CN108935520A - 一种生防制剂、制备方法及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生防制剂、制备方法及其使用方法。所述杨树烂皮病生防菌为盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11469。本发明具有无毒、无残留、使用效果好以及对环境友好等优点。
Description
本发明是分案申请，原中国专利申请号为：201510859507.7，申请日为：2015年12月1日，申请时专利名称为：一株杨树烂皮病生防菌。
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生防制剂、制备方法及其使用方法。
背景技术
杨树烂皮病是杨树的重要病害之一，该病害在世界范围内普遍分布、广泛发生。杨树烂皮病的病原菌有性阶段为污黑腐皮壳菌(Valsa sordida Nit.)，无性阶段为金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)。目前，该病的防治主要以化学防治和选育抗病品种为主，但上述两种防治方法均存在明显弊端。抗病品种选育所培育出的品种存在抗性退化、抗性低等问题；而化学防治易造成环境污染和破坏生态平衡等问题。
以菌治菌利用拮抗微生物防治植物病害是避免上述问题的有效解决方案，而且该方法属于以生态系统调控为主的可持续控制技术，具有不污染环境、不破坏生态平衡的优点。但是目前可拮抗杨树烂皮病菌的生防菌少之又少，用于杨树烂皮病防治的抗生素亦极为少见，多数仍停留在实验室筛选阶段。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供生防制剂、制备方法及其使用方法,具有无毒、无残留、使用效果好以及对环境友好等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种生防制剂，包括杨树烂皮病生防菌的发酵物；所述杨树烂皮病生防菌为盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11469。
本发明所述的生防制剂具有无毒、无残留、使用效果好以及对环境友好等优点。
具体的，盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58为盐屋链霉菌，属于链霉菌属(Streptomyces)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11469，保藏日期为2015年9月30日。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58可使明胶液化；不能使牛奶凝固和胨化；不利用分解纤维素；水解淀粉呈阳性；过氧化氢酶、脲酶、酯酶反应均为阳性；不产生H2S；M.R.试验阴性，V.P.试验阳性；硝酸盐还原反应阴性；可以利用阿拉伯糖、木糖、果糖、淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖；不能利用甘露醇、棉籽糖、鼠李糖。盐屋链霉菌(Streptomycessioyaensis)F58能够利用牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4和KNO3五种氮源；对NaCl的耐受性较强，能在含5％NaCl的培养基上生长；对温度有较强的耐受性，可在15～37℃下生长，28℃为最适生长温度；对碱的耐受性良好，在pH5～12的范围内均能生长，且pH5～7为生长的最适pH。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～2d菌落光滑、无孢子生成，第3d开始有白色孢子从菌落边缘长出，4d后开始逐渐变为灰白至银鼠灰。显微镜下观察，基内菌丝无横膜，不断裂；电镜观察结果表明(如图1～3所示)：孢子丝松敞或紧密螺旋形，时常不规则，偶见短而松散螺旋状，孢子柱状；通过微生物形态和生理生化指标鉴定，认为本发明杨树烂皮病生防菌属于链霉菌属。盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58经16SrDNA序列比对分析，与已知放线菌的链霉菌Streptomyces sioyaensis(基因登录号KF475886)的16S rDNA同源性最高，达到99％。
本发明还提供一种上述生防制剂的制备方法，包括以下步骤：将上述的杨树烂皮病生防菌接种于培养基后，发酵培养，收集发酵物。
具体的，所述培养基包括以下成分：花生饼粉的浓度为2.5％、淀粉的浓度为5.0％、酵母粉的浓度为0.08％、葡萄糖的浓度为0.02％、(NH4)2SO4的浓度为0.08％、CaCO3的浓度为0.32％、NaCl的浓度为0.2％，培养基pH值为7.0～7.2；上述各成分的百分比均为成分的质量与培养基的体积百分比。
采用上述成分的培养基可为菌株生长提供足够的营养元素，使其顺利完成菌株生长及代谢。
在发酵培养时，可以采用以下培养条件为：28℃恒温条件下，150r/min震荡培养5～7天。有利于菌株的生长。
进一步的，在收集发酵物后还包括将发酵物离心、过滤，收集发酵物上清液的步骤。
本发明还提供一种上述生防制剂的使用方法，其特征在于，采用涂抹或喷雾的方式，将生防制剂施加在需要防治的植物上。上述两种方式均有较好的防治效果。其中，人工涂抹的方式的防治效果要优于喷雾的防治效果，喷雾的方式要比人工涂抹省时省力。
