CN115873758A - 一种高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌及其筛选方法、应用 - Google Patents
一种高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌及其筛选方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，涉及一种高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌及其筛选方法、应用。所述海洋放线菌为海洋鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）HN43，于2022年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC NO.25519。本发明公布了一株新型海洋放线菌——海洋鼠灰链霉菌Streptomyces murinus HN43，在制备生防制剂方面具有良好的应用前景；本发明提供的菌株可作为研发高效拮抗禾谷镰刀菌微生物制剂的生物材料，菌株HN43的发酵液能够直接用于杀菌物质抑制农作物病原菌，操作过程简单，稳定性较好。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌及其筛选方法、应用。
技术背景
小麦赤霉病又称烂穗病、麦秸枯、烂麦头、红麦头、红头瘴，是以禾谷镰刀菌为主的多种镰刀菌侵染引起的小麦病害，在赤霉病流行年份可使小麦减产20%~50%，时至今日小麦赤霉病依然是夏粮减产的主要原因。小麦受害后千综合粒重降低，发芽率下降，发芽势减弱，出粉率低，面粉质量差，色泽灰暗，商品价值降低，最重要的是发病的小麦含有毒素，人畜食用会发生急性中毒，产生呕吐、腹痛、头昏等症状。
我国主要通过农业基础防治、种植抗病或耐病的品种以及喷洒化学药剂等方法防治小麦赤霉病，但是农业基础防治只能是减轻病害,不能有效地防治病虫害；抗性育种虽然环保、经济，但是由于涉及转基因技术，其安全性往往受到大众的质疑；普通的化学药物防治由于其见效快、效果好等特点而被广泛使用多年，但是化学农药的长期使用容易污染环境，杀伤害虫的天敌，而且容易产生农药残留，或导致害虫和病菌出现抗药性。生物防治是对于农作物病害治理的重要内容之一， 凭借污染小，可减少农药的用量，对人畜较安全，害虫和病菌不会轻易产生抗性等优点成为当前研究热点，90年代以来，“生态农业”、“有机农业”和环境保护等观念得到重视，我国生物防治发展迅速。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌。
本发明还提供了一种上述海洋防线菌的筛选方法。
本发明的另一目的为提供了一种上述海洋放线菌在制备拮抗禾谷镰刀菌的药物中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌，所述海洋放线菌为鼠灰链霉菌（Streptomycesmurinus）HN43，于2022年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号: CGMCC NO. 25519。
本发明还提供了一种上述海洋放线菌的筛选方法，包括以下步骤：
（1）将土壤样品置于室温下14 d进行风干，将土壤样品用无菌生理盐水进行系列稀释，浓度分别为10-1~10-3，不同浓度稀释液分别取100 μL涂布于高氏一号培养基中；
（2）采用高氏一号培养基对筛选出的放线菌进行分离纯化，所述高氏一号培养基中加入重铬酸钾及萘啶酮酸，终浓度分别为75 μg/mL及25 μg/mL，28℃培养14 d，纯化出的放线菌-80℃保存。
本发明还提供了一种上述海洋放线菌的发酵液在制备抗真菌活性物质中的应用。
进一步的，所述发酵液用于抑制禾谷镰刀菌的生物活性。
上述发酵液的制备方法包括以下步骤：
（1）海洋放线菌HN43接种于YMG液体培养基，28 ℃、180 r/min摇床培养2 d，得到种子液；
（2）将种子液按照1.5 %的接种量接种于YMG液体培养基中，28 ℃、180 r/min摇床培养4 d，发酵结束后离心去除菌体，收集上清液，获得海洋鼠灰链霉菌HN43发酵液。
进一步的，步骤（1）中，所述YMG液体培养基配方为麦芽浸粉10 g，酵母浸粉4 g，葡萄糖4 g，天然海水1 L，pH 7.2~7.4。
本发明结合形态学特征对菌株HN43进行了分类学鉴定。将菌株HN43接种于培养基上，呈现的形态学特征为：菌落呈圆形、白色、表面干燥、凸起状，菌丝呈1~3圈紧密螺旋形、有分叉、无断裂。
本发明通过测定16S rRNA对菌株HN43进行分子生物学鉴定。将菌株HN43的16SrRNA序列与已发表的相似序列联合分析（菌株序列如SEQ ID NO.1所示），构建系统发育树可知菌株HN43属于鼠灰链霉菌。
