CN104774938A - 基于DNA Barcoding的六种鲤科鱼类及其生肉制品的鉴别方法及鉴别试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于DNA Barcoding的六种鲤科鱼类及其生肉制品的鉴别方法，步骤为：1)根据己知鱼类DNA Barcoding数据库，设计合成引物；2)提取含上述六种鱼类的多种鱼DNA，利用引物对其进行PCR扩增，根据扩增结果，选出最佳引物和反应条件；3)利用步骤2)筛选出的引物对每个待测样品DNA进行扩增，对扩增片段测序、校正、比对，得到上述多种鱼类的DNA Barcoding数据库；4)对新的待测样品采用步骤2)筛选出的引物进行检测，将其与步骤3)的DNA Barcoding数据库中的序列长度进行比对，确定待测样品是否为前述鲤科鱼类中的一种。本发明的方法成本低、操作简便、准确性高，解决了上述六种常见鲤科鱼类及其生肉制品的鉴别难题，为食品安全监管、物种和环境保护等工作的开展提供了技术支持。

Description

基于DNA Barcoding的六种鲤科鱼类及其生肉制品的鉴别方法及鉴别试剂盒

背景技术

DNA条形码(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。这个概念的原理与零售业中对商品进行辨认的商品条形码是一样的。简单地说，DNA条形码技术的关键就是对一个或一些相关基因进行大范围的扫描，进而来鉴定某个未知的物种或者发现新种(Hebert et al.，2003a；Hebert et al.，2003b；Hebert et al.，2004)。

自从提出DNA条形码的概念以来，这种新兴分类学技术已经引起了越来越多的生物学家的关注。DNA条形码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术，它代表了生物分类学研究的一个新方向(肖金花等，2004)，因此它在生态、环境、食品等诸多领域都将会有广泛的应用(Janzen，2004)。

DNA条形码技术的主要优势有很多，其中包括：(1)鉴定不依赖形态特征，只需提供物种的DNA即可鉴定，一旦某一生物DNA条码数据库建立起来，条形码技术能够快速的从部分零散组织中鉴定到种的水平。(2)对实验的操作技能要求不高，鉴定过程标准化、快速、准确。一个标准DNA条形码数据库的建立，可使各种物种的辨认成为可能，如濒危物种或常见种、土著物种或入侵种等，也使更多的无分类学专业知识的人能够准确的辨认出某个物种。

DNA条形码技术的主要流程包括：提取待检测物种DNA、设计引物PCR扩增、克隆、测序及序列比对，结果分析。其中最关键的是DNA条形码理想序列的确定和标准DNA条形码数据库的建立。

已有研究表明，编码线粒体细胞色素C氧化酶I(CO I)基因是许多鱼类(Savolainen et al.，2005；Ward et al.，2005)、昆虫(Smith et al.，2005；Ahrenset al.，2007；Elias et al.，2007；张媛等，2011)和鸟类(Hebert et al.，2004；Tavares and Baker，2008)等动物分类与鉴别的理想DNA条形码。

鲤科是世界现生淡水鱼类中最大的科，也是分布区域最广的一个科，其中亚洲地区鲤科鱼类的物种分化最为显著，而东亚地区是亚洲鲤科鱼类多样性最为丰富的地区之一。

在长期的历史发展中，中国人赋予鲤鱼以丰富的文化内涵。在中国传统饮食文化中就有“无鲤不成席”的说法。与中国老百姓生活息息相关的常见的鲤科鱼类除了鲤鱼还有青鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼等，为此迫切需要针对上述鱼肉制品，特别是生肉制品，开发一种准确、高效的鉴定方法，为鱼肉制品的溯源和安全监管提供技术支持。

另外，近年来，随着我国经济的高速发展，生态问题日益突出，为外来物种的入侵提供了便利条件，给当地鱼类开发和保护带来隐忧。而鲤科鱼类作为我国水生环境的指标生物，不仅可作为水体净化指标，还可以作为外来物种入侵检验指标，同时其多样性指标也可以反映其生境状态。

如何快速有效的识别鱼类，特别是鲤科鱼类，成为迫切需要解决的问题。但是，由于传统的形态分类学目前得不到足够的重视，形态分类的专业人员逐步减少，影响了鱼类资源保 护以及生境研究等工作。

向燕等在《清水江鲤鱼线粒体COI基因序列变异及遗传多样性》一文中对清水江鲤鱼线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因序列的变异及遗传多样性进行了研究。结果表明清水江鲤鱼COI序列变异较丰富，但其遗传多样性较低。结果分析显示，流域环境变化和生境破碎化导致采样水域鲤鱼的特有性适应和基因交流频繁或许是形成现状的重要影响因素。

