CN117802001A - 深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用 - Google Patents

深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用，涉及微生物技术领域。为深褐色孢囊杆菌HM‑E，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年8月25日，保藏号为CGMCC No.28249，分类命名为深褐色孢囊杆菌Cystobacter fuscus。本发明采用上述的深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用，对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和棉花红腐病菌均具有广谱高效的捕食活性，同时具有多重抗菌机制，能够稳定定植在根系表面，从而起到稳定的生防作用，在棉花土传病害生物防治方面具有巨大的应用潜力。

Description

深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用。
背景技术
棉花是我国第一大经济作物，是纺织工业重要原料。在我国，棉花不仅是不可或缺的经济作物，还是重要的战略物资。然而长期以来棉花黄萎病、枯萎病、立枯病等土传病害严重影响了棉花的产量和纤维品质，成为我国棉花优质高产的主要障碍。
棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的土传维管束病害，严重影响着我国棉花的产量和纤维品质，是制约棉花优质高产的关键因素之一。大丽轮枝菌的菌丝体通过在维管束组织中定植，破坏植物的水分传输，导致植株矮小、生长发育不良，叶片萎蔫、失绿发黄直至枯死，维管束衰老和变褐等一系列症状。该病原菌具有较强的环境耐受性，可以在无寄主条件下存活数十年。近年来，由于棉花品种跨区转移、病区棉秸秆还田、长期连作以及农业管理等方式的影响，我国棉区棉花黄萎病发生日趋严重。
棉花枯萎病是对棉花最具破坏的土传维管束病害之一，其致病菌株为尖孢镰刀菌萎蔫转化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)。该病原菌主要对棉花维管束等部位进行侵染，导致植株体内运输水分和营养的导管受到阻塞，从而降低了棉花植株的新陈代谢。同时该病原菌能够分泌具有专化性的毒素镰刀菌酸，该毒素具有耐高温，耐贮藏，耐稀释和快速制萎的能力，可严重破坏植株碳、氮的循环，降低叶绿素的合成，从而影响植株的光合效率。该病原菌于1934在美国引入棉种时传入中国，目前已传播至我国各产棉区，成为棉花主要病害之一，已严重影响我国部分棉区棉花的产量。
棉花立枯病又称为黑根病、烂根病，是严重危害棉花产量和质量的世界性病害之一，也是历史性的棉花病害，致病菌株为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，其菌丝生长迅速，不产生孢子，但能够形成菌核，其菌丝和菌核可在土壤或病残体上越冬，来年直接或间接的侵入棉苗，在土壤中形成的菌核一般可存活数月至几年。近年来，全国各地不同的棉区立枯病的发病率从5％～40％不等，在发病率高的棉区，发病率可达到50％，造成棉苗的大片死亡，发病严重时，造成缺苗断垄、甚至毁种。
棉花红腐病是一种危害较大的苗期病害，也叫烂根病，其致病菌株为多种镰刀菌，在我国棉花红腐病病原菌以串珠镰刀菌(Fusarium.moniliforme)为主，后改名为拟轮枝镰孢霉(Fusarium verticilliodesin)，当拟轮枝镰孢霉入侵寄主植株后，会产生抑制植物生长的毒素，导致的寄主植株的组织细胞受损，在入侵棉花后，前期会造成棉花烂芽、栏种、棉苗根部的腐烂，后期危害棉铃，严重影响棉花的产量和纤维品质。
目前，轮作倒茬、抗病品种选育以及化学防治等是防治棉花土传病害的主要措施，但由于抗病育种选育周期长且缺乏天然抗性资源而受到限制，化学农药在防治棉花土传病害中发挥着重要的作用，然而过度依赖和滥用化学农药产生了有害生物抗药性、农药残留超标、环境污染等一系列问题。因此，尚未找到理想的防治措施，近年来，生物防治以绿色环保，不易产生抗性、发展潜力大等优势被人们关注并且应用于实践中，成为防治棉花枯、黄萎病，立枯病和红腐病的重要途径。
