CN115627248A

CN115627248A - 一种广谱抗真菌新种链霉菌及其菌剂与制备方法和应用

Info

Publication number: CN115627248A
Application number: CN202211647791.8A
Authority: CN
Inventors: 陈宇丰; 王尉; 谢江辉; 魏永赞; 周登博; 冯筠庭; 赵炎坤; 李凯; 起登凤; 张妙宜
Original assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-01-20
Anticipated expiration: 2042-12-21
Also published as: CN115627248B

Abstract

本发明提供了一种链霉菌，其为链霉菌属的一个新种，命名为临高链霉菌1‑7（Streptomyces lingaoensis sp.nov.1‑7），于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021300。该菌株具有稳定广谱抑菌活性，其进行发酵培养后，制成生防菌剂，对香蕉枯萎病菌4号生理小种、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌等具有良好的拮抗作用，为枯萎病等多种植物病害的防治拓展新领域，而且还能促进植物生长，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。

Description

一种广谱抗真菌新种链霉菌及其菌剂与制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种广谱抗真菌新种链霉菌及其菌剂与制备方法和应用。

背景技术

香蕉（Musa spp.）是世界上重要的热带和亚热带水果，因其生长迅速，营养成分丰富，经济价值高，在世界上具有非常重要的地位（Dong et al., 2015），它是热带和亚热带地区最重要的水果作物之一，具有重要的经济价值，然而，香蕉的生产受到枯萎病的严重威胁。

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense，Foc）引起的一种会直接造成香蕉死亡的毁灭性的真菌性病害，具有很强的真菌致病性（Bubici etal.，2019）。香蕉枯萎病菌穿透根部，随后菌丝侵入木质部导管和球茎组织，导致水分吸收不良，最终导致叶片萎蔫。根据病原菌对不同香蕉品种的侵染能力，将其分为4个致病小种，即Foc TR1、Foc TR2、Foc TR3和Foc TR4（Aguayo et al., 2020），而4号致病小种（FocTR4）对香蕉的危害最大，可感染全球80%以上的香蕉和大蕉作物，导致整株植物枯萎死亡（Dita et al., 2018）。香蕉枯萎病作为典型的土传病害，一旦侵染土壤，在短时间内会很难清除，其传播速度快且传播途径多种多样，如患病土壤、带病蕉苗和不规范使用耕作用具都会加快病原菌的扩散，一旦蔓延会造成极大的经济损失。

生物防治是一种通过利用拮抗微生物抑制病菌侵染的防治策施，已被认为是一种很有前景的植物病害控制方法，不仅可以减少合成杀菌剂的使用，还能降低对环境的影响。拮抗微生物通过分泌脂肽、抗生素和其他抗真菌代谢产物，直接抑制植物病原体。

许多研究报道了生防菌，包括链霉菌（Wei et al., 2020），芽孢杆菌（Khan etal., 2018；Xue et al., 2015）、假单胞菌（Kavino and Manoranjitham, 2017）、木霉（Suksaard et al., 2016）和非致病性尖孢镰刀菌（Alijani et., 2019）可防治枯萎病。链霉菌是重要的生物防治资源，它们具有生物活性次生代谢产物，这些抗菌化合物在保护植物抵御病原菌方面发挥着重要作用（Ueno et al., 2016）。利用生防链霉菌来抑制枯萎病的发病的取得了一定的研究成果。Wei et al.（2020）研究发现链霉菌YYS-7能明显抑制Foc 4的菌丝生长，同时，盆栽试验结果也表明，链霉菌YYS-7发酵液显著降低了Foc 4的病害指数，促进了香蕉幼苗的生长；Chen et al.（2018a）从香蕉园土壤中分离到Streptomyces sp. CB-75，对香蕉苗的防治效果达到83.12%。一些芽孢杆菌菌株被认为是防治真菌病原体的优秀生防剂，如黄建凤等（2017）研究表明芽孢杆菌菌株H-2和H-7对香蕉枯萎病均具有显著地抑制作用，防效分别为59%和53%；Xue et al.（2015）从抑病型土壤中筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefens）NJN-6，试验表明菌株NJN-6可以作为一种潜在的生防剂，在香蕉病害管理中发挥重要作用；Khan et al.（2018）研究了枯草芽孢杆菌（B. subtilis）30VD−1对香蕉枯萎病菌的抑菌机理。结果表明，菌株30VD-1对植物病原性镰刀菌Foc4的拮抗作用主要通过产生几丁质酶、挥发物和其他抗真菌分子来实现。

由于对香蕉枯萎病防治的研究起步较晚，所以研究还不够深入，同时，由于现有的生防菌资源库有限，并且有一些生防菌防控效果不稳定，它们在实际应用过程中经常发生突变和退化（Bagy et al. 2019）。因此，需要不断增加新的高效生防菌株。同时，从防治措施的安全性考虑，生物防控已成为近年来的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种链霉菌，其为链霉菌新种，命名为临高链霉菌1-7（Streptomyces lingaoensis sp. nov.1-7），具有广谱抑菌活性，对多种病菌具有良好的拮抗作用，并制备成微生物菌剂，具有广阔的发展空间和应用前景。

本发明的第一个方面是提供一种链霉菌，其特征在于，其为链霉菌属的一个新种，命名为临高链霉菌1-7（Streptomyces lingaoensis sp. nov.1-7）（下文简称“链霉菌1-7”或“菌株1-7”），于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021300，地址在中国武汉。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的链霉菌的发酵液，或发酵液的滤液，或发酵液的乙醇提取物。

