖速度等影響大，而有不能得到充份且安定的效果之問 題。 另外，關於雜草，雖亦檢討堆肥化而利用的方法，但 關於適用的具體微生物，並未進行充份的檢討，而有效果 不安定的問題（專利文獻3)。 專利文獻1 :特許第3 324 9 79號公報 專利文獻2 :特許第3 2 83228號公報 專利文獻3 :特開平1 1 -2 40 7 84號公報 200825182 【發明內容】 發明之揭示 本發明係以提供以短時間充份地分解並減少植物殘渣 容積之方法，用以使用於該方法之細菌、及含該細菌之分 解並減少植物殘渣容積之資材爲課題。尤其，以發現即使 於自然條件下仍充份地安定，具有分解並減少植物殘渣容 積能力之細菌，利用於分解並減少植物殘渣容積用爲課題

〇 本發明者等爲解決上述課題，努力進行硏究的結果係 發現具有優異的分解並減少植物殘渣容積能力之細菌。接 著，加入含培養此細菌所得培養物之資材於植物殘渣時， 發現促進分解並減少植物殘渣容積，達成完成發明。 亦即，本發明係如下所述。 (1 )具有分解並減少植物殘渣容積之能力之短小芽孢 (2) 含有如（1)記載之菌株及/或具有分解並減少植物殘 渣容積能力之該菌株之突變株之菌體、或該菌體培養物作 爲有效成份之分解並減少植物殘渣容積之資材。 (3) 加入如（2)記載之分解並減少植物殘渣容積之資材 於植物殘渣爲特徵之分解並減少植物殘渣容積之方法。 用以實施發明之最佳形態 本發明之短小芽孢桿菌（Bacillus Pumilus)KS-C4菌株 係由本發明者等自埼玉縣之高爾夫場土壤所分離之菌株， -6- 200825182

具有分解並減少植物殘渣容積能力爲特徵。所謂「植物殘 渣」係指至少含有植物的葉、莖、花、根等之植物體之至 少邰份，而且必須除去、分解者，例如包含高爾夫場、庭 院等之刈草或茸草、鋸屑、樹皮、修剪材料等之木質物、 稻桿、麥桿等之穀物莖類、稻殼、麩皮等之榖物殘渣、農 作物等之收穫殘渣、農作物等之土壤中之根部殘渣、包含 蔬菜等之植物之家庭廚餘、攝取植物家畜的糞、食品產業 廢棄物等。另外，所謂「分解並減少植物殘渣容積之能力 」係指加入菌體於植物殘渣時，以該植物殘渣所含之建構 植物體之多糖類作爲營養源增殖，該結果係指使減少植物 殘渣固形物之質量或體積之能力 短小芽孢桿菌KS-C4菌株之菌學上性質係如下所述。 KS-C 4菌株係具有纖維分解酵素活性及果膠酯酶活性 。所謂具有纖維分解酵素活性及果膠酯酶活性係指培養菌 體所得之培養物中，可檢測出纖維分解酵素活性及果膠酯 酶活性之程度，稱爲產生此等酵素。具體上係指於細胞內 產生纖維分解酵素及果膠酯酶，於細胞壁外側附著產生的 纖維分解酵素及產生的果膠酯酶，或分泌產生的纖維分解 酵素及產生的果膠酯酶於細胞外。 纖維分解酵素係水解纖維素之iS 1— 4糖苷鍵之酵素。 纖維分解酵素係包含無規分解纖維素鍵之末端葡聚醣酶 (endglucanase)、及自纖維素之還原末端分解纖維素鏈， 產生纖維二糖之纖維二糖水解酶（cen〇bi〇hydrolase)二者 。果膠酯酶係水解構成果膠、果膠酯酸（pectinic acid)、 200825182 果膠酸（pectic acid)之半乳糖醛酸（galacturonic acid)之 α 1 ^ 4鍵之酵素。 KS-C4菌株之16SrRNA基因之DNA鹼基序列係如序 列號碼1。另外，使用BLAST之對於GenBank/DDBJ/EMBL 之相同性搜尋之結果係KS-C4菌株之16SrRNA以相同率 99.8%，顯示與短小芽孢桿菌DSMZ27之1 6SrRNA相同性 高。