利用生物制剂防控棉花土传病害由来已久，然而目前常用的微生物制剂存在诸多不足，主要体现在以下几个方面：(1)棉花土传病原菌种类多样，在棉花的生长过程中常常几种病害混发，例如在棉花苗期，立枯病和红腐病混合发生，造成黑根死苗，僵苗迟发和缺苗断垄；棉花成株期黄萎病和枯萎病混合发生，造成植株死亡或产量、品质大幅度下降。然而目前研发的一些微生物菌剂其核心菌株只能抑制特定的土传病原菌，兼防效果较差，不能满足生产的需要；(2)目前在棉花土传病害生物防治中所使用的菌株主要包括芽孢杆菌、假单胞菌、木霉和简青霉等，这些菌株的生防机制主要包括分泌抗菌次级代谢物、抗菌蛋白，重寄生或者资源竞争等。然而，由于田间环境复杂，环境条件对其定植和次级代谢产物的活性影响较大，在农业生产中实际使用时，往往出现防效不稳定、后期防效差等问题，导致生物菌剂的实际应用受到一定程度的限制。因此，发展更广谱、高效的棉花土传病害防控方法是一个重要的研究方向。
黏细菌(myxobacteria)是一类通才型的微生物捕食者，能够在固体表面滑行运动，通过直接攻击、狼群围捕或孤立捕食多样化的策略猎杀细胞。黏细菌捕食谱相当广泛，其对被捕食菌的偏爱性一般体现在很大的分类单位如门和纲的层次，有可能解决某些病原菌菌系差异大等防治难题。同时黏细菌能够产生丰富的具有抗菌活性的酶类和次生代谢产物。此外黏细菌在营养匮乏或者面对逆境时会形成子实体，菌体分化成抗逆性强的黏孢子，抵抗干燥、寒冷、炎热和营养缺乏等外部不良环境，使黏细菌可以在很多极端环境中长期生存，具备良好的稳定性和竞争力。近年来的研究还发现，黏细菌具有土壤微生物群落生态调控功能。黏细菌的这些特性使其在被视为一类新型生防微生物资源，具有重要的生防潜力。
然而由于黏细菌分离纯化困难，目前利用黏细菌的捕食特性实现在农业生产过程中对包括植物病原真菌和细菌等在内的有害微生物的防治方面的研究非常有限。目前作为专利保护的主要包括广东省微生物所申请的Myxococcus sp.e-3-1、Polyangium sp.8#-3和Cystobacter sp.XJ9-1在制备捕食和抑制植物病原细菌的药物中的应用(201611095485.2)，粘细菌M34在抑制植物病原菌中的应用(202010469601.2)，玻囊菌Hyalangium sp.H56D21在植物病害生物防治中的应用；南京农业大学申请的珊瑚球菌Corallococcus sp.EGB、叶柄粘球菌Myxococcus sp.BS和原囊菌Archangium sp.AC19在植物病害防控方面的应用等(201310028459.8，201711363218.3，202210755118.X)。然而黏细菌往往具有菌株特异性，不同种属菌株之间的抗菌效果存在较大的差异，即同种不同株型的黏细菌产生的裂解酶、活性次级代谢产物差异较大，即使针对同一种病原菌同种不同株型的黏细菌其抗菌活性及作用机制也存在明显差异。因此基于现有生防菌的专利保护现状，尤其黏细菌作为一类具有应用潜力的生防微生物，筛选出对多种棉花土传病害具有兼防作用的优良菌株一直是本领域技术人员不断追求的目标。
发明内容
本发明的目的是提供深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用，对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和棉花红腐病菌均具有广谱高效的捕食活性，同时具有多重抗菌机制，能够稳定定植在根系表面，从而起到稳定的生防作用，在棉花土传病害生物防治方面具有巨大的应用潜力。
为实现上述目的，本发明提供了深褐色孢囊杆菌，为深褐色孢囊杆菌HM-E，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年8月25日，保藏号为CGMCC No.28249，分类命名为深褐色孢囊杆菌Cystobacter fuscus。
进一步的，深褐色孢囊杆菌HM-E的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，lepA基因序列如SEQ ID NO.2所示，gyrB基因序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了深褐色孢囊杆菌在棉花土传病害生物防治中的应用。
本发明还提供了深褐色孢囊杆菌菌剂，是由上述的深褐色孢囊杆菌制备得到的。
本发明还提供了深褐色孢囊杆菌菌剂在棉花土传病害生物防治中的应用。
进一步的，棉花土传病害包括棉花枯萎病、黄萎病、立枯病和红腐病。
本发明所述的深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用的优点和积极效果是：
1、本发明提供的一种深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和棉花红腐病菌均具有广谱高效的捕食活性，通过室内盆栽试验显示出本发明所涉及的深褐色孢囊杆菌HM-E在棉花土传病害生物防治方面具有巨大的应用潜力。