所述乙醇提取物为所述发酵液加入适量无水乙醇超声萃取后，米拉布（Miracloth）过滤，减压浓缩制成而成的粗提物浸膏。

本发明的第三个方面是提供一种链霉菌菌剂，其为本发明第一个方面所述的链霉菌接种到糖蜜营养液中发酵得到的发酵液或所述发酵液的滤液。

本发明的第四个方面是提供本发明的第三个方面述的链霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将糖蜜加入到无菌水中，配置成糖蜜营养液；（2）将活化好的本发明第一个方面所述的链霉菌接种到糖蜜营养液中，发酵，既得。

优选地，所述制备方法还包括步骤（3）：过滤发酵液。

其中，所述糖蜜营养液中糖蜜的浓度，本发明根据糖蜜的含碳量进行适当调整，本发明对此不作特别限定，比如可以为5-30g/L。在本发明的一个具体实施方式中，所述糖蜜营养液中糖蜜的浓度为15 g/L。

本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的链霉菌，或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者本发明第三个方面所述的链霉菌菌剂在拮抗香蕉枯萎病菌4号小种，和/或黄瓜枯萎病菌，和/或辣椒炭疽病菌，和/或灰葡萄孢霉病菌，和/或香蕉长形斑病菌，和/或小麦赤霉病菌，和/或胶孢炭疽病菌，和/或草莓炭疽病菌中的应用。

本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的链霉菌，或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者本发明第三个方面所述的链霉菌菌剂在在制备防治香蕉枯萎病菌4号小种，和/或黄瓜枯萎病菌，和/或辣椒炭疽病菌，和/或灰葡萄孢霉病菌，和/或香蕉长形斑病菌，和/或小麦赤霉病菌，和/或胶孢炭疽病菌，和/或草莓炭疽病菌所致病害的生防制剂中的应用。

本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌，或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者本发明第三个方面所述的链霉菌菌剂在促进植物生长中的应用。

在本发明一个具体的实施方式中所述植物为香蕉。在土壤中接入本发明的链霉菌49天后，香蕉叶绿素含量上升、茎粗增加、叶面积增大、叶片厚度增加、株高显著提高、生物量也显著增加。

因此，本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌，或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者本发明第三个方面所述的链霉菌菌剂在提高植物叶绿素含量，和/或增加植物茎粗，和/或增大植物叶面积，和/或增加植物叶片厚度，和/或提高植物株高，和/或增加植物生物量中的应用。

本发明的链霉菌1-7为链霉菌属的一个新种，具有稳定广谱抑菌活性，其进行发酵培养后，制成生防菌剂，对香蕉枯萎病菌4号生理小种、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌等具有良好的拮抗作用，为枯萎病等多种植物病害的防治拓展新领域，而且还能促进植物生长，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株1-7在高氏1号培养基上培养14天后扫描电镜观察结果，标尺为2μm。

图2为菌株1-7的生理生化特征鉴定结果，图中a为解淀粉酶试验的试验结果；b为脲酶试验的试验结果。

图3为基于16S rRNA邻接法构建系统发育树。

图4链霉菌1-7基因组圈图

图5为链霉菌1-7发酵粗提物对尖孢镰刀菌4号小种的抑制作用鉴定结果。

图6为链霉菌1-7发酵粗提物对尖孢镰刀菌4号小种菌丝体的影响。

图7为链霉菌1-7发酵粗提物对尖孢镰刀菌4号小种分生孢子的影响。

图8为链霉菌1-7发酵粗提物对尖孢镰刀菌4号小种细胞超微结构的影响。

图9为链霉菌1-7菌剂的制备。

图10为链霉菌菌剂对8种植物病原真菌的抑菌活性。

图11为链霉菌菌剂的滤液对植物病原真菌的抑菌活性鉴定结果。

图12为用带荧光的Foc TR4检测香蕉早期感染过程的结果，在接种后第7 d，对照组和处理组中均观察到GFP-Foc TR4的菌丝和孢子粘附在根表皮细胞上；在第14 d至21 d，对照组的GFP-Foc TR4菌丝沿根维管束延伸至球茎，并在球茎中产生大量菌丝和孢子，而处理组中，只观察到少量的GFP-Foc TR4菌丝在茎的组织腔内。

图13为链霉菌菌剂对香蕉枯萎病的防治效果。（A）香蕉枯萎病的症状在球茎的纵向平分。标尺=5 mm。（B）对照、处理组和空白组在接种49 d后香蕉幼苗的黄化症状。（C）对照、处理组和空白组在接种49 d后疾病指标的统计分析。

图14为不同土壤样品中Foc TR4病原菌数量。

图15为菌株1-7菌剂对香蕉苗生长特性的影响结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种链霉菌，其为链霉菌属的一个新种，命名为临高链霉菌1-7（Streptomyces lingaoensis sp. nov.1-7），于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021300，保藏地址在中国武汉的武汉大学。本发明的链霉菌从采自中国海南临高（109◦51′ 17′′E，9◦47′1′′N）香蕉根际土壤样品中分离得到。

