CN114164137A

CN114164137A - 一种抗香蕉枯萎病的淀粉酶产色链霉菌及其应用

Info

Publication number: CN114164137A
Application number: CN202111205932.6A
Authority: CN
Inventors: 王尉; 陈宇丰; 谢江辉; 周登博; 魏永赞; 张妙宜; 井涛; 臧小平; 云天艳
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences; Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences; Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-10-15
Also published as: CN114164137B

Abstract

本发明提供了提供一种抗香蕉枯萎病的淀粉酶产色链霉菌及其应用，所述的淀粉酶产色链霉菌，淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1‑9，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021301。本发明的淀粉酶产色链霉菌具有稳定广谱抑菌活性，其进行发酵培养后，对香蕉枯萎病菌4号小种、辣椒炭疽病菌、香蕉长形斑病菌、黄瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、胶孢炭疽病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、香蕉树木溃疡病菌等具有良好的拮抗作用，为枯萎病等多种植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。

Description

一种抗香蕉枯萎病的淀粉酶产色链霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产色链霉菌及其应用，尤其涉及一种抗香蕉枯萎病的淀粉酶产色链霉菌及其应用。

背景技术

香蕉是芭蕉科芭蕉属植物，主要分布在热带和亚热带，是世界上产量和贸易最重要的水果之一(Dita et al.，2018)。全球香蕉年产量约1.48亿吨，其主产区为亚洲和中南美洲，是世界上产量仅次于柑橘的第二大水果作物，为全球约4亿人口提供了主食(Dusunceli，2017)。中国是世界上香蕉第四大主产国，2017年产量为1116.98万吨。香蕉在国内市场占有重要地位，不仅是我国非常受欢迎的水果，在出口产品中也占有重要位置(马凤娟，2019)。在香蕉产业不断发展，逐渐取得一定成效时，香蕉枯萎病在各香蕉种植区蔓延开来，导致传统香蕉种植面积急剧缩减，甚至出现丢荒改种等现象，给香蕉产业带来重大经济损失。

香蕉枯萎病(Fusarium wilt of banana)是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f. sp.Cubense，Foc)侵染所引起的一种土传病害(Ploetz et al.，1990)。由于其高发病率、破坏性大和传播迅速，已严重威胁着世界香蕉行业的的健康发展(汪军，2014)。目前，香蕉枯萎病主要发生在热带和亚热带地区的香蕉主产区，给蕉农带来严重的经济损失，而且还有不断扩大的趋势(Bubici et al.，2019)。香蕉枯萎病不但传播迅速，而且传播途径广，可直接通过已发病的蕉园土壤和带病种苗进行扩散(马凤娟，2019)，还可通过不规范的农事操作进行传播和转移病菌(如使用未消毒的工具、在对蕉园进行灌溉时不实行分流等)，线虫和人员走动等近距离传播也会加快病原菌的扩散(游晓朝，2018)。

香蕉枯萎病由于其高发病率、破坏性大和传播迅速，给蕉农带来严重的经济损失，而且还有不断扩大的趋势(Bubici et al.，2019)，已严重威胁着世界香蕉行业的的健康发展。在化学防治难以奏效和没有较好的抗病品种培育出来之前，生物防治被认为是目前最为有效的方法之一 (Dita et al.2018)。而绝大多数的生防菌是从植物或者土壤中分离筛选得到的，因此寻找新型无公害的生防菌防治香蕉枯萎病已成为当务之急。内生放线菌广泛存在于药用植物组织中，具有丰富的物种多样性，是植物微生态系统的重要组成部分(郑有坤等，2014)。且目前五指山自然保护区药用植物内生放线菌尚未有人研究，这类未知的待开发资源在医药卫生、生物防治和促进植物生长方面具有很大的应用潜力，为香蕉枯萎病害的防控提供新的生防资源。本研究以香蕉枯萎病原菌4号生理小种(Foc TR4)为靶标菌，研究了一种淀粉酶产色链霉菌 (Streptomyces diastatochromogenes)1-9的抑菌机理及对香蕉枯萎病的防治效果。该研究将为菌株1-9的研发和应用奠定基础，为绿色防治香蕉枯萎病提供参考。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种淀粉酶产色链霉菌，对多种病菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。