海洋放线菌由于特殊的并且不同于陆地的生存环境，使其可产生大量丰富的新颖的次级代谢物，如多烯类化合物、生物碱类化合物、萜类化合物、大环内酯类化合物、聚酮类化合物、肽类化合物等，并且具有如抗肿瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，表面活性剂等各种生物活性。越来越多的研究证明，海洋放线能够产生与陆地微生物不同的代谢途径和机体防御机制，因此这对于新型天然抗生素的发现、抗生素作用机理、靶点的研究都具有重要意义。
本发明的有益效果为：
（1）本发明公布了一株新型海洋放线菌——海洋鼠灰链霉菌StreptomycesmurinusHN43，在制备生防制剂方面具有良好的应用前景；
（2）本发明提供的菌株可作为研发高效拮抗禾谷镰刀菌微生物制剂的生物材料，菌株HN43的发酵液能够直接用于杀菌物质抑制农作物病原菌，操作过程简单，稳定性较好。
保藏信息
保藏时间：2022年8月10日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No. 25519，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
分类命名：鼠灰链霉菌Streptomycesmurinus。
附图说明
图1为菌丝或菌落的形态图，其中：（a）为菌株HN43的菌落形态图；（b）为菌株HN43的显微镜菌丝形态图；（c）为菌株HN43的扫面电镜菌丝形态图。
图2为菌株HN43系统发育树。
图3为菌株稳定性验证图；其中：（a）为菌株HN43的温度稳定性结果；（b）为菌株HN43的pH稳定性结果；（c）为菌株HN43的时间稳定性结果。
具体实施方法
为了使本发明的目的、技术手段及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。但是本发明的内容不仅限于实施例所述的范围。
实施例1：菌株HN43的筛选
海洋放线菌HN43是从海口红树林土壤中分离得到一种放线菌。将土壤样品置于室温下14 d进行风干，称取1 g土样，溶于9 mL无菌水中，28℃摇床震荡30 min。取上层土壤悬液进行梯度稀释，分别稀释为10-1~10-3，每一梯度取100 μL涂布于高氏一号培养基（高氏一号培养基中加入重铬酸钾及萘啶酮酸，终浓度分别为75 μg/mL及25 μg/mL，用于抑制细菌和真菌的生长），挑取单菌落接种到高氏一号培养基做进一步的纯化。连续进行3次划线以纯化出单一菌落，得到菌株HN43，并放于-80℃冰箱进行保存。
海洋放线菌筛选培养基配方：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，FeSO4·7H2O0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5 g，琼脂20 g，海水1 L，pH 7.2~7.4。
实施例2：菌株HN43形态学观察、生理生化实验和分子生物学鉴定
（1）菌株HN43菌株形态学观察
对海洋放线菌HN43菌落进行直接观察，采用插片法进行显微镜和扫描电镜观察，实验结果如图1，该菌菌落呈圆形、白色、表面干燥、凸起状，显微镜下观察菌丝呈1~3圈紧密螺旋形，扫描电镜下观察该菌株菌丝丰富，有分支，无断裂。初步判断菌株HN43属于链霉菌。
（2）菌株HN43生理生化实验
参照《链霉菌鉴定手册》，对菌株HN43进行生理生化实验，具体结果如表1所示。
表1 菌株HN43生理生化实验
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表1为菌株 HN43 生理生化实验结果，由表可知，菌株HN43可以利用甘露醇、葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、麦芽糖，不可利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇。可使明胶液化、牛奶固化，不产生H2S、类黑素，不产生酪氨酸酶、淀粉酶，不可使硝酸盐还原，可利用纤维素。
（3）采用16S rDNA基因测序法对放线菌菌株HN43进行分子生物学鉴定。
16S rDNA序列测定委托济南力戈公司进行。具体测序方法如下：采用液氮研磨法从菌体中提取基因组DNA，采用通用引物进行16S rDNA扩增，PCR产物经检测后测序。
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
经检测，该菌株HN43的16S rDNA序列（序列见附录）在NCBI上进行BLAST在线比对，并采用MEGA 7 .0软件，构建系统发育树（图2）。
由系统发育树可以看出：菌株HN43与Streptomycesmurinus的系统发育关系最为密切，序列相似性为100%。
实施例3：菌株HN43发酵液对禾谷镰刀菌的抑制活性
（1）将冻存的菌株HN43于室温融化，三区划线法将活化的HN43接种于YMG固体培养基，28℃培养4 d后，挑取单菌落接种于YMG液体培养基，于28℃、180 rpm摇床培养2 d，制备种子液，将种子液按照1.5%的接种量接种到YMG液体培养基中28℃、180 rpm摇床培养4 d，得到菌株HN43发酵液，培养基组成：酵母浸粉4.0 g，葡萄糖4.0 g，麦芽浸粉10.0 g，海水1L，调PH为7.2~7.4。
