CN109097304A - 一种菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菌株及其应用，涉及微生物技术领域。本发明的菌株命名为H31‑5‑9‑1，所述菌株为具有纤维素降解能力的德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.15246，保藏日期为2018年1月22日。所述德干链霉菌菌株的有效浓度为3×1010cfu/mL。本发明还公开了德干链霉菌菌株在制备降解纤维素菌剂中的应用。所述纤维素为牛羊粪便中纤维素。本发明还公开了一种微生物菌剂，其包含上述德干链霉菌菌株。本发明德干链霉菌菌株对降解牛羊粪便纤维素具有非常显著的效果。

Description

一种菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种菌株及其应用。
背景技术
随着中国经济的快速发展和养殖业产业结构的调整，养殖业呈现规模化、集约化和现代化，在产生巨大的经济和社会效益的同时，也带来了畜禽粪便废弃物集中大量产生、难以快速处理的问题。随着各国对环境污染的日益关注以及人们环保意识的提高，传统的掩埋、焚烧和直接施农田等办法已逐渐被淘汰。而是根据其养分物质进行有效利用。目前国内外以饲料化、能源化和肥料化等方式对畜禽粪便进行有效处理。其中肥料化处理(堆肥)是解决畜禽粪便较为经济有效的处理方法之一，就是人为添加外源微生物使有机物转化为腐殖质的过程，该过程既可以杀死粪便中的各种病菌及杂草种子，还会生成大量腐殖质，提高土壤肥力，促进植物生长因其具有成本低、处理量大、污染小的优势，近年来己成为资源环保领域的一种重要手段。
在过去的研究中，国内外学者陆续发现了一些堆肥微生物，如真菌中白腐菌、毛霉属等，放线菌类中的链霉菌属、小单胞菌属等，细菌中的芽孢杆菌属、假单胞菌属等。在堆肥微生物的实际应用中，常常采用微生物混合菌群的方式，以堆肥或沤肥的形式来进行畜禽堆肥试验。因此，研究筛选堆肥微生物，寻找合适的堆肥微生物菌剂及其组合，为畜禽堆肥接种菌剂的开发和堆肥效率的提高提供理论依据和实践指导
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种菌株及其应用，该菌能产生大量的酶，纤维素酶活性高，具有高效降解纤维素的特性，可将其作为微生物菌剂用于堆肥体系中，主要适用于牛羊粪便堆肥腐熟。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种菌株，命名为H31-5-9-1，所述菌株为具有纤维素降解能力的德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.15246，保藏日期为2018年1月22日。
作为优选，所述菌株的16SrDNA部分序列号为SEQ ID NO.1。
作为优选，所述菌株的有效浓度为3×1010cfu/mL。
另一方面，本发明提供了上述菌株在制备降解纤维素菌剂中的应用。
作为优选，所述纤维素为牛羊粪便中的纤维素。
又一方面，本发明提供了一种微生物菌剂，其包括上述菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明为了提高牛羊粪便纤维素降解速度和提高肥料腐熟效率，发现了一种对纤维素类物质具有较高降解效率的菌株，并经过培养、纯化后筛选出具有较强降解效果的菌株，通过鉴定该菌株为德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)；通过该菌株研制的菌剂可高效降解腐熟农肥，可提高肥料腐熟效率，用于农牧业发展且可实现增产增收。
生物保藏说明：
本发明提供的菌株-德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)已于2018年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.15246。
附图说明
图1A是本发明实施1提供了H31-5-9-1菌株斜面菌落扫描电镜图；
图1B是本发明实施1提供了H31-5-9-1菌株菌丝扫描电镜图；
图2A是本发明实施1提供了H31-5-9-1菌株在刚果红培养基上的水解效果；
图2B是本发明实施1提供了H31-5-9-1菌株滤纸条崩解效果；
图3是本发明实施1提供了H31-5-9-1菌株的16SrRNA序列系统发育树；
图4是本发明实施1提供了H31-5-9-1菌株的生长曲线图；
图5是本发明实施1提供了利用H31-5-9-1菌株堆肥时间与温度关系图；
图6是本发明实施1提供了利用H31-5-9-1菌株堆肥时间与碳氮比关系图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1(纤维素降解菌株筛选)
从青海省海北州橡皮山高寒草甸中采集样品，称取上述新鲜样品10g放于装有10粒玻璃珠、并盛有90mL无菌水的三角瓶中，置于20℃、170rpm的摇床中摇30min，使样品充分散开，20℃下静置富集培养24h。用无菌吸管吸取1mL上清液加入到含有9mL无菌水的试管中，此即为10-1样品稀释液，再从10-1样品中取1mL加入到9mL无菌水中，此即为10-2样品稀释液，依次类推，得到10-3、10-4、10-5、10-6样品稀释液，然后用移液器吸取100μL的10-4、10-5、10-6样品稀释液均匀涂布于改良羧甲基纤维素钠(CMC)固体培养基平板上(培养基组成为NaNO3 1.0g蛋白胨1.5g，K2HS04 1.0g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，
FeSO4 0.01g，CMC-Na 10.0g，琼脂25.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2)，并置于25℃培养箱中培养3d，用刚果红染色培养基，观察培养基接菌处是否产生透明的水解圈，并测定菌落直径d和水解圈直径D，计算其比值H，即H＝D/d，H值越大，表示该菌株分解纤维素的能力越强。按照纤维素刚果红鉴定培养基上形成透明圈的大小初步确定其产生纤维素酶活性。将纤维素酶活性高的菌株接到高氏1号培养基斜面上，4℃保存进行后续实验。
将筛选到的具有高羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的菌株制成种子悬浮液，分别接种10mL于装有90mL滤纸液体培养基(滤纸条前处理：1％醋酸溶液浸泡24h后用2％碳酸氢钠溶液冲洗至中性，用碘液检验滤纸条不变蓝，烘干后加入250mL锥形瓶中，每瓶1×3cm滤纸5条)，20℃，170r/min恒温震荡培养，每24h观察滤纸条被降解的情况。