本发明的第一个方面是提供一种淀粉酶产色链霉菌，命名为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1-9，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021301。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的淀粉酶产色链霉菌的发酵液过滤液或发酵液的无水乙醇提取物。

其中，所述发酵液的无水乙醇提取物是发酵液加入乙醇萃取后，过滤浓缩得到。

本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的淀粉酶产色链霉菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在拮抗香蕉枯萎病菌4号小种F.oxysporum Race 4、和/或辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum、和/或香蕉长形斑病菌 Curvulatia fallax、和/或黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum(Schl.)F.sp cucumerinum Owen、和/ 或芒果炭疽病菌Colletotrichum acutatum、和/或水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cav、和/或胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、和/或小麦赤霉病菌FusaHum graminearum Sehw、和/ 或苹果轮纹病菌Botryosphaeriadothidea、和/或香蕉树木溃疡病菌Btoryosphaeria dothidea中的应用。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的淀粉酶产色链霉菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在制备防治香蕉枯萎病菌4 号小种F.oxysporum Race 4、和/或辣椒炭疽病菌Colletotrichumacutatum、和/或香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax、和/或黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum(Schl.)F.sp cucumerinum Owen、和 /或芒果炭疽病菌Colletotrichumacutatum、和/或水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cav、和/或胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、和/或小麦赤霉病菌FusaHum graminearum Sehw、和/或苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea、和/或香蕉树木溃疡病菌Btoryosphaeriadothidea所致病害的生防制剂中的应用。

本发明的第五个方面是提供一种生防制剂，其含有本发明第一个方面所述的淀粉酶产色链霉菌，或者含有本发明第二个方面所述的淀粉酶产色链霉菌的发酵液、或发酵液的过滤液、或发酵液的乙醇提取物。

本发明的淀粉酶产色链霉菌，具有稳定广谱抑菌活性，其进行发酵培养后，对香蕉枯萎病菌4号小种、辣椒炭疽病菌、香蕉长形斑病菌、黄瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、胶孢炭疽病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、香蕉树木溃疡病菌等具有良好的拮抗作用，为枯萎病等多种植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株1-9在高氏1号培养基上培养14天后扫描电镜观察；

图2为基于菌株1-9的16S rRNA gene序列的系统发育树；

图3为菌株1-9代谢产物对植物病原真菌的抑菌活性鉴定结果；

图4为激光共聚焦显微镜观察菌株1-9对香蕉枯萎病的防控效果；

图5为香蕉植株球茎侧切观察菌株1-9对香蕉枯萎病的防控效果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种淀粉酶产色链霉菌，命名为淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1-9，(下文简称“菌株1-9”)，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址在中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021301。本发明的淀粉酶产色链霉菌从采自中国南海西沙群岛东部永兴岛(16°49′53″N，112°20′22"E)附近海域的样品中分离得到。

1试验材料

1.1供试样品

豆荚软珊瑚(Lobophytum sp.)样品，采自中国南海西沙群岛东部永兴岛(16°49′53″N， 112°20′22"E)附近海域。

1.2供试培养基

本实验所用主要培养基包括分离培养基、培养特征观察培养基和生理生化特征观察培养基，见表1、表2和表3。

表1分离培养基的成分(培养基成分)

表2培养特征观察培养基

表3生理生化特征观察培养基

表4发酵培养基及配方

1.3主要试剂

本章试验所用主要试剂见表4。

表5主要生化试剂及来源

1.4实验仪器与设备

本章试验所需主要仪器与设备见表5。

表6仪器和设备

1.5供试病原菌

香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4(ATCC 76255)(Foc TR4)；辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum Simmonds(ATCC 56815)；香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax(ATCC 38579)；黄瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.cucumerinum(ATCC 204378)；芒果炭疽病菌Colletotrichum musae(ATCC 96167)；水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae Cavara(ATCC 62355)；胶孢炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides(Penzig)Penzig et Saccardo(ATCC MYA-456)；小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum Schwabe(ATCC MYA-4620)；苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea(ATCC208828)；香蕉树木溃疡病菌Btoryosphaeria dothidea(ATCC 42212)，保藏于本研究室，用于抗真菌活性筛选及抑菌活性测定。

