CN113584219B - 一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记及应用。本发明首次获得了控制油菜硒高效性状的稳定的QTL位点qSe.C04，并检查到与该位点紧密连锁的位于已公开发表的甘蓝型油菜Darmor‑bzh v10基因组第C04染色体上第49453541个碱基的SNP标记，可解释12.7％的表型变异。根据该变异位点的反义链，设计的KASP分子标记SeC04J，利用该标记可鉴定油菜硒高效QTL位点qSe.C04的优异等位变异，快速准确筛选出硒含量较高的优良单株，该分子标记还可与其他分子标记联用，进一步提高油菜硒富集能力筛选育种效率。

Description

一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子 标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜硒高效性状主效QT L位点qSe.C04紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
硒是人体生命活动中不可或缺的微量元素，具有多种重要的生物调节功能，在增强机体免疫力、提高雄性生殖能力、改善心肌营养、防癌抗癌、延缓衰老等方面发挥着重要作用。长期硒摄入不足会导致克山病、大骨关节病、多发性硬化症、慢性胰腺炎等多种疾病。中国居民膳食营养素参考摄入量标准(WST 578.3—2017)推荐的成人每天硒摄入量为60-400微克。
含硒植物是人体摄入硒的主要途径。然而，由于我国土壤环境中硒缺乏现象普遍，生产的植物性食品硒含量普遍偏低。油菜具有菜薹产量高、口味好、营养均衡、地域适应能力强等优点，近年来已逐渐成为广受消费者喜爱的蔬菜产品。且前期研究表明部分油菜品种具有“硒高效”特性，即“硒高效”油菜在相同生产环境下在同一组织部位中可富集更高硒含量，即油菜的富硒能力。而油菜资源丰富，遗传多样性高，因此充分发掘油菜“硒高效”潜力进行育种改良，将是缓解我国居民硒摄取需求的有效手段。
传统的育种手段由于育种年限长、选择效率低，难以满足当前作物育种需求。随着分子生物学和测序技术的快速发展，通过基因型选择加速育种进程已成品种选育中广泛应用的技术手段。利用分子标记辅助选择检测油菜中与硒高效性状紧密关联的分子标记，可以克服硒含量表型鉴定中的困难，指导性状的精准导入或聚合，将极大提高育种效率。目前，油菜中尚无硒富集或硒高效性状关联位点被鉴定的报道，相关育种工作仍以传统的大规模表型筛选为主。
本发明通过对油菜薹硒含量的全基因组关联分析，旨在找到对油菜硒高效性状具有改良效应的主效QTL位点，并基于此开发实用的分子标记，用于油菜硒高效性状的标记辅助选择。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记，该分子标记为SNP标记，位于已公开发表的甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C04染色体上第49453541个碱基。
本发明的另一个目的在于提供了一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记的应用，通过对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C04染色体上第49453541个碱基进行基因型的检测，即可实现对油菜富硒能力的筛选育种。
本发明的最后一个目的在于提供了一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记与其他分子标记联用的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04的获得：
(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K Illumina SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜Darmor基因组(Chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得21,243个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。
(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(4)将327份材料分别于2018年9月种植于中国农业科学院阳逻试验基地，2019年9月种植于中国农业科学院武汉试验基地，2020年9月种植于上述两个试验基地，每个点试验各设置3个重复，在油菜生长至蕾薹期(薹高约40cm)，采集15cm油菜薹样品，对327份油菜株系油菜薹的硒含量进行测定。每个样本随机选择5株材料均匀粉碎，通过氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93—2017)测定总硒含量。
(5)结合3年共4个试验点的油菜薹硒含量数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析，在C04染色体上检测到与油菜硒含量显著关联的SNP标记seq-new-rs31053，可在多个环境下重复检测，最高可解释12.7％的表型变异，显著水平为8.17E-05，该SNP变异位点(由G到A的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组C04染色体的第49453541个碱基处，该SNP位点紧密连锁的硒高效性状主效QTL位点被命名为qSe.C04。
用于检测甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C04染色体上第49453541个碱基的试剂在油菜硒富集能力筛选育种中的应用，属于本发明的保护范围。
检测包含有甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C04染色体上第49453541个碱基的油菜序列的试剂在油菜硒富集能力筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述应用中，优选的，所述的油菜序列为SEQ ID NO.2所示。