通过上述操作，获得一株高纤维素酶活性的菌株1株，命名为H31-5-9-1，该菌株降解纤维素能力如下表1、2所示。
表1.H31-5-9-1菌株降解纤维素能力评价
表2 H31-5-9-1菌株滤纸崩解效果
注：+++：滤纸断裂，振摇变成均匀糊状；++：滤纸断裂，振摇变成片状；+：滤纸断裂，振摇不成糊状和片状；-滤纸不断裂。
实施例2(H31-5-9-1菌株鉴定)
(1)形态学鉴定
通过观察筛选得到的H31-5-9-1菌株在斜面上的菌落形态进行判断，采用光学显微镜对菌丝和孢子进行显微形态观察。
(2)分子生物学鉴定
①菌株DNA提取：将保存菌种接种到高氏1号培养基上，置于30℃、120r/min摇床震荡培养，在3d取出培养液，8000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体，按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，提取菌液DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱内保存。
②PCR扩增：通用引物27F和1492R对提取的细菌DNA进行PCR扩增；27F序列为5′-AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′；1492R序列为5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。
PCR反应体系为：Template(基因组DNA20-50ng/μL)0.5μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5μL，dNTP(各2.5mM)1μL，酶0.2μL，27F(10uM)0.5μL，1492R(10uM)0.5μL，加双蒸水至25。
PCR扩增程序为：预变性94℃4min，开始循环94℃45s，55℃45s，72℃1min，30个循环，72℃修复延伸10min，4℃终止反应。
③凝胶电泳：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(电泳缓冲液1×TAE，电压150V/cm，时间约30min)。同时送(生工)上海生物工程有限公司测序。
④对16S rDNA同源性比较与系统发育学分析将所测得序列在Genbank上进行Blast比对，根据测序结果，利用NCBI提供的Blastn工具在Megalign数据库中找到同源性序列，并利用MEGA4软件建立系统发育树。
结果表明，H31-5-9-1菌株在高氏1号培养基斜面上菌落呈圆形，表面干燥，菌落周围呈放射状，显微镜形态观察表明，气生菌丝白色至灰色，具有丝状菌丝及球状的孢子链，气生菌丝由非运动孢子组成，表面有毛，呈现明显的放线菌特征。经16S rDNA序列测定，序列结果在GenBank中用Blast进行检索和同源性比较，用相关软件进行序列比对和构建系统进化树(参见附图3)结果表明：该序列与德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)的16SrDNA基因序列相似度高达99％，同时结合菌落形态特征、生理生化特征、菌体显微特征确定H31-5-9-1菌株为德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)。
实施例3(德干链霉菌生长测定)
将德干链霉菌H31-5-9-1接种到CMC液体培养基中(培养基组成为NaNO3 1.0g蛋白胨1.5g，K2HS04 1.0g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，FeSO4 0.01g，CMC-Na 10.0g，琼脂25.0g，蒸馏水1000mL pH 7.0-7.2)，每隔12h去培养液。连续取样120h，测定各时期OD600值，以培养时间为横坐标，各取样点的OD600值为纵坐标，绘制该菌的生长曲线图。从测定结果可以看出0-24h为延迟期、24-48h为对数生长期，48-84h为稳定期、＞84h为衰亡期。对数期的菌株生长迅速、产酶活力强，因此，发酵产酶试验中，应选用36h的发酵液为种子液进行接种。
实施例4(德干链霉菌产纤维素酶活力测定)
将对数生长期德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)H31-5-9-1按3％的接种量接种到发酵培养基(培养基组成为NaNO3 1.0g蛋白胨1.5g，K2HS04 1.0g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O0.01g，FeSO4 0.01g，CMC-Na 10.0g，琼脂25.0g，蒸馏水1000mL pH 7.0-7.2)中，于温度20℃、170r/min摇床中培养2-3d，将发酵液8000r/min，离心5min取上清即为粗酶液，用DNS法测定纤维素酶活。在试管中加入1.8mL 1％CMC溶液，试管提前预热。取0.2mL粗酶液加入CMC溶液中，置于50℃水浴中酶解反应30min，加入2mL DNS显色液，在沸水浴中进行10min显色反应，冷却后用蒸馏水定容至15mL，用紫外可见分光光度计于540nm比色。根据葡萄糖标准曲线测算纤维素酶的活性。对照组为1.8mL 1％CMC溶液中加入0.2mL蒸馏水。每个样品做三个平行。酶活力单位采用国际单位规定定义，即在上述实验条件下，在1mL体系中，在1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U/mL)。经测定H31-5-9-1菌株的纤维素酶活性为59.57U/mL。
实施例5(堆肥菌剂实验)