1.6分析软件

本章研究中使用的数据分析软件见表6。

表7分析软件及网址

2试验方法

2.1软珊瑚共附生放线菌的分离

称取5g新鲜的珊瑚样品，无菌海水冲洗3次，以去除表层附着的细菌，充分研磨。研磨后的匀浆样品，溶于45mL的无菌水中，置于180r/min的摇床上振荡30min，充分混匀得到悬浮液。采用10倍连续稀释法进行稀释，配制成10^-1、10^-2、10^-3的悬浮液，取每个梯度的悬浮液100μL涂布于6种特异性分离培养基(M1-M6)，28℃倒置培养2-4周，每个梯度设置 3个重复，待菌落长出后，挑取形态特征不同的单菌落在YE培养基进行划线纯化，筛选得到菌株1-9。

2.2活性菌株的分类鉴定

2.2.1形态特征扫描电镜观察

菌株1-9采用插片法(Park et al.,2004)进行形态学观察。菌株被接种在高氏1号培养基上，将灭菌的玻片(5mm×5mm)以45°斜插在接有活性菌株的高氏一号培养基上，28℃培养 7-10天。将附着有孢子和菌丝的玻片经过固定、漂洗、脱水、置换、干燥和喷金后，用扫描电镜观察各菌株的菌丝和孢子链等形态特征。

2.2.2培养特征观察

参照《链霉菌鉴定手册》和《放线菌快速鉴定与系统分类》，采用国际公认及规定的七种培养基(Shirling et al.,1966；Williams et al.,1983)进行菌落及培养特征观察。采用平板划线法将菌株分别接种于ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7、PDA和Gause’s no.1培养基上，28℃倒置培养7-15d，观察并记录菌株的培养特征，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素及生长状况。颜色与ISCC COLOR CHARTS色谱进行比对(Kelly,1964)。

2.2.3生理生化特征分析

参照Shirking与Gottlieb(Shirking et al.,1966)的方法对活性菌株进行生理生化特征鉴定。

(1)单一碳源利用实验

在放线菌的生理生化鉴定中，菌株对碳源的利用是一项重要的指标。不同放线菌对碳源的利用情况不同。单一碳源利用实验是将单一的碳源按照1％的浓度加入普戈二氏的基础培养基中，以不加碳源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该碳源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该碳源的能力。碳源包括：蜜二糖、木聚糖、棉子糖、D-葡萄糖、鼠李糖、D-核糖、肌醇、鼠李糖、α-乳糖、纤维二糖、松三糖、D- 果糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、L-苯丙氨酸、可溶性淀粉、水杨苷、蔗糖等

(2)单一氮源利用实验

跟碳源利用类似，不同放线菌对氮源的利用情况也不同。将单一氮源按照0.5％的浓度加入氮源基础培养基中，以不加任何氮源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于 28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该氮源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该氮源的能力。氮源包括：丝氨酸、草氨酸、甘氨酸、精氨酸、缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、羟脯氨酸、苯基丙氨酸等。

(3)酶学特性实验

①淀粉水解实验

采用点接法将待测菌株接种到淀粉琼脂平板上，于28℃培养7～10d，在菌落的周围滴加少量的卢戈氏碘液，若菌株能够产生淀粉酶，会将淀粉水解成糊精或将淀粉利用掉，菌落周围会出现不变色的透明圈，而透明圈的大小表示淀粉酶活性的强弱；若不产生淀粉酶，则菌落周围遇到碘液呈蓝色。

②明胶液化实验

将待测菌株接种于明胶培养基试管中，于28℃下培养，分别在7d、14d、21d、28d周观察菌株生长状况及培养基中明胶液化程度。如果有液化现象，则为阳性，表明该菌株具有液化明胶的能力，反之，则为阴性。

③纤维素分解实验

配制纤维素分解培养基，然后将滤纸条的一段浸入液体培养基中，灭菌后，将菌株接种在培养基中，28℃静置培养，30d后观察滤纸条有无被分解，若分解，则为阳性，说明产生了纤维素分解酶，反之，则为阴性。