本发明所针对的对象都是寄主植物。
进一步的，所述植物选自杨树、苹果树、甜瓜、水稻、大豆、小麦、烟草、玉米中的一种或几种。
本发明的生防制剂可以用于防治上述植物的病害，可以抑制上述植物的致病菌的活性。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58抑菌谱广，对杨树烂皮病菌(Vasalsordida)、杨树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、苹果斑点落叶病菌(Alternariaalternata f.sp.mali)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.melonis)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、大豆炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)均有抑菌活性。
例如：盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58对杨树烂皮病菌的平板对峙试验中活菌抑菌带宽度达30.2～35.5mm，发酵液杯碟法测定抑菌圈直径达到50.7～56.4mm，人工接种防治试验表明其发酵液中生物活性物质对杨树烂皮病具有显著的防治效果，保护作用和治疗作用分别达88.7％和73.4％，与生产上防治杨树烂皮病的化学药剂相比其防治效果差异不显著，而且具备低毒、无残留、与环境友好的优点。
附图说明
图1是盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58的孢子链和孢子电镜观察图。
图2是盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58的孢子链和孢子电镜观察图。
图3是盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58的孢子链和孢子电镜观察图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施方式一：本实施方式杨树烂皮病生防菌为盐屋链霉菌(Streptomycessioyaensis)F58，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11469。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58采自吉林省双辽市实验林场，将土壤样品用无菌水稀释103倍，利用高氏一号培养基在28℃条件下培养，采用常规的平板稀释培养法分离获得。分离纯化后的盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58转入高氏一号培养基在28℃条件下培养、扩繁。
之前的盐屋链霉菌均分离自海洋淤泥，而本发明盐屋链霉菌(Streptomycessioyaensis)F58是首例从土壤中分离得到的盐屋链霉菌。本发明盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58与盐屋链霉菌模式菌株在碳源利用上有所差异，盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58不能利用棉子糖和鼠李糖，但能够利用L-阿拉伯糖，D-果糖，玉米淀粉；同时16SrDNA比对结果亦不是100％同源，因此判断盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58应为盐屋链霉菌新变种。
实施例1
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵培养基中花生饼粉的浓度为2.5％(w/v)、淀粉的浓度为5.0％(w/v)、酵母粉的浓度为0.08％(w/v)、葡萄糖的浓度为0.02％(w/v)、(NH4)2SO4的浓度为0.08％(w/v)、CaCO3的浓度为0.32％(w/v)、NaCl的浓度为0.2％(w/v)，发酵培养基pH值为7.0～7.2。接种盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58的发酵培养基在28℃恒温条件下150r/min震荡培养7d，然后6000r/min离心15min，过细菌滤器除去菌体获得盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵上清液。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液对杨树烂皮病防治试验
杨树烂皮病病原菌侵染：接种用1a生黄快杨扦插苗，将杨树烂皮病菌在PDA培养基26℃恒温培养5～7d后，用7mm打孔器打菌饼备用，用刀片给杨树干部划伤，伤口大小5mm左右，将杨树烂皮病原菌菌饼贴在伤口处，用脱脂棉蘸杨树叶片汁液保湿，每处理15株，3次重复，保湿7d后去除菌饼。
发酵液抑菌对比：于接种前15d、10d、5d和接种处理去掉菌饼后5d、10d、15d，分别将F58发酵上清液5倍稀释液，50％退菌特的50倍稀释液、40％福美砷的100倍稀释液、70％甲基托布津的100倍稀释液及清水对照均匀涂抹于被杨树烂皮病菌侵染的杨树干部，定时观察苗木发病情况，计算防治效果。