试验材料

1.1供试样品

香蕉根际土壤样品，采自海南临高香蕉根际土壤（109◦51′ 17′′E，9◦47′1′′N）。

1.2供试培养基

本章实验所用主要培养基包括分离培养基、培养特征观察培养基和生理生化特征观察培养基，见表1、表2和表3。

表1 分离培养基的成分

表2 培养特征观察培养基

表3 生理生化特征观察培养基

1.3主要试剂

本章试验所用主要试剂见表4。

表4主要生化试剂及来源

1.4 实验仪器与设备

本章试验所需主要仪器与设备见表5。

表5仪器和设备

1.5 供试病原菌

香蕉枯萎病菌4号生理小种 F. oxysporum f. sp. cubense Race 4 (ATCC76255) (Foc TR4)；辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum Simmonds (ATCC 56815)；香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax (ATCC 38579)；黄瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp.cucumerinum (ATCC 204378)；胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides (Penzig)Penzig et Saccardo (ATCC MYA-456)；小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe(ATCC MYA-4620)；草莓炭疽病菌Colletotrichum fragariae Brooks (ATCC 58718)；灰葡萄孢霉病菌Botrytis cinerea Persoon (ATCC 11542)。

1.6 分析软件

本章研究中使用的数据分析软件见表6。

表6分析软件及网址

2 试验方法与结果

2.1根际土壤放线菌的分离

称取5 g新鲜的土壤样品，加入45 mL的无菌水中，置于180 r/min的摇床上振荡30min，充分混匀得到悬浮液。采用10倍连续稀释法进行稀释，配制成10^-1、10^-2、10^-3的悬浮液，取每个梯度的悬浮液100 μL涂布于6种特异性分离培养基，28 °C倒置培养2-4周，每个梯度设置3个重复，待菌落长出后，挑取形态特征不同的单菌落在YE培养基进行划线纯化。筛选到1株代谢产物活性最好的菌株1-7。

活性菌株的表型特征分析

2.2.1 形态特征扫描电镜观察

菌株采用插片法（Park et al., 2004）进行形态学观察。活性菌株被接种在高氏一号培养基上，将灭菌的玻片（5mm×5mm）以45º斜插在接有活性菌株的高氏一号培养基上，28 ℃培养7-10天。将附着有孢子和菌丝的玻片经过固定、漂洗、脱水、置换、干燥和喷金后，用扫描电镜观察各菌株的菌丝和孢子链等形态特征。结果见图1，菌株1-7在Gause’s no. 1培养基上产生浅黄色基内菌丝，随着年龄增长颜色加深；形成灰白色气生菌丝，气生菌丝分化为螺旋状孢子链；产生灰黑色气生孢子团，孢子具皱纹状纹饰。

2.2.2培养特征观察

参照《链霉菌鉴定手册》和《放线菌快速鉴定与系统分类》，采用国际公认及规定的七种培养基（Shirling et al., 1966; Williams et al., 1983）进行菌落及培养特征观察。采用平板划线法将菌株分别接种于ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7、PDA和Gause’sno. 1培养基上，28℃倒置培养7-15d，观察并记录菌株的培养特征，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素及生长状况。颜色与ISCC COLOR CHARTS色谱进行比对(Kelly, 1964)。

链霉菌在不同培养基上的培养特征见表7。菌株1-7在8种培养基上也能正常生长，且不产生色素，在ISP2、ISP4、ISP7和Gause’s no. 1培养基上生长良好，气生菌丝较发达，呈灰色和白色，基内菌丝丰富多样，颜色由白到淡黄，再到亮黄。

表7 菌株1-7的培养特征

+ + +：生长良好；++：正常生长； +：生长不良。

2.2.3 生理生化特征分析

参照Shirking与Gottlieb（Shirking et al., 1966）的方法对活性菌株进行生理生化特征鉴定。

（1）单一碳源利用实验

在放线菌的生理生化鉴定中，菌株对碳源的利用是一项重要的指标。不同放线菌对碳源的利用情况不同。单一碳源利用实验是将单一的碳源按照1%的浓度加入普戈二氏的基础培养基中，以不加碳源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该碳源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该碳源的能力。结果见表8，试验中涉及的19种碳源均可被菌株1-7利用。

（2）单一氮源利用实验

跟碳源利用类似，不同放线菌对氮源的利用情况也不同。将单一氮源按照0.5%的浓度加入氮源基础培养基中，以不加任何氮源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该氮源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该氮源的能力。结果见表8，供试菌株可利用的氮源较广，18种氮源中，菌株1-7可以利用L-丝氨酸、L-苯基丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、L-羟基脯氨酸、L-半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸、氯化铵、L-天门冬酰胺、酪氨酸、蛋氨酸、色氨酸。

（3）酶学特性实验

① 淀粉水解实验：采用点接法将待测菌株接种到淀粉琼脂平板上，于28℃培养7～10d，在菌落的周围滴加少量的卢戈氏碘液，若菌株能够产生淀粉酶，会将淀粉水解成糊精或将淀粉利用掉，菌落周围会出现不变色的透明圈，而透明圈的大小表示淀粉酶活性的强弱；若不产生淀粉酶，则菌落周围遇到碘液呈蓝色。② 明胶液化实验：将待测菌株接种于明胶培养基试管中，于28℃下培养，分别在7d、14d、21d、28d周观察菌株生长状况及培养基中明胶液化程度，如果有液化现象，则为阳性，表明该菌株具有液化明胶的能力，反之，则为阴性。③ 纤维素分解实验：配制纤维素分解培养基，然后将滤纸条的一段浸入液体培养基中，灭菌后，将菌株接种在培养基中，28℃静置培养，30d后观察滤纸条有无被分解，若分解，则为阳性，说明产生了纤维素分解酶，反之，则为阴性。④ 硝酸盐还原：将待测菌株接种到硝酸盐还原液体培养基中，28℃震荡培养7～14d，以不接菌的培养基作为空白对照。将少许的培养液加入试管中，分别加入格里斯氏试剂A和B，若溶液呈现粉红、玫瑰红、棕色或者橙色，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。若无上述颜色出现，再滴加1或2滴二苯胺试剂，溶液呈蓝色，则还原作用为阴性，若不呈蓝色，则按阳性对待。⑤ 脲酶实验：配制脲酶培养基，将待测菌株接种到脲酶培养基上，28 ℃倒置培养4d，观察培养基颜色变化。若培养基变成桃红色，则为阳性，不变色，则为阴性。⑥ 脂酶（吐温-20、-40、-80）实验：配制脂酶培养基，将单独灭菌的吐温-20、-40、-80与培养基混合制板，将菌株接种于平板上，28 ℃倒置培养7～14d，若菌落周围产生晕圈，则为阳性，反之，则为阴性。