2、深褐色孢囊杆菌HM-E具有多重抗菌机制，深褐色孢囊杆菌HM-E不但能通过菌体的直接接触捕食病原真菌，从而抑制大丽轮枝菌的生长；其胞外分泌的抗菌蛋白亦能抑制菌丝的生长；同时深褐色孢囊杆菌HM-E的挥发性代谢产物对大丽轮枝菌菌丝也表现出一定的抑制作用。
3、理想的生防菌株不仅要求抑菌活性高，而且要求定植能力强，拮抗微生物能够成功定植是生物防治植物病害的前提。本发明提供的深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花根系分泌物具有强烈的趋化作用，能够稳定定植在根系表面，从而为起到稳定的生防作用提供了基础。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例中菌株HM-E的形态图，其中a为菌株HM-E接种在VY/4固体培养基上菌膜的形态图；b为菌株HM-E子实体的形态图；c为菌株HM-E营养细胞和黏孢子的形态图；
图2为本发明实施例中16S rDNA和管家基因lepA、gyrB序列构建系统发育树对菌株HM-E进行分子鉴定；
图3为本发明实施例中深褐色孢囊杆菌HM-E对大丽轮枝菌菌丝的捕食作用；
图4为本发明实施例中深褐色孢囊杆菌HM-E挥发性代谢产物对大丽轮枝菌的抑菌效果；
图5为本发明实施例中深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花根系分泌物的趋化作用；
图6为本发明实施例中深褐色孢囊杆菌HM-E在棉花根部定植的扫描电镜图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所采用的培养基具体如下所述：
LB培养液：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH 7.0。
LBS液体培养基：可溶性淀粉7.0g/L，胰蛋白胨1.0g/L，酵母提取物5.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH 7.2-7.4。
VY/4培养基：安琪酵母2.5g/L，CaCl2 1.0g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2-7.4。
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，pH自然。
TPM培养液：10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L KH2PO4，MgSO4·7H2O1.97g/L。
WCX培养基：CaCl2 1.0g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2，灭菌后，加入放线菌酮至终浓度25μg/mL。
察氏培养液：硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30.0g/L，pH自然。
实施例1细菌的分离、纯化与鉴定
1.菌株的分离与纯化
从新疆和田地区棉田中采集深度为5-10cm的土壤样品，用40目筛网除去小石子和朽木后在室温条件下自然风干。称取20g的风干土样盛于无菌培养皿中，置于烘箱中65℃处理30min，待土样冷却后加入放线菌酮溶液(终浓度为25μg/mL)浸透，浸泡过夜后(时间≥12h)弃去残液，备用。
将解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)接种于LB液体培养基中，30℃震荡培养过夜(时间≥12h)，吸取1mL菌悬液于离心管中，12 000r/min，离心1min，收集菌体，用无菌水漂洗3次后留100μL作为细菌悬液。
用无菌接种环沾取细菌悬液在含放线菌酮(终浓度为25μg/mL)的WCX培养基表面划“田”字线，自然风干后在四个方格中央分别放置处理好的0.5g上述土壤样品，将WCX培养基于30℃恒温培养，48h后在体视显微镜下用灭菌细针尖端挑取WCX培养基中诱导出的黏细菌子实体，将其接种于VY/4培养基表面，将VY/4培养基于30℃恒温培养。
待VY/4培养基上长出透明菌膜时，及时挑取透明菌膜外缘转至新鲜VY/4平板上继续纯化，直至无杂菌生长，获得菌株HM-E。将分离纯化后的菌株HM-E接种于LB培养液中，30℃，180r/min震荡培养过夜(时间≥12h)。观察培养液的状态，若培养液清澈透明，表明该菌株为纯菌株(因为黏细菌在LB培养液中不生长)；若培养基浑浊，则证明菌落中混有其他杂菌。将纯菌株HM-E转入20％的甘油中，置于-80℃冰箱中保藏。
2.菌株HM-E的鉴定
(1)菌株HM-E的形态和培养特征观察