病情指数分级标准，参考吉林省地方标准《杨树烂皮病综合治理技术规程》
Ⅰ级(代表值0)——无病；
Ⅱ级(代表值1)——病斑横向长度占树干周长的1/4以下；
III级(代表值2)——病斑横向长度占树干周长的1/4～2/4；
Ⅳ级(代表值3)——病斑横向长度占树干周长的2/4～3/4；
V级(代表值4)——病斑横向长度占树干周长的3/4以上～树木濒死或者死亡。
实验结果：于去掉菌饼15d后调查发病率和病情指数(如表1所示)，对照苗木发病率和病情指数分布为82.2％和49.4；T1(用盐屋链霉菌F58防治)病原菌接种前涂药处理的苗木发病率均为15.5％，病情指数均为5.57，病原菌接种后涂药处理的发病率和病情指数分别均为35.6％和13.4，保护作用和治疗作用分布为88.7％和73.4％；T2(用40％福美砷的100倍稀释液防治)和T4(用70％甲基托布津的100倍稀释液防治)处理的保护作用均为89.8，治疗作用分布为74.4％和79.3％。实验发现对照苗木在之后的几周内病斑逐渐扩大，在病斑处可见明显的分生孢子器，个别有分生孢子角出现；T1-T4感病的植株病斑几乎没有继续扩大，病斑处未见分生孢子器。实验结果表明，盐屋链霉菌(Streptomycessioyaensis)F58发酵液对杨树烂皮病菌有显著的抑制作用，即使杨树已感染杨树烂皮病菌，也有较好的治疗效果；虽然其保护作用略低于T2和T4、高于T3(用50％退菌特的50倍稀释液防治)，但差异不显著；治疗作用与T2～T4差异不显著。
表1
表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同大、小写字母表示经Duncan氏新复极差方法检验在P<0.01和P<0.05水平差异显著，下同。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58抑菌试验
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58平板对峙试验对烟草靶斑病菌、杨树烂皮病菌和杨树溃疡病菌作用最强，可见明显的抑菌带，抑菌带平均宽度达到30mm以上，对苹果斑点落叶病菌、水稻稻瘟病菌和水稻纹枯病菌具有很强的抑制作用，抑菌带宽分别为27.6mm、25.6mm、18.3mm，对小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、甜瓜枯萎病菌、水稻恶苗病菌、大豆炭疽病菌、玉米大斑病菌和玉米小斑病菌抑制作用相对弱一些，但抑菌带宽6.3mm以上。
杯碟法测定盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58及其发酵液的抑菌活性：将各类病原菌制成混菌平板，采用杯碟法测定发酵液的抑菌活性，发酵液稀释5倍使用加样量为100μl，每处理3次重复。盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58及其发酵液的抑菌活性如表2所示。
表2
| 供试菌株 | 抑菌带(mm) | 抑菌直径(mm) |
| 杨树烂皮病菌 | 32.3±2.55Bb | 56.4±0.70Aa |
| 杨树溃疡病菌 | 30.2±1.41BCb | 42.7±0.98Dc |
| 苹果斑点落叶病菌 | 27.6±1.60CDc | 35.5±0.60Ee |
| 甜瓜枯萎病菌 | 15.7±1.34EFe | 22.8±0.87Ff |
| 水稻恶苗病菌 | 11.3±1.04GHf | 21.3±0.62Ffg |
| 水稻纹枯病菌 | 18.3±0.78Ed | 50.3±2.09Bb |
| 水稻稻瘟病菌 | 25.6±1.27Dc | 22.7±1.22Ff |
| 大豆炭疽病菌 | 18.0±1.38Ed | 47.3±1.05Cc |
| 小麦根腐病菌 | 8.7±0.34HIg | 18.5±1.153Gh |
| 小麦赤霉病菌 | 6.3±0.78Ih | 56.8±1.27Aa |
| 烟草靶斑病菌 | 35.5±1.70Aa | 50.8±1.17Bb |
| 玉米大斑病菌 | 13.2±0.98FGf | 20.5±0.85FGg |
| 玉米小斑病菌 | 11.5±0.85GHf | 23.2±1.13Ff |
实验证明盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58的发酵液仍保持了较好的抑菌活性，对小麦赤霉病菌、烟草靶斑病菌、杨树烂皮病菌、杨树溃疡病有极强的拮抗作用，抑菌直径达50mm以上，而且对所有供试病原菌均有较明显的抑制作用，盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58抑菌谱广。
实施例2
将盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58分别接种于10种不同的培养基，28℃培养36～48h开始有菌落出现，72～96h后孢子开始产生。不同的培养基上菌苔的形态、孢子堆的颜色、基质菌丝的颜色、产生的可溶性色素、生长情况均有不同，根据《链霉菌鉴定手册》提供的方法和色版进行观察、比对，结果如表3所示，将盐屋链霉菌(Streptomycessioyaensis)F58在多数培养基上产生可溶性色素；气生菌丝由灰白色变为银鼠灰色或蚌肉白、基内菌丝为乳白至银鼠灰。
