CN116121121A - 一种贝莱斯芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，该贝莱斯芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.24124。本发明还公开了一种微生物菌剂，以所述贝莱斯芽孢杆菌为活性组分。本发明还公开了所述贝莱斯芽孢杆菌用于制备微生物菌剂的应用，以及所述微生物菌剂用于防治植物病害的应用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌可用于制备微生物菌剂，且对于油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、柑橘溃疡病等由多种作物病害都具有良好的防治效果，具有很好的应用前景。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用。
背景技术
油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、柑橘溃疡病等由植物病原菌引起的植物病害不仅影响农产品的产量，更是严重影响产品的品质，给农业生产带来极大的危害。对于这些病害的防控，除了采用抗病品系培育、种植管理等生物技术、农业措施外，药物防控依然是主要的控制手段。
随着人们对健康需求的提升，化学农药的残留、对环境的压力以及长期使用导致的病原菌抗性等问题引起更多的关注。由于微生物生防菌不易造成化学残留、环境污染等问题，具有绿色、环保的特点，更易被推广应用。但是，目前生防菌应用的最大难点在于：一方面需要筛选更多的具有良好抗病活性的新菌株，另一方面是如何对获得的活性菌株进行剂型加工以保证产品的稳定性并使其充分发挥功效。
在众多的生防菌中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是一类具有良好抑菌、生防效果的微生物。现有文献中有很多关于贝莱斯芽孢杆菌抑制其他细菌生长的报道，但是在实际的工作中，由于分类学地位上通常只将菌株分到种或亚种，而即使是同属同种、甚至是同一小种的不同菌株，其生理上也会存在一些差别，有些差别甚至足以达到生理小种的差异水平。因此，这些不同菌株在其功能上也表现出有很大的差异。为此对抗病性能菌株的筛选、研发和新菌株的应用技术研究是在生物防护领域永恒的课题。在确定活性菌株后，含有活性菌株的菌剂制备是生防菌领域的另一重要关键技术，有别于一般农药制剂的加工，生防菌剂的加工过程需要保证菌体的存活并保证产品在一定的时间内保证足够量的菌体存活和生物活性。
发明内容
本案发明人在上海郊区采集到一株芽孢杆菌(Bacillus)属的菌种，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。经研究发现，该菌株对于油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、柑橘溃疡病等由多种作物病害都具有较好的防治作用，可以制成微生物菌剂用于防治上述这些作物病害。
因此，本发明的第一个目的，在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其保藏号为CGMCC No.24124。
本发明的第二个方面，提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为活性组分。
根据本发明，所述微生物菌剂的剂型包括：水悬浮剂、颗粒剂、粉剂以及微胶囊剂。
进一步的，所述水悬浮剂、颗粒剂和粉剂中活性组分的重量百分比含量为5～20％；所述微胶囊剂中活性组分的重量百分比含量为10～30％。
本发明的第三个方面，提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)用于制备微生物菌剂的应用。
进一步的，所述微生物菌剂的剂型包括：水悬浮剂、颗粒剂、粉剂以及微胶囊剂。
本发明的第四个方面，提供了所述的微生物菌剂用于防治植物病害的应用。
根据本发明，所述植物病害包括油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、和柑橘溃疡病。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)可用于制备微生物菌剂，且对于油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、柑橘溃疡病等由多种作物病害都具有良好的防治效果，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的菌落形态。