将菌株HM-E接种在VY/4固体培养基上菌膜呈半透明薄膜状扩展，有明显辐射线，边缘有脊状突起(图1中a所示)；体视显微镜下观察菌膜上有排列不规则的子实体，形态多为球形或卵球形，初期呈肉色，之后颜色逐渐变深呈亮褐色(图1中b所示)；营养细胞细杆状，末端尖，粘孢子粗棒状(图1中c所示)。
(2)菌株HM-E的生理生化特征
菌株HM-E为革兰氏阴性菌，最适生长温度为30℃，最适生长pH7.0，产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶，几丁质酶，不产生β-1,3葡聚糖酶。
(3)菌株HM-E 16S rDNA、lepA和gyrB基因的序列测定及分析
采用细菌基因组提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，TIANGEN)提取黏细菌总DNA。
以细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ IDNo.4)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID No.5)扩增16Sr DNA基因。
以引物BAUP1(5’-CATCGCCCACATCGAYCAYGGNAA-3’，SEQ IDNo.6)和BIDN1(5’-CATGTGCAGCAGGCCNARRAANCC-3’，SEQ IDNo.7)扩增管家基因lepA。
以引物gyrBBAUP2(5’-GCGGAAGCGGCCNGSNATGTA-3’，SEQ IDNo.8)和gyrBBNDN1(5’-CCGTCCACGTCGGCRTCNGYCATt-3’，SEQ IDNo.9)扩增管家基因gyrB。
PCR反应体系为25μL：DNA模板1.0μL，10μmol/L引物对各1.0μL，10mmol/L dNTPs1.5μL，10×PCR Buffer(2.5mmol/L MgCl2)2.5μL，2.5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，补足灭菌超纯水至25μL。
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程股份有限公司对PCR产物进行克隆测序，16S rDNA测序结果见SEQ ID No.1，lepA基因测序结果见SEQ IDNo.2，gyrB基因测序结果见SEQ ID No.3。
在NCBI中将16S rDNA基因、管家基因lepA和gyrB的测序结果进行比对，并利用MEGA5.0软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建3个基因的系统发育树(图2所示)。最终通过多基因位点序列比对、形态特征及生理生化特性，将菌株KS01鉴定为深褐色孢囊杆菌(Cystobacter fuscus)，命名为深褐色孢囊杆菌(Cystobacter fuscus)HM-E。
深褐色孢囊杆菌HM-E已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年8月25日，保藏编号为CGMCCNo.28249，分类命名为深褐色孢囊杆菌Cystobacter fuscus。
实施例2深褐色孢囊杆菌HM-E对4种棉花病原真菌的捕食作用
1.棉花病原真菌的活化：从试管斜面上挑取大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、拟轮枝链孢霉(Fusarium verticilliodesin)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、的菌丝块，转接于新鲜的PDA固体平板上，在26℃培养箱中培养活化。待菌丝扩展出1cm左右时，用灭菌的刀片沿菌丝扩展边缘切取2×2mm的琼脂块，再次转接于另一个新鲜的PDA平板上，待扩展出2cm左右的菌丝后即可用于后续实验。
2.深褐色孢囊杆菌HM-E菌悬液的制备：将深褐色孢囊杆菌HM-E接种到3mL LBS试管培养液中，160r/min，30℃摇培2天；12000r/min离心10min收集菌体，用TPM液体培养基清洗3次，最后用500μL TPM液体培养基重悬，得到深褐色孢囊杆菌HM-E菌悬液。
3.平板对峙试验：用灭菌的刀片沿上述活化后的病原真菌的菌丝扩展边缘切取2×2mm的琼脂块转接于VY/4平板中间，在26℃培养箱中培养。待菌丝扩展出0.5cm左右时，在距菌丝边缘约1.5cm处上下左右沿直线对称接种深褐色孢囊杆菌HM-E菌悬液，直线距离约为3cm，每条直线接种20μL。待自然风干后，将VY/4平板放入28℃培养箱中培养。以单独接种上述活化后的植物病原真菌的固体平板为对照，每组试验设3个重复。对峙5天后观察病原真菌菌落坍塌情况。