表3
| 培养基 | 气生菌丝体 | 基质菌丝体 | 可溶性色素 | 丰茂度 |
| 高氏一号琼脂 | 蚌肉白 | 乳白 | 肉色 | +++ |
| 葡萄糖天门冬素 | 灰白 | VI6-3’ | 雄黄 | +++ |
| 蔗糖察氏 | 灰白 | 灰白 | 淡橙色 | + |
| 克氏合成一号琼脂 | 银鼠灰 | 银鼠灰 | 凋叶棕 | ++ |
| 马铃薯葡萄糖琼脂 | II5-1’ | III6-1’ | 金叶黄 | +++ |
| 酵母膏麦芽膏琼脂 | 灰白 | 乳白 | 杏黄 | +++ |
| 淀粉铵琼脂 | III5-1’ | 灰黄 | +++ | |
| 瓦氏肉汁琼脂 | 灰白 | 灰白 | 肉色 | + |
| 贝奈特 | 灰白 | 银鼠灰 | I7-7’ | ++ |
| 伊莫松 | 灰白 | 乳白 | 万寿菊黄 | +++ |
注：“-”:不生长、“+”:越多生长越旺盛
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液防治试验A
采用涂抹和喷雾两种不同施药方式对杨树人工林进行了防治，试验结果如表4所示。
表4
试验结果表明，人工涂抹盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液的方式防治效果要好于喷雾处理，但人工涂抹的方式比较费时，人工费用也较高。建议对上一年度发病较重的地块，在下一个发病高峰期前，采用此方法。无论是人工涂抹还是喷雾处理三个浓度间随着稀释倍数的增加，防治效果有所降低，但三个浓度处理间差异不显著。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液防治试验B
将盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液和防治烂皮病常用的杀真菌剂一同在吉林省双辽市测试防治效果，试验结果如表5所示。
表5
试验结果表明，使用盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液后，树干上已形成的病斑开始干结，对杨树烂皮病有很好的防治效果，第2次施药后7d，盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液的防效与对照药剂——70％甲托可湿性粉剂800倍稀释液相当；稍低于50％退菌特50倍稀释液和40％福美胂100倍稀释液。本发明发酵液无毒无残留。
盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液防治试验C
用刀将病斑刮除，用退菌特和盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液涂干。实验结果如表6所示。
表6
结果表明使用盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液后，树干上已形成的病斑开始干结；而且对杨树烂皮病有很好的防治效果，第2次施药后7d：盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液5倍、10倍、20倍稀释液的防效为45.68～61.79％；第3次施药后10d防效为48.95～64.35％，防效明显提高；方差分析结果表明：盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58发酵液的防效比对照药剂50％退菌特可湿性粉剂800倍液低25％左右，但该发酵液与环境友好，无毒无残留。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种生防制剂，其特征在于，所述生防制剂包括杨树烂皮病生防菌的发酵物；所述杨树烂皮病生防菌为盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)F58，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11469。
2.一种权利要求1所述生防制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的杨树烂皮病生防菌接种于培养基后，发酵培养，收集发酵物。
3.根据权利要求2所述生防制剂的制备方法，其特征在于，所述培养基包括以下成分：花生饼粉的浓度为2.5％、淀粉的浓度为5.0％、酵母粉的浓度为0.08％、葡萄糖的浓度为0.02％、(NH4)2SO4的浓度为0.08％、CaCO3的浓度为0.32％、NaCl的浓度为0.2％，培养基pH值为7.0-7.2；上述各成分的百分比均为成分的质量与培养基的体积百分比。
4.根据权利要求2所述生防制剂的制备方法，其特征在于，发酵培养的条件为：28℃恒温条件下，150r/min震荡培养5-7天。
5.根据权利要求2～4任一项所述生防制剂的制备方法，其特征在于，在收集发酵物后还包括将发酵物离心、过滤，收集发酵物上清液的步骤。
6.一种权利要求1所述生防制剂的使用方法，其特征在于，采用涂抹或喷雾的方式，将生防制剂施加在需要防治的植物上。
7.根据权利要求6所述生防制剂的使用方法，其特征在于，所述植物选自杨树、苹果树、甜瓜、水稻、大豆、小麦、烟草、玉米中的一种或几种。
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