（2）挑取禾谷镰刀菌菌丝点种法接种于PDA固体培养基中，28℃培养7 d，挑取菌丝接种于PDA液体培养基中，于摇床中28℃、180 rpm培养7 d，培养基配置：马铃薯200 g去皮，切碎，沸水煮40 min，8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20 g，KH2PO33 g，MgSO41.5 g，ddH2O定容至1 L，自然pH。
（3）将培养的禾谷镰刀菌分别吸取200μL上清液涂布接种于PDA固体培养基中，将菌种HN43发酵液8000 rpm、10 min条件离心，去除放线菌的影响，只保留其次级代谢产物，采用牛津杯法测试发酵液对禾谷镰刀菌的抑制活性，方法：将牛津杯放于已涂布有禾谷镰刀菌的PDA固体培养基上，每个牛津杯中加入200 μL的HN43发酵液，于28℃培养5 d，十字交叉法计算抑菌圈直径，经计算抑菌圈直径为22.8±0.33 mm，表明菌株HN43对禾谷镰刀菌具有较明显的抑制作用。
实施例4 菌株HN43抑菌物质的稳定性研究
（1）温度稳定性
发酵液上清液分别放置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中1 h，对照组置于室温下1 h，处理结束后冷却至室温，测定发酵液的抑菌活性，设置3个平行组。通过与对照组比较，确定处理后发酵液抗菌活性是否发生变化。实验结果见图3（a），处理温度高于60℃时，处理组与对照组相比出现显著性差异，尤其是发酵液于100℃处理1h后，抗菌活性保持率降低为72.67%。实验结果表明菌株HN43温度稳定性较好，仅在高温时使其所产抑菌物质活性降低。
（2）pH稳定性
将发酵液上清液发别调pH至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12放置于室温1 h，对照组不进行pH调节，处理结束后调pH至原发酵液pH，测定发酵液的抑菌活性，设置3个平行组。通过与对照组比较，确定处理后发酵液抗菌活性是否发生变化。实验结果见图3（b），在pH值低于3时，处理后的发酵液抗菌活性与对照组相比出现显著性区别；在pH值高于8时，处理后的发酵液抗菌活性与对照组出现显著区别。实验结果表明，菌株HN43所产抑菌物质在酸性条件下稳定性较好，碱性条件下稳定性较差。
（3）时间稳定性
发酵液上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌，置于室温下1-10天，测定发酵液的抑菌活性，设置3个平行组。通过与对照组比较，确定处理后发酵液抗菌活性是否发生变化。实验结果见图3（c），随着时间的增加，实验组与对照组相比发酵液的抗菌活性没有显著性差异，抗菌活性保持率均在90%以上。结果表明，菌株HN43所产抗菌物质具有良好的时间稳定性。
Claims (6)
1.一种高效拮抗禾谷镰刀菌的海洋放线菌，其特征在于，所述海洋放线菌为鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）HN43，于2022年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号: CGMCC NO. 25519。
2.一种如权利要求1所述的海洋放线菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将土壤样品置于室温下14 d进行风干，将土壤样品用无菌生理盐水进行系列稀释，浓度分别为10-1~10-3，不同浓度稀释液分别取100 μL涂布于高氏一号培养基中；
（2）采用高氏一号培养基对筛选出的放线菌进行分离纯化，所述高氏一号培养基中加入重铬酸钾及萘啶酮酸，终浓度分别为75 μg/mL及25 μg/mL，28℃培养14 d，纯化出的放线菌-80℃保存。
3.一种如权利要求1所述的海洋放线菌的发酵液在制备抗真菌活性物质中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液用于抑制禾谷镰刀菌的生物活性。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括以下步骤：
（1）海洋放线菌HN43接种于YMG液体培养基，28 ℃、180 r/min摇床培养2 d，得到种子液；
（2）将种子液按照1.5 %的接种量接种于YMG液体培养基中，28 ℃、180 r/min摇床培养4 d，发酵结束后离心去除菌体，收集上清液，获得海洋鼠灰链霉菌HN43发酵液。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述YMG液体培养基配方为麦芽浸粉10 g，酵母浸粉4 g，葡萄糖4 g，天然海水1 L，pH 7.2~7.4。
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