CN117143768A - 一株具有熏蒸防病作用的萎缩芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有熏蒸防病作用的萎缩芽孢杆菌及其应用。本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有熏蒸防病作用的萎缩芽孢杆菌及其应用。本发明的萎缩芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CGMCC No.26620，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26620。熏蒸实验表明，萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对黄瓜根腐病的防治效果最高可达86.6％，同时萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对黄瓜具有促生效果，在生产应用中具有广阔前景。

Description

一株具有熏蒸防病作用的萎缩芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有熏蒸防病作用的萎缩芽孢杆菌及其应用。
背景技术
黄瓜根腐病在我国各地普遍发生其发病情况较为严重。该病由茄病镰孢菌(Fusarium solani)侵染，多侵染植株根茎部，病部初呈水浸状，后于茎基或根部产生褐斑，逐渐扩大后凹陷，严重时病斑绕茎基部或根部一周，地上部逐渐枯萎，纵剖茎基或根部。导管变为深褐色，后根茎腐烂不长新根，植株枯萎而死。茎缢缩不明显，病部腐烂处的维管束变褐，不向上发展，区别于枯萎病。后期病部往往变糟，留下丝状维管束，严重的则多数不能恢复而枯死，该病易于流行且难以防治。
目前常见的防治方法主要有化学防治、物理防治以及生物防治等。土壤熏蒸是一种防治土传病害直接、快速、有效的方法，可解决土壤重茬问题，促进作物生长，提高产量及解决农药残留问题。化学熏蒸是一种防治土传病害常见且有效的方法，但长期使用化学熏蒸剂也会对土壤及周围环境产生负面影响。近年来，生物熏蒸在我国深受广大农户认可，即是指利用生物本身产生或降解后释放的挥发性物质，对土壤中的有害微生物进行防控的一种环境友好型的土壤熏蒸技术。具有安全、高效、环保等特点，拥有广阔的发展前景。生防菌防治土传病害应用较广，将生防菌悬液灌入土壤中，进行充分混合，通过覆膜熏蒸的方式防治土传病害的侵染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制果蔬作物茄病镰孢菌病原菌和/或防治黄瓜黄瓜根腐病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株萎缩芽孢杆菌。
本发明提供的萎缩芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CGMCCNo.26620，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.26620。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有上述萎缩芽孢杆菌和/或所述萎缩芽孢杆菌的代谢物；所述菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌为茄病镰孢菌(Fusarium solani)，所述病害为黄瓜根腐病。
上述萎缩芽孢杆菌在制备下述1)-3)中任一的产品中的应用也属于本发明的保护范围：
1)用于防治黄瓜根腐病和/或提高黄瓜产量的菌剂；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为茄病镰孢菌；
3)病害抑制剂，所述病害为黄瓜根腐病。
上述菌剂的活性成分可为上述萎缩芽孢杆菌和/或上述萎缩芽孢杆菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
上述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述代谢物可从所述萎缩芽孢杆菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述萎缩芽孢杆菌的无菌代谢物或所述萎缩芽孢杆菌的含菌代谢物。所述萎缩芽孢杆菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述萎缩芽孢杆菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述萎缩芽孢杆菌即得到所述萎缩芽孢杆菌的无菌代谢物。所述萎缩芽孢杆菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述萎缩芽孢杆菌，收集发酵液，该发酵液即为所述萎缩芽孢杆菌的含菌代谢物。
本发明还提供了含有上述萎缩芽孢杆菌或含有上述萎缩芽孢杆菌和/或上述萎缩芽孢杆菌的代谢物的菌剂的生物有机肥。
本发明还提供了培养上述萎缩芽孢杆菌的方法，包括将所述萎缩芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
本发明还提供了上述菌剂的制备方法，可包括如下步骤：将上述萎缩芽孢杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
本发明还提供了前文所述萎缩芽孢杆菌或所述的菌剂在栽培黄瓜中的应用。
本发明还提供了一种栽培黄瓜的方法，包括向栽培黄瓜种子的商品育苗基质(由草炭、蛭石、珍珠岩组成)中添加前文所述萎缩芽孢杆菌或所述的菌剂进行熏蒸。
上述方法中，所述添加前文所述萎缩芽孢杆菌或所述的菌剂的添加比例为：1×108cfu萎缩芽孢杆菌：10L的商品育苗基质。
上述方法中，所述熏蒸程序为：28℃温室，熏蒸7天。
上述方法中，所述熏蒸程序为在密封保鲜盒中进行。
上述方法中，所述萎缩芽孢杆菌与基质混合物放置于隔离球中。
