CN106282391A - 鲤种质资源鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
鲤种质资源鉴定方法，它涉及一种鱼类种质资源鉴定方法。它提供了一种不依靠表型性状，能够低成本、准确鉴定鲤鱼种质的方法。鉴定步骤：一、提取待鉴定鲤鱼个体基因组DNA；二、利用鲤抗疱疹病毒相关SNP位点进行比对，即可鉴定出鲤鱼个体种质资源。众多抗病性基因中本发明选择鲤抗疱疹病毒相关单核苷酸多态性标记进行种质鉴定，具有选取SNP位点少，相对简单，费用低，不受环境等外界条件影响，准确性高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类种质资源鉴定方法。
背景技术
种质是水产渔业发展的基石，随着人们对水产品产量和质量的需求，水产养殖业出现了前所未有的快速发展。然而一些种质由于存在管理不当等现象，不同种质出现严重的混杂现象，这对部分种质保存、利用造成了极大的破坏，长久以来将阻碍水产渔业稳定、快速发展。
鲤鱼已有2000多年的养殖历史，是目前形成品种最多的鱼类，但目前其丰富的种质资源仍主要依靠表型性状进行区分，受环境和人为影响较大，结果准确性差，缺乏有效的鉴定方法。尽管随着基因组技术的发展和分子标记的开发，通过全基因组关联分析筛选阳性标记可以对鱼类种质进行鉴定，但该方法费用较高一般实验室难以承担，同时该方法假阳性率也较高，所以后续仍需较高的费用和较长的时间进行阳性验证，费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种不依靠表型性状，能够低成本、准确鉴定鲤鱼种质的方法。
本发明鲤种质资源鉴定按以下步骤进行：
一、提取待鉴定鲤鱼个体基因组DNA；
二、利用鲤抗疱疹病毒相关SNP位点进行比对，即可鉴定出鲤鱼个体种质资源；
其中，鲤抗疱疹病毒相关SNP位点为15个，分别为carp065309、carp070076、carp183811、carp160380、carp141813、carp075182、carp168573、carp224365、carp021181、carp114921、carp214396、carp132626、carp027120、carp151808和carp090049。
由于不同种质的鲤鱼所生存的自然环境不同，其经历的疾病感染也不尽相同；因此不同种质鲤鱼的抗病性基因在进化中也相应的发生了不同程度的变异。众多抗病性基因中本发明选择鲤抗疱疹病毒相关单核苷酸多态性标记进行种质鉴定，具有选取SNP位点少，实验方法手段多、相对简单，费用低，不受环境等外界条件影响，准确性高的优势。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式鲤种质资源鉴定按以下步骤进行：
一、提取待鉴定出鲤鱼个体基因组DNA；
二、利用鲤抗疱疹病毒相关SNP位点进行比对，即可鉴定出鲤鱼个体种质资源；
其中，鲤抗疱疹病毒相关SNP位点为15个，分别为carp065309、carp070076、carp183811、carp160380、carp141813、carp075182、carp168573、carp224365、carp021181、carp114921、carp214396、carp132626、carp027120、carp151808和carp090049；所述SNP位点对应的引物及多态性变异信息如表1所示：
表1
本实施方式利用所述15个SNP位点对确定种质资源的鲤鱼先进行等位基因频率的测定，从而确定鲤鱼种质资源标准，然后根据与鲤鱼种质资源标准的比对确定鲤鱼个体种质资源。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：提取待鉴定鲤鱼个体基因组DNA可采用发明专利ZL201010509719.X中记载的方法。其它步骤及参数与实施方式一相同。
实施例1
A、采集选育品种的松浦镜鲤、松浦红镜鲤、易捕鲤保种群体各30尾鳍条，保存于95％酒精中，然后提取上述鲤鱼个体基因组DNA。
B、采用SNP位点carp065309、carp070076、carp183811、carp160380、carp141813、carp075182、carp168573、carp224365、carp021181、carp114921、carp214396、carp132626、carp027120、carp151808和carp090049上下游引物(如表1所示)及延伸引物(如表2所示)进行PCR扩增；
其中，单核苷酸多态性PCR反应体系：
PCR反应扩增条件：先94℃预变性3min，然后94℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，35个循环；再72℃延伸3min。
延伸PCR反应体系：
延伸PCR反应扩增条件：先96℃预变性1min，然后96℃变性10s、52℃退火5s，30个循环。
C、取1μl延伸产物，加10μl上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪。
D、利用GenAEx 6.4软件对三个品种间遗传多样性、遗传距离、遗传分化的显著性分析；并利用软件structure和GenAEx 6.4研究个体在三个品种中的分布，确定松浦镜鲤、松浦红镜鲤、易捕鲤这三个品种种质资源标准。
表2 SNP位点对应延伸产物及延伸引物
确定种质资源标准过程中发现，在本发明15个SNP位点中，从等位基因频率分布和遗传多样性差异、品种间遗传分化表明，松浦镜鲤(Pop1)、松浦红镜鲤(Pop2)和易捕鲤(Pop3)这3个品种在15个位点差异极显著，在个体分配中显示群体内个体100％分配到了自身所在品种。
松浦镜鲤、松浦红镜鲤和易捕鲤3个品种在15个位点的等位基因频率如表3所示。
表3
15个SNP位点、3个鲤鱼品种两两间进行遗传多样性分析，结果表明33个两两比较中达到了极显著水平的差异性(P＝0.001)，占总数的73.3％；其中7个位点在两两比较中达到了不同程度的显著性(结果如表4所示)。
表4
对3个鲤鱼品种遗传分化进行了分析，表明两两群体间遗传分化均达到了极显著水平(P＝0.001)，结果如表5所示。说明本发明方法能够明确区分不同种质资源。
表5
| Pop1 | Pop2 | Pop3 | |
| Pop1 | 0.000 | 0.001 | 0.001 |
| Pop2 | 0.838 | 0.000 | 0.001 |
| Pop3 | 0.717 | 0.406 | 0.000 |
注：下三角为遗传分化值；上三角为遗传分化水平。