结果如图3所示，深褐色孢囊杆菌HM-E与4种棉花病原真菌对峙培养过程中其菌膜扩展到病原真菌菌落里面，菌丝明显坍塌、生长受限，而深褐色孢囊杆菌HM-E占据更广的生存位置和更多的繁殖营养。结果表明，深褐色孢囊杆菌HM-E对上述所选取的棉花病原真菌均具有良好的捕食作用，显示其良好的广谱抗病原真菌能力。
实施例3深褐色孢囊杆菌HM-E的代谢产物对4种棉花病原真菌的抗菌作用
1.深褐色孢囊杆菌HM-E挥发性代谢产物对4种棉花病原真菌的抑菌能力测定
在VY4固体平板上涂布100μL深褐色孢囊杆菌HM-E菌悬液(OD600＝2.0)培养3d，之后在PDA平板中心分别接种已经活化的直径为5mm的大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、拟轮枝链孢霉、立枯丝核菌菌块，将两个平板对扣密封，26℃恒温培养箱中培养5d。以4种棉花病原真菌与空白的VY4平板对扣培养作为对照，每个处理重复3次。结果如图4所示，与对照组相比4种棉花病原真菌菌落表面的菌丝生长稀松、坍塌，说明深褐色孢囊杆菌HM-E的挥发性代谢产物对4种棉花病原真菌的气生菌丝有一定的抑制作用。
2.深褐色孢囊杆菌HM-E非挥发性代谢产物对4种棉花病原真菌的抑菌能力测定
利用VY/4液体培养基对深褐色孢囊杆菌HM-E进行发酵培养，30℃，180r/min震荡培养4d。4℃，10000r/min离心10min收集发酵上清，在获得的300mL发酵上清液中加入硫酸铵晶体至80％饱和，4℃静置12h使粗蛋白充分沉淀，将蛋白悬浮液经4℃、12000r/min离心20min，弃上清收集沉淀，并用3mL 50mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液重悬，后用0.5KDa的透析袋，50mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液作透析液透析除去硫酸铵，收集透析袋内液体，并用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，备用。
在PDA平板培养基中心接种已经活化的直径为5mm的4种棉花病原真菌菌饼，在菌饼的2边呈对称在PDA平板中打孔，每孔距离中心20mm，在其中1孔接入30μL深褐色孢囊杆菌HM-E粗蛋白提取液，剩余1孔加入30μLTris-HCl缓冲液作为对照，每个处理重复3次，25℃恒温培养观察抑菌情况，第4d观察是否出现抑菌圈，并测量抑菌圈半径。
参照发明专利(专利号：202110820711.3)中的制备方法，发酵培养基为VY/4液体，接种前加入体积比2％的大孔树脂XAD-16，按照体积比2％的接种量接种深褐色孢囊杆菌HM-E，30℃，180r/min震荡培养4d，用纱布过滤收集树脂，加入2倍体积的甲醇置于30℃震荡浸提1h，过滤收集甲醇；重复浸提过程3-4次直至甲醇无色。合并收集的甲醇于旋转蒸发仪上35℃，40r/min减压蒸干。发酵1.0L该菌株共获得发酵液粗浸膏1.37g。用6mL二甲基亚砜(DSMO)：水(v/v 1：1)溶解上述粗浸膏并用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，得到制备好的次级代谢产物粗提液。将制备好的发酵液粗浸膏溶液用无菌去离子水稀释成浓度为100mg/mL的次级代谢产物粗提液。
在PDA平板培养基中心接种已经活化的直径为5mm的4种棉花病原真菌菌饼，在菌饼的2边呈对称在PDA平板中打孔，每孔距离中心20mm，在其中1孔接入30μL深褐色孢囊杆菌HM-E次级代谢产物粗提液，剩余1孔加入30μL DSMO水溶液作为对照，每个处理重复3次，25℃恒温培养观察抑菌情况，第4d观察是否出现抑菌圈，并测量抑菌圈半径。
结果如表1所示，制备的蛋白粗提液对4种棉花病原真菌均产生了抑菌圈，而次级代谢产物粗提液对4种棉花病原真菌并无抑菌作用，说明深褐色孢囊杆菌HM-E能分泌一些蛋白类物质来抑制4种棉花病原真菌的生长。
表1深褐色孢囊杆菌HM-E的胞外粗蛋白和次级代谢产物对4种棉花病原真菌的抑菌活性
综合结果表明，本发明所涉及的深褐色孢囊杆菌HM-E相比较发明专利(专利号：201611095485.2)中涉及的Cystobacter sp.XJ9-1存在明显差别，即在Cystobactersp.XJ9-1的发酵上清液中次级代谢物具有良好的抑菌作用，在浓度为50mg/mL时抑菌圈直径为8.8mm，而本发明涉及的深褐色孢囊杆菌HM-E的发酵上清液中，次级代谢产物并未产生抑菌活性，而蛋白类物质的抑菌活性更强。