由此推定KS-C4菌株係歸屬於短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus) 〇 KS-C4菌株係自平成18年8月2日，以委託號碼FERM P-2 0978寄存於獨立行政法人產業技術總合硏究所特許生 物寄託中心（茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，於平 成1 9年6月1 9日，基於布達佩斯條約移存於國際寄存，賦 予委託號碼FERM BP- 1 0842。 KS-C4菌株係可由培養短小芽孢桿菌所使用之方法而 培養。例如培養溫度雖可以1 0〜4 0 °C進行，但通常係以3 0 〜35 °C培養爲宜。另外，培養方法係可由使用往復式振盪 培養、桌上型培養裝置（Jar-fermenter)培養等之液體培養 法或固體培養法。 培養用培養基成份亦無特別限制，可使用動物性或植 物性中任一種，例如可使用含麩皮、米糠、麥、乳製品等 之資材。另外’可添加作爲碳來源之葡萄糖、蔗糖、糖蜜 等之糖類、檸檬酸等之有機酸類、甘油等之醇類、及作爲 氮來源之氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等之銨鹽或硝酸鹽 -8 - 200825182 等。 另外，爲保存KS-C4菌株之菌體’就品質安定性之觀 點，使以孢子的狀態乾燥保存爲宜。使形成孢子時係只要 於培養週期，調整培養基組成、培養基PH、培養溫度、 培養濕度、培養時之氧濃度等之培養條件以使適合於該孢 子形成條件。

本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係含有KS-C4菌株及/或具有分解並減少植物殘渣容積能力之該KS-C4菌株之突變株之菌體、或該菌體培養物作爲有效成份爲 特徵。所謂「菌體培養物」係指培養菌體所得之培養物。 本發明使用之KS-C4菌株之突變株及基因重組株係可 使用具有分解並減少植物殘渣容積能力，而且維持該能力 之菌株。 KS-C4菌株之突變株係藉可由自使KS-C4菌株自然突 變，或以化學突變劑或紫外線等突變處理所得之菌株，選 出KS-C4菌株之分解並減少植物殘渣容積之能力係與KS-C4菌株相同或增強之菌株而得。另外，亦適宜選出進一步 維持其他良好性質之菌株。 另外，本發明中亦可使用KS-C4菌株之基因重組株。 如此之基因重組株係可由改變調節該基因表現之基因，導 入於K S - C 4菌株，以增強參與分解並減少植物殘渣容積之 能力之基因表現而得。另外，亦可改變以增強或賦予上述 能力以外之其他適合性質。 另外，於本說明書中，包含上述KS-C4菌株之突變株 200825182 ，有時亦僅稱爲「KS-C4菌株」。 本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材所含有KS· C4菌株之菌體係可爲孢子狀態，亦可爲營養細胞之狀態。 通常就保存性之觀點，以孢子狀態爲宜。

本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材中之KS-C4 菌株之菌濃度係只要加入植物殘渣時菌體不死亡’爲可增 殖之濃度即可，雖無特別限制，但通常爲1 X 1 〇4〜1 x 10"CFU/g，以 lxlO7 〜lxl01GCFU/g 爲宜。 另外，本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係以 更含有促進上述芽孢桿菌屬細菌增殖用之營養源爲宜。藉 由添加營養源，加入本發明之分解並減少植物殘渣容積之 資材於植物殘渣後，因爲促進上述芽孢桿菌屬細菌增殖’ 將可更迅速地分解並減少植物殘渣容積。 營養源的種類係只要不損及本發明之功效，並無特別 的限制，可選擇通常芽孢桿菌屬細菌增殖所使用者。 本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係自培養 KS-C4菌株而得之培養物，將含有培養KS-C4菌株之菌體 之至少一部份，直接或與其他任意成份混合而可製造。 例如，使用固體培養基進行培養時，可將所得之培養 物之至少一部份乾燥、粉碎，使用於製造分解並減少植物 殘渣容積之資材。另外，使用液體培養基進行菌體培養時 ，亦可直接使用所得之培養物，亦可由離心分離所得之培 養物分離菌體後，由噴霧乾燥或冷凍乾燥而乾燥使用。 本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係爲提高作 -10- 200825182