结果显示，菌株1-7具有多种酶学活性，可使明胶液化和硝酸盐还原，可产生过氧化氢酶、淀粉酶、酯酶和脲酶。

（4）代谢产物实验

① 硫化氢产生实验：将待测菌株接种到柴斯纳培养基上，28℃倒置培养7～14d，如产生黑色素，则说明有硫化氢产生，H₂S与柠檬酸铁结合产生FeS，培养基呈现黑色。以未接种的培养基作为对照。② 黑色素产生：将待测菌株接种到黑色素产生培养基上，28℃倒置培养7～28d，观察菌落边缘是否有黑色素生成。

结果显示，菌株1-7能产生H₂S，但不能产生MR和VP试验均为阴性。

（5）生长特性测定

① 盐耐受实验：配制含不同NaCl浓度（w/v）（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%）的YE培养基，将待测菌株接种于培养基上，于28℃倒置培养14d，观察菌株在不同的NaCl浓度上的生长情况，得到菌株生长的NaCl浓度范围，以及最适生长NaCl浓度。② pH耐受实验：配置YE液体培养基，调节pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，将待测菌株分别接入不同pH值的培养基中，28 ℃振荡培养14d，观察菌株在不同pH值培养基中的生长情况，得到菌株生长的pH值范围，以及最适生长pH值。③ 温度耐受实验：配置YE培养基，将待测菌株接种于培养基平板上，于4℃、14℃、20℃、28℃、37℃、45℃倒置培养7～28d天，观察菌株在不同温度时平板上的生长情况，得到菌株生长的温度范围，以及最适生长温度。

结果显示，菌株1-7耐受pH值范围为5-10，最适生长pH值为6；在NaCl中耐受范围为0-7%，最适生长盐浓度范围为5-6%；可耐受温度范围为15-45℃，最适生长温度为30℃。

（6）抗生素敏感性实验

采用药敏纸片法测定菌株对抗生素的敏感性。将菌液均匀地涂布在ISP2平板上，同时以无菌镊子取药敏试纸片贴到培养基表面，28℃培养7天后观察抑菌圈。本实验选用30种抗生素: 克林霉素（2μg/片）、氯霉素（30μg/片）、呋喃唑酮（300μg/片）、复方新诺明（1.5μg/片）、多粘菌素B（300IU片）、万古霉素（30μg/片）、环丙沙星(悉复欢)（5μg/片）、氧氟沙星(泰利必妥)（50μg/片）、诺氟沙星(氟哌酸)（10μg/片）、青霉素（10U/片）、红霉素（15μg/片）、米诺环素（30μg/片）、多西环素（30μg/片）、四环素（30μg/片）、新霉素（30μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、庆大霉素（10μg/片）、阿米卡星(丁胺卡那霉素)（30μg/片）、头孢哌酮(先锋必)（75μg/片）、头孢曲松（30μg/片）、头孢他啶（30μg/片）、头孢呋辛（30μg/片）、头孢拉定（30μg/片）、头孢唑啉（30μg/片）、头孢氨苄（30μg/片）、麦迪霉素（30μg/片）、羧苄西林（100μg/片）、氨苄西林利（10μg/片）、苯唑西林（1μg/片）、哌拉西林(氧哌嗪青霉素)（100μg/片），纸片直径6mm。结果以无抑菌圈为不敏；10mm以下为低敏；10-14mm为中敏；15mm以上为高敏。

结果显示，菌株1-7对克林霉素、氯霉素、多西环素、新霉素、诺氟沙星(氟哌酸)、庆大霉素、头孢他啶、头孢拉定、头孢唑啉、麦迪霉素、苯唑西林、哌拉西林(氧哌嗪青霉素)表现出较强的抗药性。对万古霉素、环丙沙星（悉复欢）、氧氟沙星（泰利必妥）、米诺环素、卡那霉素、庆大霉素和阿米卡星(丁胺卡那霉素) 表现为高敏，对多粘菌素B和头孢曲松表现为中敏。

表8 菌株1-7的生理生化特征

+: 结果为阳性; －: 结果为阴性

表9 试验菌株对部分抗生素的药敏试验结果

注：“S”表示敏感性；“R”表示抗药性。

分子生物学鉴定

（1）放线菌基因组DNA的提取

采用Bioteke的细菌基因组DNA快速提取试剂盒（DP1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国）进行放线菌总DNA的提取。琼脂糖凝胶电泳结果显示，基因组 DNA 的目的条带较清晰，说明基因组 DNA 的纯度较高，可以用作PCR反应的模板。

（2）16S rRNA的测序和分析

以放线菌基因组DNA为模板，采用通用引物27F（5ʹ-AGAG TTTG ATCC TGGC TCAG-3ʹ）和1492R（5ʹ-TACG GCTA CCTT GTTA CGAC TT-3ʹ）进行PCR的扩增。PCR的反应体系见表10，PCR扩增的反应条件见表11（Himaman et al., 2016; Sabdono et al., 2019）。