实施例4深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花根系分泌物的趋化作用及根系定植能力测定
1.深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花根系分泌物的趋化性测定
将消毒后的棉种播种于盛有无菌蛭石的育苗钵中，待棉苗长至3叶期时整株挖出，根系清洗干净后将20株棉苗放入盛有400mL超纯水的锥形瓶中，用锡箔纸包裹瓶身黑暗处理，置于光照培养箱中30℃培养6-8h，转入盛有400mL MS培养基的锥形瓶中修复培养24h，用无菌水将棉苗根部残留的MS培养基冲洗干净，转入新的400mL超纯水中继续培养，每8h收集更换一次超纯水，收集2-3次即可，将收集的超纯水进行冷冻干燥，得到粉状根系分泌物，用无菌水溶解配置成100μg/μL的根系分泌物。在半固体TPM培养基上滴加5μL根系分泌物，静置风干后，在距其2mm处滴加3μL深褐色孢囊杆菌HM-E的菌悬液(OD600＝10.0)，以无菌水作为对照，静置风干后放置于30℃培养箱中，每隔12h在体视显微镜下观察黏细菌向根系分泌物的运动情况，并拍照记录。
结果如图5所示，深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花根系分泌物表现强烈趋化作用，从24h开始就观察到深褐色孢囊杆菌HM-E菌膜迅速的延伸向根系分泌物，随着时间的推移，深褐色孢囊杆菌HM-E生物菌膜快速生长、扩散并完全覆盖根系分泌物，而对照组无任何趋化现象。
2.深褐色孢囊杆菌HM-E在棉花根系定植能力测定
将深褐色孢囊杆菌HM-E接种于LBS液体培养基中培养3d，离心收集菌体，用TPMBuffer对菌体进行重悬，使菌体浓度OD600＝1.0；同时以大肠杆菌作为对照，用LB液体培养基培养24h后，离心收集菌体，用TPM Buffer对菌体进行重悬，使菌体浓度OD600＝1.0。将有机基质培养好的棉株幼苗根部清洗干净后分别放置于深褐色孢囊杆菌HM-E和大肠杆菌的TPM悬浮液中。然后将幼苗放置于30℃光照培养箱中培养1d，待定植完成后，用无菌水沿着植株幼苗颈部轻柔的冲洗幼苗根部。选取植株幼苗根部0.5-1.0cm片段，并且用2.5％的戊二醛溶液进行固定，固定好后进行扫描电镜观察。
结果如图6所示，与对照相比，在棉花根部可以看到大量的深褐色孢囊杆菌HM-E营养细胞，说明深褐色孢囊杆菌HM-E在棉花植株根部的有较强定植能力。
实施例5深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花黄萎病的室内防效测定
1.深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂的制备
将活化好的深褐色孢囊杆菌HM-E接种到LBS培养液中培养得到深褐色孢囊杆菌HM-E种子液，将种子液接入LBS培养液中，进行液体发酵生产，得到发酵液；将发酵液接种到固体发酵基质中，发酵得到深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂。
2.深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂接种对棉花黄萎病的盆栽防效测定
(1)将营养土与蛭石按4：1比例混合并装入塑料钵(40×20×15cm)中，播种时每粒种子下方穴施HM-E固体菌剂5.0g，覆一层薄土后，以每钵15粒种子的密度进行播种，每3个营养钵为一个处理，每处理重复3次；同时设置无菌固体发酵基质处理组(即不含深褐色孢囊杆菌HM-E的固体发酵基质)，即每粒棉种播种时穴施5.0g无菌固体发酵基质；以正常土壤作为对照组。播种后10d进行定苗，每钵保留10株棉苗，待2片真叶初现时，每株棉苗采用伤根法接种大丽轮枝菌孢子悬浮液(含量为1×108个/mL)5mL。
(2)上述处理后的棉株放置在温度为25-32℃，相对湿度60％以上的日光温室中培育，常规管理。从接种大丽轮枝菌孢子悬浮液起，每7d调查棉花植株生长状况，统计发病的植株数量。当有处理组棉花发病率达到80％时，停止本次盆栽实验，剖杆检查各处理棉株维管束变色情况，并参照棉花黄萎病剖杆法病情分级标准，调查发病率，计算病情指数和防治效果。
棉株发病分级标准如下：
0级：横切面无褐色斑点；1级：横切面褐色面积占横切面的25％以下；2级：褐色面积占横切面的25～50％；3级：褐色面积占横切面的50～75％；4级：褐色面积占横切面的75％以上，横切面几乎全变褐色。按下列公式计算发病率、病情指数及防效。
发病率(％)＝调查病株数/调查总株数×100。
病情指数＝[∑(各级病株数×级数)/(调查总株数×最高级值)]×100。