④硝酸盐还原

将待测菌株接种到硝酸盐还原液体培养基中，28℃震荡培养7～14d，以不接菌的培养基作为空白对照。将少许的培养液加入试管中，分别加入格里斯氏试剂A和B，若溶液呈现粉红、玫瑰红、棕色或者橙色，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。若无上述颜色出现，再滴加1或2滴二苯胺试剂，溶液呈蓝色，则还原作用为阴性，若不呈蓝色，则按阳性对待。

⑤脲酶实验

配制脲酶培养基，将待测菌株接种到脲酶培养基上，28℃倒置培养4d，观察培养基颜色变化。若培养基变成桃红色，则为阳性，不变色，则为阴性。

⑥脂酶(吐温-20、-40、-80)实验：

配制脂酶培养基，将单独灭菌的吐温-20、-40、-80与培养基混合制板。将菌株接种于平板上，28℃倒置培养7～14d，若菌落周围产生晕圈，则为阳性，反之，则为阴性。

(4)代谢产物实验

①硫化氢产生实验

将待测菌株接种到柴斯纳培养基上，28℃倒置培养7～14d，如产生黑色素，则说明有硫化氢产生，H₂S与柠檬酸铁结合产生FeS，培养基呈现黑色。以未接种的培养基作为对照。

②黑色素产生

将待测菌株接种到黑色素产生培养基上，28℃倒置培养7～28d，观察菌落边缘是否有黑色素生成。

(5)生长特性测定

①盐耐受实验

配制含不同NaCl浓度(w/v)(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％)的YE培养基，将待测菌株接种于培养基上，于28℃倒置培养14d，观察菌株在不同的NaCl浓度上的生长情况，得到菌株生长的NaCl浓度范围，以及最适生长NaCl浓度。

②pH耐受实验

配置YE液体培养基，调节pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，将待测菌株分别接入不同pH值的培养基中，28℃振荡培养14d，观察菌株在不同pH值培养基中的生长情况，得到菌株生长的pH值范围，以及最适生长pH值。

③温度耐受实验

配置YE培养基，将待测菌株接种于培养基平板上，于4℃、14℃、20℃、28℃、37℃、45℃倒置培养7～28d天，观察菌株在不同温度时平板上的生长情况，得到菌株生长的温度范围，以及最适生长温度。

2.2.4分子生物学鉴定

(1)放线菌基因组DNA的提取

采用Bioteke的细菌基因组DNA快速提取试剂盒(DP1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国)进行放线菌总DNA的提取。

(2)16S rRNA的测序和分析

以放线菌基因组DNA为模板，采用通用引物27F(5′-AGAG TTTG ATCC TGGC TCAG-3′) 和1492R(5′-TACG GCTA CCTT GTTA CGAC TT-3′)进行PCR的扩增。PCR的反应体系见表7。PCR扩增的反应条件见表8(Himaman et al.,2016；Sabdono et al.,2019)。

表7 16S rRNA序列PCR反应体系

表8 16S rRNA序列PCR扩增反应条件

②PCR产物的电泳检测：

PCR反应结束后，取5μL的PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上对菌株PCR产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。

③测序及序列比对分析：

将菌株PCR产物进行序列测定。将测得的16S rRNA基因序列与保存在公共数据库GenBank和EzBiocloud服务器(https://www.EzBiocloud.net/identify)(Kim et al.，2012)中已知的16S rRNA序列进行同源性比较。

2.3菌株1-9代谢产物抗真菌活性研究

将菌株1-9接入YE液体培养基中，于28℃、180r/min条件下，振荡培养4d，制成种子液备用。按5％的接种量，将种子液接入100mL FM1发酵培养基中(250mL三角瓶)，于28℃180r/min振荡培养8d，并按1:1(v/v)比例加入无水乙醇超声萃取1h，米拉布(Mira cloth)过滤，于45℃条件下减压浓缩，制成粗提物浸膏。

为了评估链霉菌活性成分活性，采用琼脂孔扩散法(Ashokvardhan et al.,2016；Sharma et al., 2016)对10种植物病原菌进行广谱抗真菌活性测定。用打孔器取下新鲜的10种植物病原菌的菌饼(Φ＝5mm)，接种于PDA平板中央，分别在距病原菌菌饼2.5cm处的四个点处打孔(Φ＝6 mm)，将过滤除菌后的活性成分(20.0mg/ml)加入孔中，以加入等量的溶剂为空白对照，每个处理重复3次。于28℃培养5-7d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径及抑菌带大小，按照下面的公式计算抑菌率(Albuquerque et al.,2006)：