将菌株接种于高氏1号液体培养基中，48h后取样测定菌液的浓度约为3.0×1010cfu/mL后，停止发酵，3L发酵液与油渣4kg、水8L添加到200kg牛粪中拌匀，人工堆置，定时测量堆内温度，按时翻堆的方法进行试验。每堆在置堆后每天两次测定堆温，在堆温升至60℃进行第一次翻堆，以后每隔2天翻堆一次，直到堆温由高到低降至30℃以下不再变化时认为发酵完成，为一完全周期。试验设2个处理(堆)，分别为处理1：菌剂；处理2:纯牛粪(空白对照)。其结果见下图，由图5可知，接种菌剂的堆肥处理在堆肥第3d温度上升到50℃左右，而且50℃以上的高温持续期12d，之后温度开始下降。而未接菌剂的堆肥温度在堆肥第5d才上升到50℃以上，比接种的处理推迟2d达到50℃以上高温期，而且高温期持续时间是9d比接种的处理少了3d，说明接种菌剂能够加快堆肥进入高温时间，以及高温持续时间。堆肥过程中碳氮比的变化，如图6所示，随着堆肥的进行，接种菌剂和对照的处理碳氮比菌持续降低，而接种的处理下降长度高于未结账处理，由此说明，接种菌剂可加快堆肥进程，提高牛羊粪便的腐熟效果。从表3中数据可看出，经过发酵处理后，堆肥中各种养分的含量均有所下降，这和有机质测定结果一致。其中对照下降最为明显，而菌剂处理养分含量最高，说明菌剂的接入能有效抑制养分的损失。从表4中数据可看出，对照活菌数最高，但在测定检测时发现，其主要构成以杂菌为主，说明在无外接菌种参与发酵时，杂菌大量繁殖分解物料，降低肥料质量。菌剂堆肥处理活菌数达到1.58×1010cfu/mL，这一活菌数量能明显增加堆肥质量。
表3.不同处理堆肥养分含量测定结果(％)
表4.不同堆肥处理微生物种群数量测定结果(×1010cfu/g)
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 青海省农林科学院
<120> 一种菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttaccatgc agtcgaacga tgaaccactt cggtggggat tagtggcgaa cgggtgagta 60
acacgtgggc aatctgccct tcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg 120
atacgacact ctcgggcatc cgatgagtgt ggaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg 180
cggcctatca gcttgttggt gaggtaatgg ctcaccaagg cgacgacggg tagccggcct 240
gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 300
gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg 360
gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga aagtgacggt acctgcagaa 420
gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgcg agcgttgtcc 480
ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtctgtcgc gtcggatgtg aaagcccggg 540
gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg cagactagag tgtggtaggg gagatcggaa 600
ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat 660
ctctgggcca ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720
ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggaac taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt 780
gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa 840
aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga 900
agaaccttac caaggcttga catacaccgg aaacggccag agatggtcgc ccccttgtgg 960
tcggtgtaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1020
ccgcaacgag cgcaaccctt gttctgtgtt gccagcatgc ccttcggggt gatggggact 1080
cacaggagac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc 1140
ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggcaggta caatgagctg cgaagccgtg 1200
aggcggagcg aatctcaaaa agcctgtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc 1260
atgaagtcgg agttgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg 1320
ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa 1380
ccccttgtgg gagggagct 1399

Claims (6)

1.一种菌株，其特征在于，命名为H31-5-9-1，所述菌株为具有纤维素降解能力的德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.15246，保藏日期为2018年1月22日。
2.如权利要求1所述的一种菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA部分序列号为SEQID NO.1。
3.如权利要求1或2所述的一种菌株，其特征在于，所述菌株的有效浓度为3×1010cfu/mL。
4.权利要求1或2所述的一种菌株在制备降解纤维素菌剂中的应用。
5.如权利要求4所述的一种菌株在制备降解纤维素菌剂中的应用，其特征在于，所述纤维素为牛羊粪便中纤维素。
6.一种微生物菌剂，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的菌株。
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