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。
通过对盆栽棉株连续的观察，到出苗后第60d，通过剖杆法调查发病率、病情级别，计算各处理病情指数和盆栽防效。
结果如表2所示，以深褐色孢囊杆菌HM-E制备的固体菌剂处理组能够显著降低棉株的发病率和病情指数，防治效果达到70.90％，而无菌固体发酵基质也能起到一定的防效，但其防效仅为27.75％，表明施用深褐色孢囊杆菌HM-E能够有效防治棉花黄萎病。
表2深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花黄萎病的温室盆栽防治效果
注：表中数据为平均数±标准差，不同字母表示组间具有显著性差异，P<0.05
实施例6深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花枯萎病的室内防效测定
1.棉花枯萎病菌土的制备
挑取直径为5mm的棉花枯萎病病原菌菌饼放入察氏培养基中，在25℃、180r/min摇床中培养5d，将得到的棉花枯萎病菌菌液接种到灭菌后的玉米沙土(质量比1：1)培养基中，25℃恒温培养箱暗培养，待菌丝长满克氏瓶，将培养物取出自然风干，备用。将上述得到的棉花枯萎病菌玉米沙土培养物与蛭石营养土，按菌土质量比2％充分混匀后制成棉花枯萎病菌土。
2.深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂接种对棉花枯萎病的盆栽防效测定
将上述制备好的棉花枯萎病菌土装入营养钵中，播种时每粒种子下方穴施实施例5制备的HM-E固体菌剂5.0g，覆一层薄土后，以每钵15粒种子的密度进行播种，每3个营养钵为一个处理，每处理重复3次；同时设置无菌固体发酵基质处理组(即不含深褐色孢囊杆菌HM-E的固体发酵基质)，即每粒棉种播种时穴施5.0g无菌固体发酵基质；以棉花枯萎病菌土作为对照组。播种后10d进行定苗，每钵保留10株棉苗。
上述处理后的棉株放置在温度为25-32℃，相对湿度60％以上的日光温室中培育，常规管理。在棉苗出苗后30d，参照棉花苗期枯萎病的分级标准(5级分级标准)调查发病率，计算病情指数和防治效果。
棉花枯萎病的病情分级标准如下：
0级：棉株健康，无病叶，生长正常；1级：棉株1片2片子叶变黄萎蔫；2级：棉株2片子叶和1片真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；3级：棉株2片子叶及2片或2片以上真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状或青枯状，棉株矮化或萎蔫；4级：棉株所有叶片发病，棉株枯死。
通过对盆栽棉株连续的观察，到出苗后第30d对照组的发病率达到64.44％，此时通过调查发病率、病情级别，计算各处理病情指数和盆栽防效。结果如表3所示，以深褐色孢囊杆菌HM-E制备的固体菌剂处理组能够显著降低棉株的发病率和病情指数，对棉花枯萎病的防治效果达到70.24％。
表3深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花枯萎病的温室盆栽防治效果
注：表中数据为平均数±标准差，不同字母表示组间具有显著性差异，P<0.05
实施例7深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花立枯病和红腐病的兼防效果测定
1.棉花立枯病菌和棉花红腐病菌菌土的制备
选用新鲜成熟无破损的麦粒挑除杂质，清洗干净在清水中浸泡10-15h，再次清洗后蒸熟，不破粒即可，捞出后冷却以每瓶100g装入250mL的锥形瓶中，每瓶加入10％葡萄糖液2mL，放入121℃高压灭菌锅中灭菌90min；采用打孔器从培养好的棉花立枯病菌和棉花红腐病菌平板上打取菌饼，分别接种到装有麦粒的锥形瓶中，随后置于25℃温箱培养7-10d，备用。将上述制备好的棉花立枯病菌麦粒培养物和棉花红腐病菌麦粒培养物按菌土质量比0.05％分别与蛭石营养土充分混匀，再将棉花立枯病菌菌土和棉花红腐病菌菌土按质量比1：1充分混匀进行混合接种试验。
2.固体菌剂接种对棉花立枯病和棉花红腐病的盆栽防效测定
将上述制备好的混合菌土装入营养钵中，播种时每粒种子下方穴施实施例5制备的HM-E固体菌剂5.0g，覆一层薄土后，以每钵15粒种子的密度进行播种，每3个营养钵为一个处理，每处理重复3次；同时设置无菌固体发酵基质处理组(即不含深褐色孢囊杆菌HM-E的固体发酵基质)，即每粒棉种播种时穴施5.0g无菌固体发酵基质；以棉花立枯病菌和棉花红腐病菌的混合菌土作为对照组。播种后10d进行定苗，每钵保留10株棉苗。