Inhibition rate(％)＝[(R1-R2)/R1]×100

式中：R1是对照组的病原菌菌落直径，R2是处理组的病原菌菌落直径。

2.4盆栽实验

盆栽实验于2019年8-10月在中国热带农业科学院热带生物科学与生物技术研究所进行。温室条件为28℃，湿度70％，自然光照。从海南省儋州市采集蕉园健康土壤，20目过筛。选取生长一致、3-4片叶子的香蕉幼苗，无菌水冲洗干净，切下第二条主根，种植于装有1400g 土的塑料盆中，每个处理30株。实验设2个处理组：Control(接种Foc TR4-GFP，施无菌水)； Streptomyces sp.1-9(接种Foc TR4-GFP，接种Streptomycesdiastatochromogenes 1-9，1.0×10⁷ cfu/g土)。每个处理三次重复。

Foc TR4-GFP接种：挑取新鲜培养的Foc TR4-GFP菌丝接种于PDA固体培养基上，28℃培养5d。无菌水洗脱孢子，两层无菌Mira布过滤，收集病原菌孢子悬浮液，血球计数板计数后，无菌水稀释，取100毫升孢子悬浮液接入土壤中，使得土壤中Foc TR4-GFP孢子数量为1.0×10⁵cfu/g土。

菌株1-9接种：新鲜培养的菌株1-9种子液按5％接种量，接入FM1液体培养基中，28℃振荡(150rpm)培养7d，稀释平板涂布法计数后，无菌水稀释，取100毫升链霉菌发酵液接入土壤中，使得土壤中菌株1-9数量为1.0×10⁷cfu/g。激光共聚焦显微镜和球茎侧切法观察Foc TR4-GFP侵染过程及菌株1-9的防控效果。

3结果与分析

3.1菌株的分类鉴定

3.1.1形态特征分析

将菌株1-9接种Gause’s no.1培养基，插片培养，于28℃倒置培养7-14d。扫描电镜(SEM) 进行孢子形态和菌丝观察，见图1。菌株1-9在Gause’s no.1培养基上产生黑白色基内菌丝，随着年龄增长呈灰色；形成灰白色气生菌丝，气生菌丝体分化为螺旋状孢子链；产生白色气生孢子团，孢子表面具突刺。

3.1.2培养特征分析

菌株1-9在不同培养基上的培养特征见表3-7。菌株1-9在8种培养基上均能正常生长，且不产生色素，在ISP4、ISP6、ISP7和PDA培养基上生长良好，气生菌丝发达，形成了丰富的基内菌丝，气生菌丝多呈灰色和白色，基内菌丝多为白色。

表9菌株1-9的培养特征

+++，生长良好；++，生长正常；+，生长缓慢。

3.1.3菌株生理生化特性

菌株生理生化特性主要包括生长特性、单一碳氮源利用、酶学活性及代谢产物分析三大部分，试验结果见表10。

(1)生长特性

菌株1-9耐受pH值范围为5.5-9.0，最适生长pH值为7；在NaCl中耐受范围为0-9％，最适生长盐浓度范围为6-7％；可耐受温度范围为15-45℃，最适生长温度为30℃。

(2)单一碳氮源利用

单一碳源利用结果显示，试验中涉及的22种碳源，除D-甘露醇和核糖，其他均可被菌株 1-9利用。表明多种常见糖类和醇类均可作为试菌株生长所需的碳源。单一氮源利用结果显示，供试菌株可利用的氮源较广，15种氮源中均可被利用。

(3)酶学活性及代谢产物分析

试验结果显示，供试菌株具有多种酶学活性。菌株1-9可使明胶液化和硝酸盐还原，可产生酯酶、脲酶和接触酶。

表10菌株1-9的部分生理生化特征

+:结果为阳性；－:结果为阴性。+:Positive reaction；－:negative reaction.