爲製品之品質安定性、保存性，以使乾燥爲宜。乾燥係進 行使分解並減少植物殘渣容積之資材之含水量成1 〇質量％ 以下爲宜。乾燥方法並無特別的限制，雖可舉例如自然乾 燥、通風乾燥、噴霧乾燥、冷凍乾燥等，其中以使用噴霧 乾燥及通風乾燥爲宜。乾燥時，可使用脫脂奶粉、麩胺酸 鈉及糖類等之保護劑。使用糖類時，可使用葡萄糖或海藻 糖。另外，乾燥後，於所得之乾燥物中加入脫氧劑、脫水 劑，放入阻氣性之鋁袋密封，以於室溫至低溫貯藏爲宜。 藉此，可長期保存活的細菌。 另外，本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係亦 可於KS-C4菌株之菌體或菌體培養物中，加入液體載體、 固體載體、界面活性劑（乳化劑、分散劑、消泡劑等）、補 助劑等之任意物質加工。此等任意物質係只要爲環境上安 全者，並無特別的限制，可使用通常土壤散布劑、肥料等 所使用者。 作爲液體載體，可舉例如磷酸緩衝溶液、碳酸緩衝溶 液、生理食鹽水等。另外，作爲固體載體，可舉例如陶土 、黏土、滑石、白堊、石英、坡縷石（綠坡縷石）、蒙脫石 、矽藻土等之天然礦物粉末、矽酸、氧化鋁、矽酸鹽等之 合成礦物粉末、結晶性纖維素、玉米澱粉、明膠、褐藻酸 等之高分子性天然物。另外，作爲界面活性劑，可舉例如 聚環氧乙烷·脂肪酸酯、聚環氧乙烷·脂肪醇醚、烷基芳基 聚乙二醚、烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、芳基磺酸酯等。作 爲補助劑，可舉例如羧甲基纖維素、聚氧化乙烯醇、阿拉 -11 - 200825182 伯膠、澱粉、乳糖等。

本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係加入植物 殘渣後使用。加入方法係可因應對象植物殘渣存在地點或 面積等而採用適當的方法。例如使用於高爾夫場、庭院、 田地等之植物殘渣時，可舉例如散布粉劑、由水等之液體 稀釋粉劑成例如1 〇〇〇倍程度散布之方法。另外，使用廚餘 、家畜排泄物、食品產業廢棄物等時，加入粉劑或液劑後 ，混合之方法。 本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材之加入量係 只要KS-C4菌株不死亡，具有可增殖之菌體數即可，無特 別的限制。例如換算成乾燥粉末時之濃度，通常加入0.1 〜50g/m2，以 0.5 〜10g/m2 爲宜，或 0.1 〜100g/m3，以 0.5 〜2 0 g / m3爲宜。 另外，本發明之分解並減少植物殘渣容積之資材係可 與通常植物生長發育所使用之無機肥料、有機肥料、除草 劑等一起使用。 【實施方式】 實施例 (1)分離KS-C4菌株 於埼玉縣之高爾夫場之含茸草部份的土壤中，混合高 麗草之刈草及水，以25 °C放置30天。接著，自此土壤分離 10株於含有羧甲基纖維素（CMC)之瓊脂平板培養基上形成 大的抑菌環（透明環）之芽孢桿菌菌類。由其中選出分解高 -12- 200825182 麗草能力最高的菌株，作爲KS-C4菌株。 (2)製造分解並減少植物殘渣容積之資材

將上述所得之KS-C4菌株，使用肉汁培養基（含肉萃 取物、蛋白腺、KH2P〇4、MgS04之液體培養基）’以30°C 放置2天，所得之液體培養物作爲實驗例1之分解並減少植 物殘渣容積之資材。此液體培養物之菌濃度爲idWCFU/g 。另外，對於短小芽孢桿菌 NBRC 1 2092菌株及枯草桿菌 BSTH-1菌株，亦進行相同的培養，所得之液體培養物分 別作爲比較例1及比較例2之資材。 接著，此等液體培養物作爲種菌，接種於固體培養物 之基材之整粒大豆（以高壓滅菌釜121 °C，30分鐘滅菌）’ 以3 0 °C培養2天。以室溫風乾在此所得之各菌株之固體培 養物後，使用硏磨機粉碎。混合黏土礦物及界面活性劑 (SOLPOL 5 0 82:東邦化學工業社製）於此粉碎物，調整菌濃 度成5xl08CFU/g者，分別作爲實施例2之分解並減少植物 殘渣容積之資材、比較例3、比較例4之資材。 另外，短小芽孢桿菌NBRC1 2092菌株係註冊於獨立 行政法人製品評估技術基盤機構之生物遺傳資源部份 (NBRC)(千葉縣木更津市上總鎌足2_5·8)之菌株。枯草桿 菌BSTH-1菌株係本發明者等發現自千葉縣內田地土壤之 菌株，具有高纖維分解能力之菌株，自平成17年9月13日 ，以委託號碼FERM Ρ-20663寄存於獨立行政法人產業技 術總合硏究所特許生物寄託中心（茨城縣筑波市東1 丁目1 -13- 200825182 番地1中央第6)，於平成19年6月19日’基於布達佩斯條約 移存於國際寄存，賦予委託號碼FERM Bp-10842。 (3)分解並減少刈草容積之試驗