上述萎缩芽孢杆菌在防治黄瓜根腐病和/或提高黄瓜产量中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明获得的萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620是一株对黄瓜根腐病病具有较高活性的生防菌株。通过熏蒸实验发现，萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620可有效抑制病原菌的生长，对黄瓜根腐病害有防治效果；另外可利用熏蒸的方法验证生防菌对茄病镰孢菌抑菌效果，对于田间土传病害生物防控及高效生防菌开发提供技术支撑。
附图说明
图1为菌株ZF506菌株形态。
图2为菌株ZF506多基因系统发育树。
图3为隔离球结构示意图。
图4为萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对茄病镰孢菌感染的黄瓜进行熏蒸效果考察。其中A、接种ZF506熏蒸处理组；B、清水对照组；C、健康对照组。
保藏说明
菌种名称：萎缩芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus atrophaeus
菌株编号：ZF506
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2023年2月21日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26620。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的茄病镰孢菌(Fusarium solani)已记载于：柴阿丽，韩云，武军，石延霞，谢学文，李宝聚.基于FDA-PI双荧光复染法的茄病镰刀菌孢子活性定量检测.中国农业科学.2015,48(14):2757-2766.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的PD培养基配制方法如下：土豆200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，pH6.5。
下述实施例中的商品育苗基质购于山东天酵源生物科技有限公司。
下述实施例中，黄瓜根腐病以每棵黄瓜苗为单位进行调查，病害分级标准如下：
0级：无症状，植株生长良好；
1级：胚轴或子叶上出现轻微症状，但生长正常；
2级：胚轴或子叶有明显坏死斑，或一片子叶黄化，生长受一定影响；
3级：坏死斑严重引起局部萎蔫，或一片真叶枯死，或生长僵化；
4级：整体妻蔫倒伏或枯死。
病情指数＝病情指数＝[∑(各级病株数×相对级数的代表值)/(总株数×最高级数的代表值)]×100
实施例1萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)ZF506的分离鉴定
1.分离
采集浙江省杭州市富阳区杏梅坞村的6份土样，将不同的土样分别定量溶解在无菌水里，90mL溶液溶解10g土样。并在摇床中震荡15min，80℃水浴15min。注意：及时在烧瓶上做标记区分土样。取已静置分离的某一土壤溶液1mL,然后按10倍梯度稀释3-5次，分别取后面2次稀释液100μL，移到NA培养基平板上涂皿，在28℃下培养1-2d后，将单菌落的细菌移到NA培养基平板上划线，培养1d后分离出219株菌株，保存于4℃冰箱中，待用。
挑取不同形态的细菌菌株进行纯化，并进行菌株编号。通过试验筛选得到一株有效菌株，将其命名为菌株ZF506，对菌株ZF506进行鉴定。
2.鉴定
2.1菌株ZF506形态学观察
菌株ZF506在LB平板上28℃培养24h，菌落前期呈乳白色，后期呈乳黄色，菌落不透明，边缘不规则，呈波状，菌落表面不平滑，微微凸起，为革兰氏阳性菌。菌株ZF506菌株形态具体见图1。
2.2菌株ZF506生理生化鉴定
菌株ZF506在pH5、pH6以及1、4、8％的NaCl下可以生长，可以利用甘油、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-山梨醇、D-甘露醇等。其生理生化特征与已报道的萎缩芽孢杆菌的标准菌株一致。具体鉴定结果见表1。
表1、利用BIOLOG GENIII试剂条鉴定菌株ZF506生理生化特征
注：+为阳性；-为阴性，W为弱阳性。
2.3菌株ZF506多基因系统发育树构建
利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒，小量提取菌株ZF506基因组DNA为模板，选择16S rDNA、gyrA、gyrB和rpoD等保守基因(引物序列见表2)进行PCR扩增并测序。所得PCR产物由北京博迈德生物公司进行测序。使用MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview4等软件对测序结果进行分析，构建最大似然法系统进化树，分析其分类地位。
表2、引物序列
经PCR扩增后，得到菌株ZF506 16S rDNA、gyrA、gyrB和rpoD基因序列，构建ZF506多基因系统进化树(图2)，该菌株与模式菌株Bacillus atrophaeus GQJK17聚在一簇，因此初步确定其分类地位为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。菌株ZF506具有核苷酸序列是序列表中序列1的16S rDNA，具有核苷酸序列是序列表中序列2的gyrB基因，具有核苷酸序列是序列表中序列3的gyrA基因和具有核苷酸序列是序列表4的rpoD。
综合上述分类学特征，将菌株ZF506鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)
3.萎缩芽孢杆菌ZF506的保藏
萎缩芽孢杆菌ZF506已于2023年2月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.26620。以下简称萎缩芽孢杆菌CGMCCNo.26620或者菌株ZF506。