3.1.4分子生物学鉴定

(1)基因组DNA的提取及PCR扩增

本研究提取了菌株1-9的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，基因组DNA的目的条带较清晰，说明基因组DNA的纯度较高，可以用作PCR反应的模板。以基因组DNA为模板，27f/1492r为引物进行16S rRNA PCR扩增，得到了一条约1500bp的条带。

(2)16S rRNA基因序列分析及系统进化关系

供试菌株采用克隆测序方法获得较完整的16S rRNA序列，将序列提交到GenBank数据库，获得登录号，并将16S rRNA序列提交到Ezbiocloud数据库中，与Ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/identify)(Kim et al.,2012)中相关菌株进行同源性比对，选取25株同源性较高的标准菌株，利用MEGA version X软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树 (Kumar,et al.,2019)。

经测序获得菌株1-9 16S rRNA序列全长为1429bp，序列经校对后提交GenBank数据库。在基于Neighbour-Joining算法的进化树中，菌株1-9与Streptomycesdiastatochromogenes在系统发育树中形成一个独立的分支，分支自展值为89％，亲缘关系最近(图2)。结合形态特征、培养特征和生理生化特征结果，初步鉴定菌株1-9为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。

3.2菌株的抗菌活性评价

3.2.1代谢产物活性成分对10种植物病原真菌的抑制率

采用琼脂扩散法测定菌株1-9代谢产物对10种植物病原真菌的广谱抑菌活性。结果如表 11和图3所示，活性成分抑菌率均在70％以上，对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)抑菌活性最好，抑菌率达到90.37％，对Foc TR4病菌的抑菌率为79.81％，而对苹果轮纹病菌(ATCC 208828) 的抑菌活性最小，抑菌率为71.67％。

表11菌株1-9对10种病原真菌的抑制效果

Table 11Inhibition of strain 1-9against plant pathogenic fungalstrains

表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05 水平差异显著。Data in the table are mean±SD.Different lowercaseletters in the same column show the significantly different at P＜0.05levelby Duncan’s new multiple range test.

3.3盆栽试验验证菌株1-9对香蕉枯萎病的防控效果

如图4和图5所示，用Foc TR4-GFP接种伤根后的巴西蕉，激光共聚焦显微镜和球茎侧切观察其侵染过程，进一步验证菌株1-9对香蕉枯萎病的防控效果。在对照组，第1d，孢子从根表皮进入球茎边缘；第7d，孢子进入球茎中心，开始萌发；第14d，菌丝弥漫整个球茎；第21d，菌丝沿维管束向上运动至假茎。菌株1-9处理组，第1d，孢子附着在根表皮；第7d，孢子进入球茎边缘；第14d，孢子进入球茎中心，开始萌发；第21d，球茎中心的孢子和菌丝显著减少。结果显示，接种菌株1-9对于香蕉枯萎病具有明显的抑制效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种链霉菌，其特征在于，其为淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1-9，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021301。

2.权利要求1所述的淀粉酶产色链霉菌的发酵液的过滤液、或发酵液的乙醇提取物。

3.如权利要求1所述的淀粉酶产色链霉菌、或者权利要求2所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在拮抗香蕉枯萎病菌4号小种F.oxysporum Race 4、和/或辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum、和/或香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax、和/或黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum(Schl.)F.sp cucumerinum Owen、和/或芒果炭疽病菌Colletotrichum acutatum、和/或水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cav、和/或胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、和/或小麦赤霉病菌FusaHum graminearum Sehw、和/或苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea、和/或香蕉树木溃疡病菌Btoryosphaeriadothidea中的应用。

4.如权利要求1所述的链霉菌、或者权利要求2所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在制备防治香蕉枯萎病菌4号小种F.oxysporum Race 4、和/或辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum、和/或香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax、和/或黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum(Schl.)F.sp cucumerinum Owen、和/或芒果炭疽病菌Colletotrichum acutatum、和/或水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cav、和/或胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、和/或小麦赤霉病菌FusaHum graminearum Sehw、和/或苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea、和/或香蕉树木溃疡病菌Btoryosphaeriadothidea中的应用所致病害的生防制剂中的应用。

5.一种生防菌制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的淀粉酶产色链霉菌，或者含有权利要求4所述的淀粉酶产色链霉菌的发酵液、或发酵液的过滤液、或发酵液的乙醇提取物。