關於上述所得實施例1之分解並減少植物殘渣容積之 資材，使用高爾夫場之高麗草刈草之分解試驗’評估分解 並減少刈草容積之能力。將高爾夫場球道之高麗草之刈草 ，切斷成5〜1 0mm者，日曬1 0天，使充份乾燥，各取所 定量（1 g)於燒瓶。添加1 0 m 1的水於各燒瓶，以局壓滅菌签 滅菌後，添加各10(^l(lxl08CFU/g)之實施例1之分解並減 少植物殘渣容積之資材、比較例1、比較例2之資材，於2 8 t靜置1 4天。1 4天後以二層紗布回收燒瓶內之刈草’以水 輕輕洗淨後，以70 °C乾燥24小時，測定殘留重量。算出此 殘留重量相對於加入分解並減少植物殘渣容積之資材前之 植物殘渣的乾燥重量之比率（分解率（％))。 結果如表1所示。 表1 菌株名 分解率(％) 實施例1 短小芽孢桿菌 K S - C 4菌株 30.0 比較例1 短小芽孢桿菌 NBRC1 2092 菌株 7.5 比較例2 枯草桿菌 BSTH-1菌株 4.1 -14- 200825182 如表1所示，實施例1之分解並減少植物殘渣容積之資 材係藉由14天的處理，分解30 %之咼麗早之刈早。力方 面，比較例1之資材之分解率爲7·5%，比較例2之資材之为 解率爲4.1%。由此判定KS-C4菌株係比屬於同種之其他囷 株、屬於同屬之其他菌株’具有非常強的分解並減少別早 容積之能力。

(4 )分解並減少茸草容積之試驗 關於上述所得實施例2之分解並減少植物殘渣容積之 資材，評估分解並減少茸草容積之能力。評估係使用千葉 縣內之高爾夫場之綠草（本特草）。分別以水稀釋實施例2 之分解並減少植物殘渣容積之資材、比較例3、比較例4之 資材成1 000倍後，散布以使每lm2綠草爲lg資材（5 X 108CFU/g)。散布60天後，以切土刀回收各處理區3個草坪 草之部份試樣，以流水洗淨根部土壤後，測定草坪草之莖 葉部份之下方殘留茸草部份之厚度。另外，算出各處理區 之茸草部份厚度之平均値，與無處理區之差作爲茸草減少 率（％)評估。 結果如表2所示。 -15- 200825182 表2 菌株名 茸草厚度 (mm :平均値) 茸草減少率 (%) -^- 實施例2 短小芽孢桿菌 KS-C4菌株 28.9 23.2 比較例3 短小芽孢桿菌 NBRC1 2092 菌株 32.4 14.1 比較例4 枯草桿菌 BSTH-1菌株 33.6 10.8 無處理區 37.7 - 一