实施例2、萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对茄病镰孢菌的抑菌性试验
为了验证萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对靶标茄病镰孢菌的抑菌性，采用保鲜盒模拟熏蒸的方法检测萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620在黄瓜根腐病活体中的抑菌效果。
1.茄病镰孢菌株活化培养
将4℃保存的茄病镰孢菌株使用PDA培养基活化，在无菌操作台内打孔，接种于PDA平板上，放真菌培养室培养，5天后挑取边缘新长出的菌丝转接到PD液体培养基中，放于28℃、120rpm摇床内进行摇菌。5天后使用豆浆机将PD培养基菌丝均匀打碎，使用血球计数板测定茄病镰孢菌孢子浓度在108cfu/mL，以体积1:10的添加比例(1×108cfu茄病镰孢菌：10L的商品育苗基质)进行拌土放入盒体1中，得到拌有茄病镰孢菌病原菌的菌土。
2.萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620活化培养
将萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620接种于LB培养液中，置于37℃恒温振荡器中150rpm活化16h，调节菌液浓度为108cfu/mL，以体积1:10的添加比例(1×108cfu萎缩芽孢杆菌：10L的商品育苗基质)拌土后放入隔离球(隔离球结构见图3)中，获得装满萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620菌土的隔离球。
3.萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对茄病镰孢菌的抑菌研究
抑菌试验共设3个处理，每个处理3次重复，需要黄瓜种子108棵。具体分为如下三组：
处理组A：将上述步骤2中装满萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620菌土的隔离球埋到上述步骤1中拌有茄病镰孢菌病原菌的菌土的保鲜盒中，密封条件下放28℃温室内进行熏蒸7天。将熏蒸后的茄病镰孢菌的菌土基质取出放入穴盘中，进行黄瓜种子的播种。
处理组B：将上述步骤1中拌有茄病镰孢菌病原菌的菌土放入盒体中，不加隔离球，密封条件下28℃温室内放置7天，然后将含有茄病镰孢菌的菌土基质取出放入穴盘中，进行黄瓜种子的播种。
处理组C：不带茄病镰孢菌的商品育苗基质进行黄瓜播种。
表3、三种处理方式下的黄瓜根腐病病情指数结果
将上述三个处理组的基质进行黄瓜播种，14天后进行病情调查，病情指数及防效结果如表3和图4所示：其中处理组A代表的是加CGMCC NO.26620菌土熏蒸处理、处理组B代表的是只接种茄病镰孢菌的清水对照、处理组C代表的是未接种茄病镰孢菌和未进行CGMCCNO.26620菌土熏蒸处理的健康对照。萎缩芽孢杆菌CGMCCNo.26620熏蒸后的处理发病率为11.81％，单茄病镰孢菌发病率为88.14％。
综上可知，经过保鲜盒和隔离球熏蒸处理的茄病镰孢菌菌土播种黄瓜种子后发病率大大降低。表明萎缩芽孢杆菌CGMCC No.26620对黄瓜根腐病有较好的抑菌效果，对于田间土传病害生物防控及高效生防菌开发提供支撑。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.萎缩芽孢杆菌，其特征在于：所述萎缩芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)CGMCC No.26620，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26620。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌和/或所述萎缩芽孢杆菌的代谢物；所述菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌为茄病镰孢菌(Fusarium solani)，所述病害为黄瓜根腐病。
3.权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌在制备下述1)-3)中任一的产品中的应用：
1)用于防治黄瓜根腐病和/或提高黄瓜产量的菌剂；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为茄病镰孢菌(Fusarium solani)；
3)病害抑制剂，所述病害为黄瓜根腐病。
4.生物有机肥，其特征在于：所述生物有机肥含有权利要求1所述萎缩芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂。
5.培养权利要求1所述萎缩芽孢杆菌的方法，包括将所述萎缩芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
6.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
7.权利要求1所述萎缩芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在栽培黄瓜中的应用。
8.栽培黄瓜的方法，包括向栽培黄瓜种子的商品育苗基质添加权利要求1所述萎缩芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂熏蒸。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于：添加权利要求1所述萎缩芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂熏蒸的添加比例为：1×108cfu萎缩芽孢杆菌：10L所述基质。
10.权利要求1所述的防治黄瓜根腐病和/或提高黄瓜产量中的应用。
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