表10 16S rRNA序列PCR反应体系

表11 16S rRNA序列PCR扩增反应条件

② PCR产物的电泳检测：

PCR反应结束后，取5 μL的PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上对菌株PCR产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。得到了一条约1500 bp的条带。

③ 测序及序列比对分析：

将菌株PCR产物进行序列测定。将测得的16S rRNA基因序列与保存在公共数据库GenBank和EzBiocloud服务器（https://www.EzBiocloud.net/identify）（Kim et al.，2012）中已知的16S rRNA序列进行同源性比较，选取25株同源性较高的标准菌株，利用MEGAversion X软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树(Kumar, et al., 2019)。

结果见图3，菌株1-7确定为链霉菌属（Streptomyces），与标准菌株Streptomyces albospinus NBRC 13846 (AB184527)显示最高的同源性，分别为98.8%，且在系统发育树中形成一个独立、稳定的大分支，分支自展值为64%，亲缘关系最近，结合形态特征、培养特征和生理生化特征结果，可以初步判断菌株1-7为Streptomyces属新种。

基因组测序及多相分类鉴定

由北京BioMarker生物科技有限公司在Hiseq X平台上，采用配对末端测序法，在覆盖深度为100x（Illumina，San Diego，CA，USA）处对菌株1-7进行全基因组测序。对每个基因组原始数据进行过滤， Reads过滤后，高质量的成对Reads被组装，基因组组装后，供试菌株Scaffold数据与标准菌株Scaffold数据使用ANI计算平台（https:// www.ezbiocloud.net/tools/ANI）计算平均核苷酸一致性(ANI) ( Yoon et al., 2017)，标准菌株基因组数据从EzBioCloud公共基因组数据库

下载。

菌株1-7经过二代和三代测序及组装，共获得一条10373146bp 的基因序列，基因组N50长度为39347 bp，序列大小与已提交的链霉菌属测序结果基本吻合。基因组组装后，基因组G+C含量为71.72%，与同属菌株相近，属于高G+C含量放线菌。基因圈图见图4。

从EzBioCloud

公共基因组数据库下载最高同源性标准菌株Streptomyces albospinus NBRC 13846 (AB184527)的基因组数据，提交至ANI计算平台（https://www.ezbiocloud.net/tools/ANI）计算平均核苷酸一致性(ANI)，结果显示，菌株1-7的（G+C）mol%含量为71.72%，Streptomyces albospinus NBRC 13846 (AB184527)的（G+C）mol%含量为70.89%（表12）。菌株1-7与标准菌株Streptomyces albospinus NBRC 13846 (AB184527)比对的ANI值为86.68（≤95%）（表 13）。基于上述鉴定分析，可以确定菌株1-7是一个Streptomyces属新种，命名为Streptomyces lingaoensis sp. nov. 1-7（临高链霉菌）。

表12菌株1-7的基因组和（G+C）mol%含量数据

表13 ANI比对结果

22.5 抗真菌活性研究

（1）菌株的抑菌活性

采用平板对峙培养法（Sadeghian et al., 2016; Sharma et al., 2016）进行拮抗菌的筛选。配制PDA培养基平板，用打孔器取下培养5d、长势良好的Foc TR4病原菌菌饼(Φ=5 mm)，置于PDA平板中央，以平板中央为中心画“十”，在 “十”字4条边上距中心2.5 cm处，接种供试菌株，以只接种Foc TR4病原菌作为对照，28℃倒置培养5-7 d后，测量真菌菌丝体边缘与放线菌之间的距离，记为抑菌带，通过抑菌带的大小进行拮抗菌的筛选。结果显示，菌株1-7对Foc TR4病原菌具有明显的抑菌活性，抑菌圈超过20 mm，标记为4级活性菌株。

采用黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌进行同样的抑菌试验，结果显示，链霉菌1-7对黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌也具有明显的抑菌活性。

（2）菌株代谢产物活性研究

将初筛中抑菌活性较好的菌株，接入YE液体培养基中，于28 ℃、180 r/min条件下，振荡培养4 d，制成种子液备用。按5%的接种量，将种子液接入100 mL FM2发酵培养基中(250 mL三角瓶)，于28℃ 180 r/min振荡培养8d，并按1:1（v/v）比例加入无水乙醇超声萃取1h，米拉布（Mira cloth）过滤，于45℃条件下减压浓缩，制成粗提物浸膏。

采用TLC-生物自显影法(TLC-bioautography) (Sun et al., 2018) 测定放线菌粗提物对病原菌Foc TR4的抑菌活性。配置PDA培养基，接入Foc TR4，于24℃下培养7-10d，加入10 mL无菌水洗脱孢子，制备分生孢子悬浮液，加入适量PDB液体培养基，配成浓度为3.0×10⁵孢子/mL的孢子悬浮混合液。粗提物溶解在甲醇中配制成20mg/mL的浓度，使用标定的毛细管在TLC板上点4μL和8μL的样品，在TLC板上均匀喷洒（Foc TR4）孢子悬浮液（3.0×10⁵孢子/mL）三次，将TLC板置于湿润的盒子里，于25℃培养箱中12h光照，12h黑暗，昼夜交换培养4d，当TLC板上出现空白区，表明真菌生长受抑制，该粗提物中含有抗真菌成分，并记录抑菌圈直径。结果如图5所示，链霉菌1-7的粗提物对Foc TR4病原菌有明显的抑菌活性，抑菌圈大小25.97mm。