图2为本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的出现芽孢的示意图。
图3为本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的系统发育树图。
具体实施方式
保藏事项
本发明所涉及的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297已于2021年12月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.24124。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
本发明所述的具有防治油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、柑橘溃疡病等由多种作物病害的微生物菌株S297是一种属于芽孢杆菌(Bacillus)属的菌种。2020年6月从上海郊区采集的土壤中分离，并经纯化后诱变而得到，经鉴定，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。该菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297已于2021年12月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.24124。
一、所使用的微生物
该菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征及16srDNA的序列和菌种分类结果如下：
1、形态特征：
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297在营养琼脂培养基上经过28℃培养约2天后，菌落呈乳白色，单菌落为圆形，凸起，不透明，圆周周边不整齐，单菌落表面光滑(图1)。成片时表面出现褶皱，培养基上无色素形成，在显微镜下呈杆状，在营养不良等逆境条件下出现芽孢(图2)。
2、生理生化特性
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297的生理生化特性结果如以下表1所示。
表1：菌株S297生理生化指标
指标 结果
革兰氏 +
M-R实验 -
V-P实验 +
氧化酶实验 -
淀粉水解实验 +
3、分子生物学鉴定
对上述菌株进行测序、验证：采用一般细菌的通用引物对菌株的16S rDNA基因序列进行扩增，然后通过与GenBank中的数据库进行比较，构建菌株的系统发育树图，图3显示了基于16S rDNA序列构建的系统进化树。
菌株S297与芽孢杆菌(Bacillus sp.)都具有大于99.7％的相似性，属于Bacillussp.属。综合其形态和生理生化特征，认为其外形更接近Bacillus velezensis种，因此，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
二、微生物培养及菌体的制备方法
本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297，通过常用的细菌生产方法都可以培养，并制得相应的培养物。培养方法优选为深层液体培养。为了有利于工业性的培养，可采用多级培养发酵的方法，将上述菌株的菌悬液接种到培养基上，并进行通气搅拌。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，以适宜培养细菌并经济实用为主。可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。使培养基组成比例中的碳、氮源之比为2:1～5:1为宜。其中，碳源可为淀粉、糊精、葡萄糖等；氮源可为肉胨、黄豆饼粉、花生粉、酵母、肉膏、铵盐、以及其他有机或无机含氮化合物。其他营养源可适当添加一些无机盐类，例如食盐、磷酸盐及钾、钙、锰、铁等金属盐。必要时可添加一些动、植、矿物油等作为消泡剂。