王茜等《四种常见鲤科鱼类DNA条形码的研究》、彭居俐《东亚特有鲤科类群的DNA条形码研究及其系统发育分析》中均是采用的线粒体CO1基因靠近5’末端的一段长度为814-816bp的序列，该序列在鲌属、鲌亚科和东亚特有鲤科鱼类中，能够有效的区分各物种。

虽然使用上述方法可用于鉴别部分鲤科鱼类，但是该方法存在需扩增和测序的特异性DNA片段长，测序成本高且结果分析复杂等问题，不利于上述常见鲤科鱼类及其生肉制品鉴定方法的推广以及物种保护、生境研究等科研工作的开展。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种六种鲤科鱼类(青鱼、鲤鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼)及其生肉制品的鉴别方法，通过对编辑好的碱基序列长度进行比较来鉴别多种鱼类中是否有这六种鲤科鱼类中的某种，该方法是基于DNA Barcoding建立的，不受被鉴定材料的形态限制，即便是个体的组织碎片，也能得出准确的结论，因此可用于上述六种鲤科鱼类及其生肉制品的准确、快速鉴定，同时也为物种保护及生境研究等科研工作的开展提供了有力的技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、根据已知鱼类的DNA条形码数据库，设计和合成多组引物。

2、从包含这六种鱼的多种鱼类中提取DNA，利用引物对每个待测对象的DNA进行扩增，根据扩增的结果，选出最佳引物和反应条件。

3、利用步骤2筛选出的引物对每个待测对象的DNA进行扩增，扩增后的序列进行测序，然后进行数据分析，从而得到针对鲤科鱼类DNA Barcoding数据库。

4、在建立DNA Barcoding数据库后，对新的待测对象采用步骤(2)筛选出的引物进行检测，将其与步骤3的DNA Barcoding数据库中的序列长度进行比对，从而确定其是否为6种鲤科鱼类中的某种。

通过上述方法，先建立对应特定引物的准确的含有鱼类COI序列长度的DNA Barcoding数据库，在后续检测新的待测样品是否为该六种鲤科鱼时只需进行序列长度比对即可进行鉴定得到准确结果。

其中，在上述方法中，采用酚、氯仿抽提法提取DNA。

具体的说，通过上述方法筛选得到了两对具有良好PCR扩增性能的引物，分别为引物1(F-BaL2344/F-BaH2617：CGAGAAGACCCTTTGGAGCTT/GCTGTTATCCCTAGGGTAAC)，引物2(F-BaL1023/F-BaH1377：CAAGTCGTAACATGGTAAG/ATCATGATGCAAAAGGTAC)。

通过上述引物，得到的6种鲤科鱼类DNA Barcoding数据库如下表1所示：

表1：DNA Barcoding数据库

在进行新的样品检测时，只需利用引物1或引物2对样品提取的DNA进行扩增后测序。然后进行序列编辑、人工校正，将序列长度与上图列的数据进行对比，即可以判断该样品是否属于上述六种鲤科鱼类中的一种，如果是属于哪一种。

为了便于上述检测，本发明公开了一种用于特异性地鉴别出青鱼、鲤鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼六种鲤科鱼类的试剂盒，包含上述方法中选出的引物1和/或引物2，利用该试剂盒，可用于快速、准确地鉴别待测样品是否属于上述六种鲤科鱼类中的一种。

本发明的方法用于特异性地鉴别出青鱼、鲤鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼六种鲤科鱼类，该方法测序长度较传统DNA条形码技术更短，大大节约测序成本，且分析方法较传统方法更简便，可用于鉴别经过加工的、无法从形态学上加以识别的上述鱼类常见加工产品，为维护消费者利益和正常市场秩序提供技术支撑；同时，本发明还提供一种快速、低成本分析特定生态环境下鲤科鱼类物种多样性情况的方法，进而为鱼类资源以及生态环境保护工作提供有力支撑。

具体实施方式

本发明的方法，按照下述步骤进行：

1.首先在NCBI中登陆GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)浏览鱼类DNA条形码数据库，下载Complete genome of fish，并采用Primer Premier 5.0软件设计和合成引物。