采用黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌进行同样的抑菌试验，结果显示，链霉菌1-7的粗提物对黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌也具有明显的抑菌作用。

抗真菌机制研究

（1）扫描电镜观察Foc TR4病原菌菌丝体变化

用打孔器在靶标病原菌Foc TR4菌落边缘取 0.5 cm 菌饼接入含活性成分平板中央。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5%（w/v）戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。

结果如图6所示，粗提物对Foc TR4菌丝微观结构上有较大的影响，在放大倍数为2000 倍时，对照组（A）菌丝体较长且互相交错生长，健康饱满，菌丝表面光滑平整，处理组（B）菌丝体变形，表面粗糙，扭曲和凹陷，局部发生不规则缢缩等现象。

（2）扫描电镜观察Foc TR4病原菌分生孢子变化

制备Foc TR4孢子悬浮液(1×10⁶ CFU/mL)，取5µL孢子悬浮液置于载玻片，用5µLEC₅₀浓度的活性成分处理，用无菌水处理作为对照，培养24h。载玻片用2.5%戊二醛4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。

结果如图7所示，粗提物对Foc TR4分生孢子微观结构上有较大的影响，在放大倍数为 3000倍时，对照组（A）病原菌孢子健康饱满，表面平整光滑，处理组（B）病原菌孢子凹陷、褶皱、粗糙、不平整，处理组（C、D ）病原菌孢子肿大，断裂的现象。

（3）透射电镜观察Foc TR4病原菌细胞超微结构的变化

用打孔器在靶标菌菌落边缘取 0.5 cm 菌饼接入含活性成分平板的正中心。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5%（w/v）戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，再将样品浸入环氧丙烷置换2次，每次20 min。将样品在环氧丙烷：环氧树脂（1:1）溶液中浸泡1h进行包埋后，用钻石刀将包埋物切成70 nm 超薄切片。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色 30 min，用透射电子显微镜进行观察（Phillips et al.,2003）。

结果如图8 所示，未经粗提物处理的Foc TR4菌丝细胞壁完整，细胞器形态正常，细胞质均匀（图8A）。经粗提物处理后的病原菌菌丝（图8B-8F），发现处理的病原菌细胞壁明显变薄，细胞壁表面变粗糙，观察结果：线粒体明显发生肿胀，数量变多（图 8B 和 8C），病原菌的大多数细胞器消失，细胞组织溶解（图 8D、8E 和 8F）。

链霉菌菌剂的制备

制备原料：糖蜜、临高链霉菌1-7。

菌剂制备方法：① 本专利依据糖蜜的含碳量，取糖蜜15.0g，加入无菌水1000mL，配制成营养液，装入5L的三角瓶中，121℃灭菌30分钟备用。② 配置YE液体培养基，分装在250mL三角瓶中，于121℃灭菌20分钟，待冷却后接入新鲜的供试菌种，在28～30℃条件下，180rpm/min摇床培养3天后，取活化后的链霉菌1-7，按2%的接菌量接入灭菌好的营养液中，于28～30℃，180rpm/min摇床条件下，发酵培养7d，制成链霉菌菌剂，如图9所示。

链霉菌菌剂广谱抗真菌活性研究

（1）链霉菌菌剂对8种植物病原真菌的抑制作用

为了评估链霉菌菌剂的抗真菌活性，采用点接平板对峙法（Sharma et al.,2016）对8种植物病原菌进行广谱抗真菌活性测定。用打孔器取下新鲜的8种植物病原菌的菌饼(Φ=5 mm)，接种于PDA平板中央，分别在距病原菌菌饼2.5 cm处的四个点处接入10μL链霉菌菌剂，以等量的无菌培养液为空白对照，每个处理重复3次。于28℃培养5-7 d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径及抑菌带大小，按照下面的公式计算抑菌率（Albuquerque et al., 2006）：

式中：R1是对照组的病原菌菌落直径，R2是处理组的病原菌菌落直径。

链霉菌菌剂对8种植物病原真菌的广谱抗菌活性，如图10和表14所示。

表14链霉菌菌剂对8种植物病原真菌的抑菌活性

（2）链霉菌菌剂的滤液对8种植物病原真菌的抑制作用

为了评估链霉菌菌剂的抗真菌活性，采用琼脂孔扩散法（Ashokvardhan et al.,2016; Sharma et al., 2016）对8种植物病原菌进行广谱抗真菌活性测定。用打孔器取下新鲜的8种植物病原菌的菌饼(Φ=5 mm)，接种于PDA平板中央，分别在距病原菌菌饼2.5 cm处的四个点处打孔(Φ=6 mm)，将过滤后的链霉菌菌剂的滤液加入孔中，以加入等量的无菌培养液为空白对照，每个处理重复3次。于28℃培养5-7 d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径及抑菌带大小，按照下面的公式计算抑菌率（Albuquerque et al.,2006）：

链霉菌菌剂的滤液对8种植物病原真菌的广谱抗菌活性，如图11和表15所示。抑菌率都在78%以上，对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)、小麦赤霉病病菌(ATCC MYA-4620)和草莓炭疽病菌(ATCC 58718)的抑菌活性最好，三者无显著性差异，抑菌率分别为89.93%、88.56%和87.99%（P＜0.05）；对胶孢炭疽病菌(ATCC MYA-456)和香蕉枯萎病菌4号小种 (ATCC76255)的抑菌活性次之，抑菌率分别为87.25%和87.22%，而对黄瓜枯萎病 (ATCC 204378)的抑菌活性最小，抑菌率为78.76%。