E、从松浦镜鲤、松浦红镜鲤、易捕鲤保种群体各100尾鳍条，保存于95％酒精中，然后提取上述鲤鱼个体基因组DNA；采用SNP位点carp065309、carp070076、carp183811、carp160380、carp141813、carp075182、carp168573、carp224365、carp021181、carp114921、carp214396、carp132626、carp027120、carp151808和carp090049上下游引物(如表1所示)及延伸引物(如表2所示)进行PCR扩增；PCR扩增体系和反应条件如步骤B；然后根据PCR扩增结果与种质资源标准进行比对即可确定待鉴定鲤鱼个体种质资源。
实验结果：300尾鲤种质鉴定准确率达99.8％以上，说明应用本发明方法完全可进行鲤鱼种质鉴定，具有方法简单，费用低，不受环境等外界条件影响，准确性高的优点
实施例2
本实施例中采用单链构象多态性法(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、等位基因特异PCR(AS-PCR)、RT-PCR、DNA直接测序法获得鲤鱼15个SNP位点信息进行比对。实验结果基本与实施例1一致。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120> 鲤种质资源鉴定方法
<160> 45
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp065309的上游引物。
<400> 1
GAAAGTTGCT TTGTAGCAGT GC 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp065309的下游引物。
<400> 2
CACTCATCGG CTGAATCACA A 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp070076的上游引物。
<400> 3
GAGAGCGCTG TTCATTCACT C 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp070076的下游引物。
<400> 4
GTCCCAAATC AGTGCAATAT G 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp183811的上游引物。
<400> 5
CGACTGTAAG CTCAAGCAAT CA 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp183811的下游引物。
<400> 6
GACATCGCAG TGGGACTCCT G 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp160380的上游引物。
<400> 7
TAGGTAGTAA GCATGTCGAT 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp160380的下游引物。
<400> 8
TCTGTTGCTC GACAGGAAGT G 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp141813的上游引物。
<400> 9
CGGAAGTTTG CCAGGACAAC A 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp141813的下游引物。
<400> 10
ACAAGCGTTA TTTACGCTAT C 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp075182的上游引物。
<400> 11
ACTATTCCAT TAAGCGAGTT C 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp075182的下游引物。
<400> 12
ATGTTCATTG ATGGACTGGA GT 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp168573的上游引物。
<400> 13
TGAAAGACAA GATTAAGCCT A 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp168573的下游引物。
<400> 14
TATGCTGGTT CCACAAGGTG G 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp224365的上游引物。
<400> 15
AGGTGACTTA AATTGCACTC AA 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp224365的下游引物。
<400> 16
TGTTAAATGC AATCCTATCT G 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp021181的上游引物。
<400> 17
TCTCCCGCTT AAACAAACCC AG 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp021181的下游引物。
<400> 18
CGTATCTCTG ACCCAGTTCT GC 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp114921的上游引物。
<400> 19
GTTCCATACA TCACAACATG T 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp114921的下游引物。
<400> 20
CTTCAACACA ATGAGGAACA TG 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp214396的上游引物。
<400> 21
GAATGTGGAT TGTAAAGGCC A 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp214396的下游引物。
<400> 22
CTTTCTCTGC GTCAAGTAGT A 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp132626的上游引物。
<400> 23