2.然后进行鱼类DNA提取的操作，操作步骤如下：

(1)每份样品取10mg肌肉组织，用眼科解剖剪将其尽量剪碎。

(2)将提取的样品小心的装在1.5ml的高压灭菌离心管中，然后加600μl的SET(裂解液)。

(3)向各个EP管中加入10μl的PROK(20)，再加入15μl的SDS，充分混匀。

(4)消化过夜，55℃水浴，使肌肉组织消化完全。

(5)向各个EP管中加入等体积约600μl的TriS饱和酚，摇动混匀15min，然后离心12000rpm，10min。

(6)将上清液取出，装入新的EP管中，再加等体积的Tris饱和酚，摇动混匀15min，离心12000rpm，10min。

(7)取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混匀10min，离心12000rpm，10min。

(8)取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，混匀10min，离心12000rpm，10min。

(9)取上清液加入2倍体积的冰乙醇(约1ml)，再加入1/10体积的约60μl的NaAc水平摇动，可见絮状，白色DNA样品出现。

(10)将样品置于-20℃冷冻30min，取出或挑出DNA或离心12000rpm，10min，DNA沉于管底。

(11)将75％乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心12000rpm，5-10min。

(12)弃去75％的乙醇，自然干燥后，加入适量(约50μl)TE溶解，放-20℃冰箱中保存(注意：DNA不能太干，否则难于溶于TE)。

利用步骤1合成的引物对步骤2的DNA进行扩增，从而筛选出效率最好的两组引物，即引物1、引物2，扩增反应体系如下：

PCR扩增采用60μl反应体系：Taq PCR Master Mix：30.0μl，上游引物和下游引物各0.5μl，模板DNA(1ng/μl)：1.0μl，ddH₂O：28.0μl。

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20_s，退火温度按各引物的最适温度进行退火时间30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

3.在上述基础上，利用筛选出的引物对每个待测对象的DNA进行扩增，扩增后的序列进行测序，然后进行进行校正、比对，从而得到针对常见鱼类DNA Barcoding数据库。

其中，对测序所得序列编辑和校正的做法为将测序返回的峰图读入MEGA5软件中，然后将MEGA5中同种引物所对应的鱼的碱基序列放在一起进行比对；接下来再用Chromas软件打开峰图，并将峰图和MEGA5中的碱基序列进行对照，根据峰图将丢失的碱基和错误的碱基进行校对更正。

4.在建立DNA Barcoding数据库后，对新的待测对象采用筛选出的引物进行检测，将其与步骤3的DNA Barcoding数据库中的序列长度进行比对，从而确定其是否为青鱼、鲤鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼六种鲤科鱼类中的一种。

在上述操作时，同样进行序列编辑和校正，将检测对象测序返回的峰图读入MEGA5软件中，用Chromas软件打开峰图，并将峰图和MEGA5中的碱基序列进行对照，根据峰图将丢失的碱基和错误的碱基进行校对更正；最后按照MEGA5中同种引物所对应的鱼的碱基序列截取碱基序列开头和结尾的碱基序列，之后比较其碱基长度。

Claims (5)

1.基于DNA Barcoding的六种鲤科鱼类及其生肉制品的鉴别方法，所述六种鲤科鱼类为青鱼、鲤鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼；所述鉴别方法包括下述步骤：

1)根据已知鱼类的DNA条形码数据库，设计和合成多组引物；

2)从包含这六种鱼的多种鱼类中提取DNA，利用引物对每个待测对象的DNA进行扩增，根据扩增的结果，选出最佳引物和反应条件；

3)利用步骤2)筛选出的引物对每个待测对象的DNA进行扩增，对获得的目的片段测序，然后进行校正、比对，从而得到针对常见鱼类DNA Barcoding数据库；

4)在建立DNA Barcoding数据库后，对新的待测对象采用步骤2)筛选出的引物进行检测，将其与步骤3)的DNA Barcoding数据库中的序列长度进行比对，从而确定待测样品是否为前述该六种鲤科鱼类中的一种。

2.根据权利要求1的鉴定方法，其特征在于采用酚氯仿抽提法提取DNA。

3.根据权利要求1的鉴定方法，其特征在于筛选出两组特异引物，引物1为：F-BaL2344/F-BaH2617：CGAGAAGACCCTTTGGAGCTT/GCTGTTATCCCTAGGGTAAC，引物2为：F-BaL1023/F-BaH1377：CAAGTCGTAACATGGTAAG/ATCATGATGCAAAAGGTAC。

4.根据权利要求3的鉴定方法，其特征在于基于这两组引物建立的DNA Barcoding数据库如下所示：

5.一种基于DNA Barcoding的6种鲤科鱼类鉴别试剂盒，其特征在于包含权利要求3中的引物1和/或引物2。