对温度、pH、时间等培养条件并无严格的限制，以适于菌株的生产为准。例如，培养基的pH范围可为6～8，以接近中性为好；培养温度在25～38℃，通气量以通气比1:0.3～1:4之间(通气比：指每分钟通过培养液的空气体积与培养液体积之比)。这些培养基的组份、pH、培养温度、通气条件等均可根据实际情况进行适当的调整，以获得最好的效果。
三、微生物菌剂
本发明的微生物菌剂是以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297为主要活性组份的一种对油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、柑橘溃疡病等多种作物病害具有良好防控效果的微生物菌剂。
在制备以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297为主要活性组份的微生物菌剂时，可同样使用本技术领域中已知生物农药所通用的固相、液相及乳化分散剂等各种载体，并能配制成水悬浮剂、颗粒剂、粉剂、微胶囊剂等剂型。同时，在各种制剂中一般可适当添加一些助剂、表面活性剂、以及载体等，如分散剂、润湿剂、渗透剂、展着剂、粘着剂、消泡剂、发泡剂、增粘剂、稳定和成膜剂等。
具体的，用于制剂中的助剂包括羧甲基纤维素、聚乙二醇或明胶、阿拉伯胶、黄原胶等。用于制剂中的表面活性剂包括醇磺酸酯、烷基芳基磺酸酯、木质素磺酸盐、聚氧乙烯乙二醇醚、聚氧乙烯烷基芳基醚或聚氧乙烯山梨醇单烷基酯。用于制剂中的载体，可以是诸如锯木屑、滑石、膨润土、粘土、高岭土、硅藻土、白碳黑、蛭石、熟石灰、硅砂、工业葡萄糖等的固体载体，诸如水、异丙醇、甘油等的液体载体。
各种制剂中有效成份的配比，可根据不同的使用目的而适当增减。一般来说，水悬浮剂、颗粒剂和粉剂的有效成份范围通常在5～20％，微胶囊剂在10～30％。此处的有效成分含量为湿菌体的质量百分比，因微生物农药的含量还需以产品中活菌量计算，故在配制相应制剂后需另行测定活菌数并标记。
具体来说，可由前述所得的培养物出发，通过添加一些助剂并选用一些适当的方法就能制得菌体制剂。例如，可利用真空薄膜浓缩使培养物成高浓度的液体半成品，用于进一步制备液体型制剂产品，或进一步利用通风干燥、喷雾干燥等方法获得固体半成品，得到的固体半成品经粉碎后即可用于制备目标制剂产品。
四、应用方法和范围
在实际使用中，本发明的微生物菌剂在使用前可以稀释至合适的浓度，或可以直接使用。
本发明的微生物菌剂可以与其他农药和肥料结合使用，但不能与杀细菌的农药混用。
本发明的以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S297为主要活性组份的微生物菌剂可用于油菜、生菜、莴苣、黄瓜等作物菌核病、瓜类白粉病菌、柑橘溃疡病等。具体来说，可将本发明的菌剂采用土壤表面处理的方法，或者在作物苗期发病前进行叶面喷雾处理，可有效防治上述病害。
对于土壤表面处理，在种植地土地平整后，以每亩200克至400克活性成分的剂量在土壤表面喷雾处理，使药剂均匀分布到整块田中。对于叶面喷雾处理，同样以每亩200克至400克活性成分的剂量，兑水后在作物叶面上均匀喷雾，每亩用水量可在30千克至50千克。
实施例1、菌株Bacillus velezensis S297菌悬液的制备
在250mL三角摇瓶内加入含有0.5％葡萄糖、0.5％可溶性淀粉、0.2％氯化钠、0.2％蛋白胨、pH6.7～7.2的液体培养基50mL，瓶口用透气瓶塞盖紧，在121℃消毒25分钟，冷却至室温后，用消毒过的接种针挑取在营养琼脂培养基上预先培养好的S297斜面种子，接种。然后将摇瓶在28～32℃下摇床上150～200rpm振荡培养12～20小时，得到菌悬液种子。
在10L发酵罐内加入含有1％葡萄糖、2％可溶性淀粉、0.5％氯化钠、0.5％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、pH7.0的液体培养基7L，121℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至35℃后，接入前述培养的菌悬液种子，通气搅拌培养32～48小时，得到含有目标菌株的菌悬液。
为了使制备的微生物菌剂产品具有较好的贮存稳定性，满足一般微生物菌剂制剂的要求，菌悬液在发酵罐中停止通气和搅拌的情况下继续培养4～6小时，使悬液中的营养体菌株大部分转化为芽孢体。
实施例2、含有菌株Bacillus velezensis S297的微生物菌剂制备
在实施例1获得的芽孢体菌悬液中添加不同的助剂，并采用合适的方法即可得到不同剂型的微生物菌剂，具体如下：
2.1、水悬浮剂的制备