由表2可知，由實施例2之分解並減少植物殘渣容積之 資材之處理區，於60天後，與無處理區比較，茸草部份厚 度減少2 3.2 %。另一方面，由比較例3之資材之處理區之茸 草減少率爲1 〇 . 8 %，由比較例4之資材之處理區之茸草減少 率爲14.1%。由此判定KS-C4菌株係比屬於同種之其他菌 株、屬於同屬之其他菌株，具有非常強的分解並減少茸草 容積之能力。 (5)分解並減少刈草容積之試驗 以相同方法評估上述所得實施例2之分解並減少植物 殘渣容積之資材之分解並減少刈草容積之能力’以與（3) 相同方法評估。評估用刈草之植物種如表3所示。此等植 物係來自河川堤防等之茂盛雜草者。將此等刈草以日曬1 0 天充份乾燥後，切斷成5〜1 〇 m m，取所定量（2 g)於燒瓶。 添加3 0ml的水於此燒瓶，以高壓滅菌釜滅菌後’添加各 -16- 200825182 10 0 // U1 X 108CFU/g)之實施例1之分解並減少植物殘渣容 積之資材’於2 8 °c靜置1 4天。於1 4天後，與（3 )同樣地測 定乾燥重量，評估分解並減少容積之程度。 [評估基準]

◎:減少5 0 %以上 〇：減少2 0〜5 0 % 結果如表3所示。 表3 雜草名 科 分解並減少容積的程度 豬殃殃 茜草科 ◎ 杏竹 禾本科 〇 鴨茅 L_禾本科 _ 〇 芒草 禾本科 〇 菊芋 菊科 ◎ 鼠麹草 菊科 ◎ 問荆 相戎科 ◎ 野葛藤蔓 豆科 〇 如表3所示，K S - C 4菌株顯不通各種雜早’尤其濶葉 雜草之高度分解並減少容積之能力。由此判定本發明之分 解並減少植物殘渣容積之資材係可適合使用於分解並減少 草容積。 (6)分解並減少農作物殘渣容積之試驗 -17- 200825182

關於上述所得實施例2之分解並減少植物殘渣容積之 資材，評估分解並減少草莓收穫後之土壤中根部殘渣之容 積之能力。草莓收穫後，殘留根部殘渣之草莓園，以水稀 釋實施例2及比較例4之分解並減少植物殘渣容積之資材成 1 000倍後，散布成每lm2爲5g資材（2.5xl09CFU/g)。散布 3 0天後，採取一定量之各處理區3處土壤，風乾。接著， 將風乾土壤過篩（網眼爲2mm)，回收篩網上殘留根、莖等 之根部殘渣，測定重量（殘渣含量），算出與無處理區之差 作爲殘渣減少率（％)。 結果如表4所示。 表4 菌株名 殘渣含量 殘渣減少率(％) 實施例2 短小芽孢桿菌 K S - C 4菌株 0.62 42.6 比較例4 枯草桿菌 BSTH-1菌株 0.76 29.6 無處理區 - 1.08 - 由表4可知，由實施例5之分解並減少植物殘渣容積之 資材之處理區，於3 〇天後’與無處理區比較’根部殘渣減 少4 2.6 %。另一方面，由比較例4之資材之處理區之殘渣減 少率僅止於29.6%。由此判定KS-C4菌株係比屬於同屬之 其他菌株，具有非常強的分解並減少農作物殘渣容積之能 力。 -18-

Claims (1)

1. 200825182 十、申請專利範圍 1 一種短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)KS-C4菌株 (PERM BP-108 42)，其特徵爲具有分解並減少植物殘渣容 積之能力。 2.—種分解並減少植物殘澄容積之資材’其特徵爲含 有如申請專利範圍第1項之菌株及/或具有分解並減少植物 殘渣容積能力之該菌株之突變株之菌體、或該菌體培養物 作爲有效成份。 3· 一種分解並減少植物殘渣容積之方法，其特徵爲加 入如申請專利範圍第2項之分解並減少植物殘渣容積之資 材於植物殘渣。 -19 - 200825182 1 SEQUENCE LISTING <110> Idemitsu Kosan Co., Ltd. <120〉分解並減少植物殘渣容積之新穎桿菌菌株 <130〉 0600443-7186 <150〉JP 2006-273131 <151> 2006-10-04

   <160> 1 <170> Patent In version 3.1 <210〉 1 <211> 532 <212〉 DNA 〈213〉短小芽孢桿菌 〈400> 1 60 120 180 240 300 360 420 480 gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg aacagaaggg agcttgctcc cggatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggagcta ataccggata gttccttgaa ccgcatggtt caaggatgaa agacggtttc ggctgtcact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtggggta atggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtgcgag agtaactgct cgcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta at 532 200825182 明 說 單 無簡 ituu :# 為符 圖件 表元 代之 定圖 :指表 圖案代 表本本 無 定一二 !=.曰 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：無