上述处理后的棉株放置在温度为25-32℃，相对湿度60％以上的日光温室中培育，常规管理。在棉苗生长至3叶期，参照棉花红腐病和立枯病的分级标准(5级分级标准)调查发病率，计算病情指数和防治效果。
棉株发病分级标准如下：
0级：无病状，健康植株；1级：下胚轴有少数小的病斑(褐色凹陷斑或红肿斑纹)，病斑横向直径<下胚轴直径的1/4；2级：下胚轴病斑稍大，下胚轴直径的1/4<病斑直径<下胚轴直径的1/2；3级：下胚轴病斑较大，下胚轴直径的1/2<病斑直径<下胚轴直径的3/4，或下胚轴缢缩；4级：病斑直径>下胚轴直径的3/4，或整株萎萎蔫死亡。
试验结果如表4所示，以深褐色孢囊杆菌HM-E制备的固体菌剂处理组能够显著降低棉株的发病率和病情指数，对棉花立枯病和棉花红腐病的兼防效果达到66.30％。
表4深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花立枯病和棉花红腐病的兼防效果
注：表中数据为平均数±标准差，*表示处理与对照差异显著(P<0.05)。
实施例8深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花枯、黄萎病的田间防效测定
深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂制备方法同实施例5，田间防治效果试验在新疆库尔勒市巴州农科所连年发生棉花枯、黄萎病的自然病圃中进行，棉花种植方式为膜下滴灌。根据试验设计种植小区，每个小区长5m，宽3.6m，株距10cm。共设3个处理，每个处理1膜4行，3次重复，即3膜12行为1个处理区组。在播种前，按50kg/亩菌肥计算，在每行种沟中均匀撒施250g的深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂，同时设置无菌固体发酵基质处理组，即在播种前，在每行种沟中均匀撒施250g的无菌固体发酵基质，以正常土壤作为对照处理组。
棉花播种后常规管理，但期间不施用任何杀菌剂和其他微生物菌剂或菌肥。播种后在棉花花蕾期参照田间棉花枯、黄萎病分级标准调查发病率，计算病情指数和防治效果。同时调查其株高、茎粗、单株果枝数、蕾数、铃数等农艺性状。
田间棉花枯、黄萎病分级标准如下：
0级：棉株健康，无病叶，生长正常；1级：棉株33％及其以下叶片发病，变黄萎蔫；2级：棉株33％以上，66％及其以下叶片发病，变黄萎蔫；3级：棉株66％以上，99％及其以下叶片发病，变黄萎蔫；4级：棉株叶片全部脱落，棉株枯死。
发病情况调查结果如表5所示，以深褐色孢囊杆菌HM-E制备的固体菌剂作为种肥处理能够显著降低棉株的发病率和病情指数，防治效果达到75.94％。同时施用深褐色孢囊杆菌HM-E制备的固体菌剂后能显著增加棉花的蕾数、铃数等与棉花产量密切相关的农艺性状(表6)。
表5深褐色孢囊杆菌HM-E对棉花枯、黄萎病的大田防治效果
表6大田条件下深褐色孢囊杆菌HM-E固体菌剂对棉花农艺性状的影响
因此，本发明采用上述的深褐色孢囊杆菌及其在棉花土传病害生物防治中的应用，对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和棉花红腐病菌均具有广谱高效的捕食活性，同时具有多重抗菌机制，能够稳定定植在根系表面，从而起到稳定的生防作用，在棉花土传病害生物防治方面具有巨大的应用潜力。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.深褐色孢囊杆菌，其特征在于：为深褐色孢囊杆菌HM-E，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年5月15日，保藏号为CGMCC No.28249，分类命名为深褐色孢囊杆菌Cystobacterfuscus。
2.根据权利要求1所述的深褐色孢囊杆菌，其特征在于：深褐色孢囊杆菌HM-E的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，lepA基因序列如SEQ ID NO.2所示，gyrB基因序列如SEQ IDNO.3所示。
3.如权利要求2所述的深褐色孢囊杆菌在棉花土传病害生物防治中的应用。
4.深褐色孢囊杆菌菌剂，其特征在于：深褐色孢囊杆菌菌剂是由如权利要求2所述的深褐色孢囊杆菌制备得到的。
5.如权利要求4所述的深褐色孢囊杆菌菌剂在棉花土传病害生物防治中的应用。
6.根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于：棉花土传病害包括棉花枯萎病、黄萎病、立枯病和红腐病。
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