CAGTCGAGCT TTAAAGAAAC CT 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp132626的下游引物。
<400> 24
CACAAGCATC TACAGTATCA G 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp027120的上游引物。
<400> 25
CTCCAGTGTG AAGGCTCATG T 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp027120的下游引物。
<400> 26
GACCACGATG AGAATTCACG AC 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp151808的上游引物。
<400> 27
GTGAATACTG TGCCCTTGGA G 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp151808的下游引物。
<400> 28
TGACCATCTG GTTTCTTGCT GG 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp090049的上游引物。
<400> 29
GAGCGTGTGC CAGGAGAGCA C 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp090049的下游引物。
<400> 30
TCTCCAAACA CACGAGCTGT T 21
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp065309的延伸引物。
<400> 31
TTTTTTTTAT TAATCTTACA GTATTGTCCA 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp070076的延伸引物。
<400> 32
TTTTTTTTTA TGCTGTCTCC CAGGCCAGCA 30
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp183811的延伸引物。
<400> 33
AACTGAAGAT GGAGCTCTGT GT 22
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp160380的延伸引物。
<400> 34
TTTTTTTTTT TTTTCTGTCG CTGTCATTTT CTGCCT 36
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp141813的延伸引物。
<400> 35
AGCAGTCGCG AGGGTAATGA AC 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp075182的延伸引物。
<400> 36
CCCGTGGGTG AGTACATTTC AG 22
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp168573的延伸引物。
<400> 37
TTTTTTTTTT GATGAAAGAC AAGATTAAGC CT 32
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp224365的延伸引物。
<400> 38
TTGCACTCAA GGTATATCAC TTCAC 25
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp021181的延伸引物。
<400> 39
TTTTTTTTTT TTAATCCCGT CCCAGGCAAG AAAC 34
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp114921的延伸引物。
<400> 40
TTTAACGTTA AAAGAGGAAA GTCCA 25
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp214396的延伸引物。
<400> 41
TTTTTTTTTT TGAGCCTATG GGTGAGAATT GGA 33
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp132626的延伸引物。
<400> 42
TTTCTTGGAA TAACTTGAAG AAATC 25
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp027120的延伸引物。
<400> 43
TTTTTTTTTT TTTTGTGGAA AGAGTTTCGA TCAAC 35
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp151808的延伸引物。
<400> 44
TTTTGCCAGC ACACTCTTAC CCGAGA 26
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP位点carp090049的延伸引物。
<400> 45
TTTTTTTTTT TTTCCTACGG CTGTAATGGT AACT 34
Claims (3)
1.鲤种质资源鉴定方法，其特征在于鲤种质资源鉴定按以下步骤进行：
一、提取待鉴定鲤鱼个体基因组DNA；
二、利用鲤抗疱疹病毒相关SNP位点进行比对，即可鉴定出鲤鱼个体种质资源；
其中，鲤抗疱疹病毒相关SNP位点为15个，分别为carp065309、carp070076、carp183811、carp160380、carp141813、carp075182、carp168573、carp224365、carp021181、carp114921、carp214396、carp132626、carp027120、carp151808和carp090049。
2.根据权利要求1所述的鲤种质资源鉴定方法，其特征在于所述SNP位点对应的引物及多态性变异信息为
3.根据权利要求1所述的鲤种质资源鉴定方法，其特征在于利用所述15个SNP位点对确定种质资源的鲤鱼先进行等位基因频率的测定，从而确定鲤鱼种质资源标准，然后根据与鲤鱼种质资源标准的比对确定鲤鱼个体种质资源。
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