将实施例1获得的芽孢体菌悬液用稀释涂皿测定菌量后，浓缩或添加适量蒸馏水，按质量比加入0.05％黄原胶、0.05％椰子油、0.1％浸润剂LS，混合均匀。
通过调节浓缩或添加蒸馏水的量，得到含有目标菌株的不同含量的微生物水悬浮剂。
2.2、颗粒剂的制备
取实施例1获得的芽孢体菌悬液若干，按质量百分比加入需要量的轻质碳酸钙、2％的润湿剂SXC、2％的分散剂NNO、15％的锯木屑，经粉碎机粉碎混合后，加入适量水进行挤压造粒，用54℃烘箱干燥1h。
通过调节菌粉与轻质碳酸钙的比例，得到含有目标菌株的不同含量的颗粒剂。
2.3、粉剂的制备
取实施例1获得的芽孢体菌悬液若干，按质量百分比加入需要量的轻质碳酸钙、1％的润湿剂SXC、1％的分散剂NNO、1％的工业葡萄糖，混合均匀后喷雾干燥。
通过调节菌液量与轻质碳酸钙的比例，得到含有目标菌株的不同含量的粉剂。
2.4、微胶囊剂的制备
取实施例1获得的芽孢体菌液若干，离心除去大部分水分，得到糊状菌浆。根据需要配制的剂量取适量菌浆，加入0.1％左右的吐温-80，在搅拌下加入由明胶和阿拉伯胶构成的微胶囊壁材水溶液(明胶：阿拉伯胶为1：1至1：2)，菌浆与壁材的比例可在1：2至1：5的范围内根据设计制剂浓度做适当调整。壁材加入顺序为先加明胶溶液，然后调节体系pH3.5-4.5，保持体系温度在40℃至60℃，继续搅拌加入阿拉伯胶水溶液，搅拌20-30分钟后加入甲醛固化，再继续反应10-15分钟，水洗除去甲醛即可得到所需的微胶囊剂。
实施例3、含有目标菌株的微生物菌剂在防治植物病原菌上的应用
3.1、叶面喷雾处理防治莴苣菌核病
在前一茬同样也为莴苣而且菌核病发生较为严重且均匀的同一大棚内，设置菌剂处理(4种不同剂型)和清水对照组5个处理，每个处理4次重复，每个小区面积60平方米，随机区组排列。
在莴苣定植后约1月左右，于菌核病发病前叶面喷雾处理，取实施例2制备的各剂型的菌剂产品稀释至1333亿cfu/L的水溶液(如100亿cfu/ml的制剂，取400g，兑水30kg)，每亩用药液量30千克，间隔1周后再用药一次，连续用药3次。于最后一次用药后14天调查各小区菌核病的发病情况。每小区5点调查，每点调查10株。记录发病株数和相应的发病级别，计算病情指数和防效，结果如表2所示。
病症分级标准：0级，植株生长正常；1级，植株下部1-2叶片变软发褐，中上部叶片正常；2级下部5-10片叶片变软发褐，同时病害蔓延至茎秆，植株无萎蔫；3级，植株上部叶片已萎蔫，下部叶片发褐枯死，茎秆大部分发病；4级，植株枯死或倒伏。
从用药后莴苣的感病情况分析，运用贝莱氏芽孢杆菌菌剂后发病症状显著减轻，即使有病症也大都只出现在下部的几片老叶上，茎秆上的症状几乎很少发现。
对试验结果的分析结果表明，采用贝莱氏芽孢杆菌菌剂可有效防控莴苣菌核病的危害。用药后14天，菌剂处理的平均防效为88.97％。
表2：菌剂叶面喷雾处理防治莴苣菌核病田间药效
处理 平均病指％ 平均防效％
清水对照 52.12 /
水悬浮剂 7.00 86.57
颗粒剂 5.50 89.45
粉剂 5.00 90.41
微胶囊剂 5.50 89.45
3.2、土壤处理加叶面喷雾处理防治生菜菌核病
实验设计和步骤与上述实验3.1基本相同。在地块平整后，取实施例2制备的各剂型的菌剂产品稀释至2666亿cfu/L的水溶液(如200亿cfu/ml的制剂，取600g，兑水45kg),先用喷雾的方法在地表的土壤上喷雾处理，药液量每亩45千克。空白对照组则喷同样量的清水。2天后将生菜定植。
待定植后约1周左右、生菜苗完全成活后，再采用叶面喷雾处理的方法，取任意剂型的菌剂产品稀释至1333亿cfu/L的水溶液(如200亿cfu/ml的制剂，取200g，兑水30kg)在生菜叶面喷雾处理，药液量每亩30千克。空白对照组则喷同样量的清水。间隔7-10天后再喷雾一次。2周后根据发病情况计算病情指数和防效，结果如表3所示。
病症分级标准：0级，植株生长正常；1级，植株下部1-2叶片变软发褐，中上部叶片正常；2级下部3-4片叶片变软发褐，同时病害蔓延至茎秆，植株无萎蔫；3级，植株中心叶片已萎蔫，下部叶片发褐枯死，茎秆发病严重；4级，植株枯死或倒伏。
表3：菌剂土壤处理加叶面喷雾处理防治生菜菌核病田间药效
处理 平均病指％ 平均防效％
清水对照 41.26 /
水悬浮剂 8.50 79.58
颗粒剂 7.50 81.98
粉剂 5.50 86.79
微胶囊剂 9.00 78.38
对试验结果的分析结果表明，采用贝莱氏芽孢杆菌菌剂可有效防控生菜菌核病的危害。用药后2周，先以土壤处理再以叶面喷雾处理的平均防效为81.68％。