表15 链霉菌菌剂的滤液对植物病原真菌的抑菌活性

表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。

（3）链霉菌菌剂对8种植物病原真菌孢子萌发的抑制作用

采用Tzortzakis et al (2007)的方法测定孢子萌发率。取8种病原真菌孢子悬浮液（10⁶ CFU/mL）0.1 mL，加入0.1 mL 链霉菌菌剂，充分混匀，取20 µL加在凹玻片上，将含有孢子的载玻片于28 °C潮湿的培养室内孵育6~8h，无菌水和孢子的混合物作为对照，每个处理重复3次。待对照孢子萌发率大于90%以上时，在电子显微镜(mag=200× lens)下观察孢子萌发，孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。每个处理计数 200个孢子，用血球计数器测定孢子萌发数，并计算孢子萌发率（PSG）（Sharma et al., 2017）：

式中：A为对照组孢子萌发率，B为处理组孢子萌发率。

结果见表16。结果表明，链霉菌菌剂对8种植物病原菌分生孢子的萌发具有显著的抑制作用（P＜0.05）。其中对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)分生孢子萌发抑制率最高，为82.95%，而对黄瓜枯萎病 (ATCC 204378)分生孢子萌发抑制率最小，为73.09%。

表16 链霉菌菌剂对植物病原真菌孢子萌发的影响

盆栽实验

盆栽实验于2021年4-6月在中国热带农业科学院热带生物科学与生物技术研究所进行。温室条件为28℃，湿度70%，自然光照。从海南省儋州市采集蕉园健康土壤，20目过筛。选取生长一致、3-4片叶子的香蕉幼苗，无菌水冲洗干净，切下第二条主根，种植于装有1400g土的塑料盆中，每个处理30株。实验设3个处理组：空白（未接种Foc TR4-GFP，施无菌水）；对照（接种Foc TR4-GFP，施无菌水）；处理（接种Foc TR4-GFP，接种菌株1-7菌剂，1.0×10⁷cfu/g土）。每个处理三次重复。

Foc TR4-GFP接种：挑取新鲜培养的Foc TR4-GFP菌丝接种于 PDA 固体培养基上，28℃培养5 d。无菌水洗脱孢子，两层无菌Mira布过滤，收集病原菌孢子悬浮液，血球计数板计数后，无菌水稀释，取100毫升孢子悬浮液接入土壤中，使得土壤中Foc TR4-GFP孢子数量为1.0×10⁵cfu/g土。

处理组链霉菌菌剂接种：取新鲜培养的链霉菌菌剂，无菌水稀释，取100毫升接入土壤中，使得土壤中链霉菌数量为1.0×10⁷cfu/g土。

（1）激光共聚焦显微镜观察Foc TR4-GFP侵染过程

用GFP-Foc TR4接种伤根后的巴西蕉，激光共聚焦显微镜观察其侵染过程，结果如图12所示。在接种后第7 d，对照组和处理组中均观察到GFP-Foc TR4的菌丝和孢子粘附在根表皮细胞上，但对照组中数量明显高于处理组；在第14 d，对照组的GFP-Foc TR4菌丝侵染根系，且菌丝沿根维管束延伸至球茎，菌株1-7菌剂处理组中未发现显著感染；在第21 d，对照中，GFP-Foc TR4继续侵染球茎，并在球茎中产生大量菌丝和孢子，而处理组中，只观察到少量的GFP-Foc TR4菌丝在茎的组织腔内，表明菌株1-7菌剂处理香蕉幼苗后，GFP-Foc TR4受到了抑制，失去继续侵染的能力。在整个观察期，空白组中未观察到GFP-Foc TR4存在。

（2）链霉菌1-7菌剂对香蕉苗枯萎病的防治效果

根据Himaman et al.,（2016）的描述，每组共选取21株香蕉幼苗，对接种49 d的病情指数（DI）进行评价。共分为5个等级，以一棵植株中黄化病叶占比计算，0级：健康植物，1级：1-25%的黄化病叶，2级：26-50%的黄化病叶，3级：51-75%黄化病叶，4级：75%以上黄化病叶。香蕉枯萎病的病情指数（DI）计算公式如下所示:

（5）

链霉菌1-7菌剂对香蕉盆栽苗香蕉枯萎病防治效果如图13所示。对照组在49 d 后的发病率为77.5%，发病严重，球茎出现明显黑化现象；而用菌株1-7菌剂处理香蕉幼苗后，病害症状明显得到抑制,与对照组相比，菌株1-7菌剂处理49 d后，病害指数降低至20%（图13C），对香蕉枯萎病的防治效果达到74.19%，空白组在整个观察期球茎均未出现黑化现象（图13A）。说明链霉菌1-7菌剂对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，可以抑制香蕉枯萎病菌的侵染。

（3）土壤中Foc TR4-GFP定量检测

采用根冲洗获得的土壤溶液进行香蕉枯萎病原菌定量检测。在含有改良Komada选择性培养基平板上，采用根际土壤悬浮液系列稀释法，测定了香蕉根际香蕉枯萎病原菌（Foc TR4）菌落形成单位数（cfu/g）。菌落形成单位数（cfu/g）= 每平皿菌落平均数×稀释倍数×5/土壤重量（肖马云，2012）。