3.3、室内土壤处理对柑橘溃疡病的抑制效果
将田间采集的土壤过60目筛，平铺于三角烧瓶底部，厚度约2厘米左右，瓶口用透气瓶塞盖住后，于灭菌锅内121℃消毒30分钟；冷却放置1天后再次消毒30分钟以保证土壤中的菌全部被杀死。经2次消毒的土壤冷却后加入事先培养并计数过的柑橘溃疡病菌悬浊液5mL(约107个/mL)。将接有病原菌的土壤摇瓶在35℃摇床上振荡培养24小时后，加入取实施例2制备的各剂型稀释的水溶液5ml，使之含100亿cfu/ml进行处理，同时设置加5mL清水的处理作为对照。将处理后的摇瓶继续在摇床上振荡培养2天后，采用稀释涂皿法测定土壤中病原菌的数量。
结果表明，经微生物菌剂处理的土壤，病原菌数量从160万个/克土壤降低到了10万个/克土壤。
3.4、田间叶面喷雾处理对柑橘溃疡病的防治效果
实验选取上一年度发病较重的3年树龄沃柑为对象，设置微生物菌剂处理和清水对照两种，每个处理3个重复，共6个小区，各小区随机排列。每小区3棵树，各处理及小区间均以未喷药植株相隔。采用叶面喷雾处理的方法，选用取实施例2制备的各剂型的菌剂，稀释至1250亿/L水溶液进行喷雾处理。每株喷液量以润湿均匀为度(按常规用水量)。
秋梢抽发1～2厘米时第一次喷药，以后每隔10天喷药一次，共喷3次。喷药前摘除零星抽发的早秋梢。末次喷药后2周，每棵树按东西南北中5个方向共取20枝秋梢叶片进行药效调查。
叶片发病分级标准为：0级，无病斑；1级：1-3个病斑；2级，4-6个病斑；3级，7-9个病斑；4级，10个以上病斑。计算病情指数及防治效果，结果如表4所示。
结果表明，在对照组溃疡病发生极其严重的情况下，菌剂处理的平均防效依然可以达到72.34％。
表4：菌剂叶面喷雾处理防治柑橘溃疡病田间药效
处理 病指％ 防效％
清水对照 100.00
水悬浮剂 30.00 70.00
颗粒剂 28.75 71.25
粉剂 24.58 75.42
微胶囊剂 27.32 72.68
3.5、田间叶面喷雾处理对瓜类白粉病的防治效果
在田间种植黄瓜地中，按垅畦设小区，田间小区试验设置菌剂处理(4种不同剂型)和清水对照共5个处理。每个处理4次重复，每小区25平方米，各小区随机排列。为保证田间白粉病发病均匀一致，在田间黄瓜苗长至6张真叶时，先在黄瓜苗上进行人工喷雾接种白粉病菌分生孢子悬浮液。接种病原菌后第二天，选用取实施例2制备的各剂型的菌剂，稀释至1250亿/L水溶液喷洒于黄瓜植株上。一周后再喷一次，10天后调查。调查时每区查10株，每株调查上部的4张叶片，计数每张叶片病斑个数，然后与空白对照比，计算防治效果，结果如表5所示。
表5：菌剂叶面处理对黄瓜白粉病的防效
处理 小区平均病斑数/个 平均防效/％
水悬浮剂 89 96.83
颗粒剂 28 99.00
粉剂 15 99.47
微胶囊剂 10 99.64
空白对照 2806 /
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的保藏号为CGMCC No.24124。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)为活性组分。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的剂型包括：水悬浮剂、颗粒剂、粉剂、以及微胶囊剂。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述水悬浮剂和颗粒剂中活性组分的重量百分比含量为5～20％。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微胶囊剂中活性组分的重量百分比含量为10～30％。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的应用，其特征在于，用于制备微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的剂型包括：水悬浮剂、颗粒剂、粉剂、以及微胶囊剂。
8.权利要求2～5中任一项所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，用于防治植物病害。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括：油菜菌核病、生菜菌核病、瓜类白粉病、和柑橘溃疡病。
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