结果表明，不同处理香蕉根际土壤Foc TR4的定殖情况如图14所示。结果表明，对照组中Foc TR4病原菌数量最多，达到了14.67×10³ CFU/g，而经过链霉菌1-7菌剂处理，样品中病原菌数量明显降低，为4.33×10³ CFU/g，而处理组中数量较空白组中高，是由于添加了Foc TR4孢子液。此结果说明链霉菌1-7菌剂对香蕉根际土壤的Foc TR4具有抑制作用，对香蕉枯萎病有良好防效。

（4）链霉菌1-7菌剂处理对香蕉苗生理生态特征的影响

49天后，根据Chen et al.（2018）的方法测定了香蕉苗生长特性，包括叶绿素含量、茎粗、叶面积、株高、叶厚度、生物量。

①叶绿素含量

通过SPAD-502便携式叶绿素测定仪进行测定，选取香蕉苗顶上第二展开叶，分别测量叶片两侧底部、中部、上部边缘的叶绿素含量。结果如图15A所示，与清水处理组（空白）叶绿素含量相比较，对照组中叶绿素含量明显降低，且具有差异显著性（p<0.05），而在处理组中，叶绿素含量高于清水对照（空白），与对照组相比，叶绿素含量显著升高，这是由于链霉菌产生的生物活性物质抑制了病原菌的蔓延，及对叶片叶绿素的伤害。

②茎粗

移栽49 d后，不同处理香蕉苗茎粗如图15B所示。链霉菌菌剂处理的香蕉幼苗（处理组）茎粗为19.52 mm，与空白组（15.12 mm）和对照组（13.43 mm）相比，茎粗分别增加了29.07%和45.36%，且均具有差异显著性（p<0.05）。结果表明，链霉菌菌剂对香蕉幼苗茎粗具有一定的促生作用。

③叶面积

不同处理对香蕉苗叶面积的影响如图15C所示。链霉菌菌剂处理的香蕉幼苗叶片面积为53.89 cm²，与空白组的叶片面积46.43 cm²相比，增加了16.07%，与对照组叶面积（34.93 cm²）相比，增加了54.27%，均具有差异显著性。

④叶片厚度

链霉菌菌剂处理的香蕉幼苗，叶片厚度为0.39 mm（图15D），与空白组相比，叶片厚度增加了18.64%；与对照组相比，叶片厚度增加了38.43%，具有差异显著性。而对照组中，经病原菌+培养基处理的叶片厚度显著低于空白组（p＜0.5）。结果表明，链霉菌菌剂对香蕉植株的叶片厚度具有一定的促进作用。

⑤株高

链霉菌菌剂处理的香蕉幼苗，植株高度为18.77 cm，而空白组和对照组中株高分别为17.37 cm和15.07 cm（图15E），结果显示，链霉菌菌剂施用49 d后，相对于对照组和空白组，株高都出现一定程度的提高，盆栽香蕉苗株高增长量为处理组> 空白组> 对照组，这说明链霉菌菌剂对香蕉苗的生长具有较好的促生作用。

⑥生物量

链霉菌菌剂处理的香蕉植株平均鲜重和干重均显著高于其他组（图15F）。空白组相对于对照组，不管是鲜重还是干重，均具有显著提高。处理组的鲜重和干重分别为35.53g和3.72 g，比对照组分别增加了37.03%和20.71%；比空白组分别增加了29.17%和6.4%，均具有显著性，说明链霉菌菌剂对香蕉苗生物量具有促生作用。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种链霉菌，其特征在于，其为链霉菌属的一个新种，命名为临高链霉菌1-7（Streptomyces lingaoensis sp. nov.1-7），于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021300，地址在中国武汉。

2.权利要求1所述的链霉菌的发酵液，或发酵液的滤液，或发酵液的乙醇提取物。

3.一种链霉菌菌剂，其特征在于，其为权利要求1所述的链霉菌接种到糖蜜营养液中发酵得到的发酵液或所述发酵液的滤液。

4.一种如权利要求3所述的链霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将糖蜜加入到无菌水中，配置成糖蜜营养液；

（2）将活化好的权利要求1所述的链霉菌接种到糖蜜营养液中，发酵，既得。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤（3）：过滤发酵液。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，糖蜜营养液中糖蜜浓度为5-30g/L。

7.如权利要求1所述的链霉菌，或者权利要求2所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者权利要求3所述的链霉菌菌剂在拮抗香蕉枯萎病菌4号小种，和/或黄瓜枯萎病菌，和/或辣椒炭疽病菌，和/或灰葡萄孢霉病菌，和/或香蕉长形斑病菌，和/或小麦赤霉病菌，和/或胶孢炭疽病菌，和/或草莓炭疽病菌中的应用。

8.如权利要求1所述的链霉菌，或者权利要求2所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者权利要求3所述的链霉菌菌剂在制备防治香蕉枯萎病菌4号小种，和/或黄瓜枯萎病菌，和/或辣椒炭疽病菌，和/或灰葡萄孢霉病菌，和/或香蕉长形斑病菌，和/或小麦赤霉病菌，和/或胶孢炭疽病菌，和/或草莓炭疽病菌所致病害的生防制剂中的应用。

9.如权利要求1所述的链霉菌，或者权利要求2所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者权利要求3所述的链霉菌菌剂在促进植物生长中的应用。

10.如权利要求1所述的链霉菌，或者权利要求2所述的发酵液或发酵液的滤液或发酵液的乙醇提取物，或者权利要求3所述的链霉菌菌剂在提高植物叶绿素含量，和/或增加植物茎粗，和/或增大植物叶面积，和/或增加植物叶片厚度，和/或提高植物株高，和/或增加植物生物量中的应用。