针对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C04染色体上第49453541个碱基设计的引物在油菜硒富集能力筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述的应用中，申请人根据上述SNP位点，针对其反义链，开发了KASP标记SeC04J，根据该标记设计的引物为：
qSe.C04低富硒能力等位基因型特异引物SeC04J-F1：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGC
qSe.C04高富硒能力等位基因型特异引物SeC04J-F2：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGT
反向引物SeC04J-R：TTATTAAGACATAGTGAAAAGATTCCTTG
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。
以上所述的应用中，所述检测与甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C03染色体上第11408528个碱基的检测进行联用，可提高油菜硒富集能力筛选育种效率。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次获得了与油菜硒高效性状显著关联的主效QTL位点qSe.C04，最高可解释12.7％的表型变异，且在多个环境中均可重复检测，可有效应用于油菜的硒高效性状遗传改良。
(2)首次研究发现了与油菜硒高效性状显著关联的分子标记SeC04J，为油菜硒高效的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
(3)利用分子标记SeC04J可在油菜幼苗生长期快捷地对油菜品种或品系中qSe.C04的优异等位变异进行选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快油菜硒高效的育种进程。
(4)分子标记SeC04J与分子标记SeC03J的联用，可进一步提高油菜硒富集能力筛选育种效率。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。在本发明中，如未特殊说明，所述甘蓝型油菜基因组均以Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)为参照。
实施例1：
油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04的获得：
(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K Illumina SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜Darmor基因组(Chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得21,243个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。
(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(4)将327份材料分别于2018年9月种植于中国农业科学院阳逻试验基地，2019年9月种植于中国农业科学院武汉试验基地，2020年9月种植于上述两个试验基地，每个点试验各设置3个重复，在油菜生长至蕾薹期(薹高约40cm)，采集15cm油菜薹样品，对327份油菜株系油菜薹的硒含量进行测定。每个样本随机选择5株材料均匀粉碎，通过氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93—2017)测定总硒含量。
(5)结合3年共4个试验点的油菜薹硒含量数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析，在C04染色体上检测到与油菜硒含量显著关联的SNP标记seq-new-rs31053，可在多个环境下重复检测，最高可解释12.7％的表型变异，显著水平为8.17E-05，该SNP变异位点(由G到A的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组C04染色体的第49453541个碱基处，该SNP位点紧密连锁的硒高效性状主效QTL位点被命名为qSe.C04。
同时在C03染色体上检测到与油菜硒含量显著关联的SNP标记seq-new-rs42200，可在多个环境下重复检测，最高可解释10.6％的表型变异，显著水平为6.24E-06，该SNP变异位点(由C到T的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组C03染色体的第11408528个碱基处，该SNP位点紧密连锁的硒高效性状主效QTL位点被命名为qSe.C03。
实施例2：
一种与硒高效主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记引物的获得：
(1)提取甘蓝型油菜C04染色体第49453541个碱基上下游各100bp的序列，按照KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)分子标记引物设计原则，针对其反义链，开发KASP分子标记SeC04J，该标记包括两条竞争性正向引物SeC04J-F1和SeC04J-F2，分别对应上述SNP变异位点的互补序列碱基C和T，以及一条反向通用引物SeC04J-R，引物序列如下：
SeC04J-F1：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGC
SeC04J-F2：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGT
SeC04J-R：TTATTAAGACATAGTGAAAAGATTCCTTG
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。
其中SeC04J-F1前所加接头序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，SeC04J-F2前所加接头序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。
在甘蓝型油菜74273(CN110476744A)中扩增的序列为A基因型(即CC基因型)，序列如下所示：
GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGCCAAGGAATCTTTTCACTATGTCTTAATAA(SEQ ID NO.1所示)。
在甘蓝型油菜74296(CN110476744A)中扩增的序列为B基因型(即TT基因型)，序列如下所示：
GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGTCAAGGAATCTTTTCACTATGTCTTAATAA(SEQ ID NO.2所示)。
(2)提取甘蓝型油菜C03染色体第11408528个碱基上下游各100bp的序列，按照KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)分子标记引物设计原则，开发KASP分子标记SeC03J，该标记包括两条竞争性正向引物SeC03J-F1和SeC03J-F2，分别对应SNP变异C和T碱基，以及一条反向通用引物SeC03J-R，引物序列如下：
SeC03J-F1：CAGTGATGCTCAAACCAACTTCAC
SeC03J-F2：CAGTGATGCTCAAACCAACTTCAT
SeC03J-R：AAGTGTTAGGTTTGGATTCTGTATAGTG
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。
其中SeC03J-F1前所加接头序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，SeC03J-F2前所加接头序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。
在甘蓝型油菜74273中扩增的序列为A基因型(即CC基因型)，序列如下所示：CAGTGATGCTCAAACCAACTTCACATACACTATACAGAATCCAAACCTAACACTT(SEQ ID NO.3所示)。
在甘蓝型油菜74296中扩增的序列为B基因型(即TT基因型)，序列如下所示：CAGTGATGCTCAAACCAACTTCATATACACTATACAGAATCCAAACCTAACACTT(SEQ ID NO.4所示)。
(3)对标记采用竞争性等位基因特异性PCR技术在油菜关联群体中进行基因型分型，扩增使用试剂盒为五引物扩增受阻突变体系(PAMS)，按照PAMS pro SNP GentypingPCR mix试剂盒说明，设计10uL反应体系：2×PARMS master mix 5μL，Allele X primer(10μM)0.15μL，Allele Y primer(10μM)0.15μL，Common R primer(10μM)0.4μL，油菜基因组DNA 10-100ng。扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65-57℃(Touch-down)1min，循环10次；94℃20s，57℃1min，循环30次；采集1次荧光信号并输出基因型结果。再利用Tassel软件进行关联分析，明确SeC04J与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04显著关联。
利用上述方法，明确SeC03J标记与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C03显著关联。
实施例3：
基于油菜C04染色体第49453541个碱基设计的引物在油菜硒高效性状筛选育种中的应用，其步骤如下：
(1)挑选出327份材料中经过多代自交已纯合的硒含量较高和硒含量较低的材料各32份，以及甘蓝型油菜74273和74296材料，于2020年9月种植于中国农业科学院油料作物研究所阳逻试验基地，该基地土壤中硒含量约为0.163mg/kg，每个材料设置3个重复，在蕾薹期对上述材料进行取样，利用氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93—2017)测定样本总硒含量。
(2)检查分子标记SeC04J的两种基因型在上述硒含量较高和硒含量较低的材料中分布情况结果表明，分子标记SeC04J的基因型在32份硒含量较高的材料中10份为A，22份为B，而在32份硒含量较低的材料中30份为A，2份为B(表1)。
(3)T测验结果表明分子标记SeC04J检测出的A和B两类基因型在油菜薹硒含量上存在极显著差异(P<0.01)。
以上的结果足以说明我们制备的分子标记SeC04J与油菜薹的硒含量是高度关联的，因而可用于油菜硒高效性状的分子标记辅助选择。
实施例4：
基于油菜C04染色体第49453541个碱基设计的引物与其他位点引物在油菜硒高效性状筛选育种中联用的应用：
(1)实施例3中获得的材料，利用分子标记SeC03J进行检测，结果如下：分子标记SeC03J的基因型在32份硒含量较高的材料中4份为A，28份为B，而在32份硒含量较低的材料中22份为A，10份为B(表1)。T测验结果表明分子标记SeC03J检测出的A和B两类基因型在油菜薹硒含量上存在极显著差异(P<0.01)。
(2)SeC03J和SeC04J标记联用后，在实施例3中获得材料中，SeC03J和SeC04J均为B基因型的材料有19份，SeC03J为B基因型而SeC04J为A基因型的的材料有19份，SeC03J为A基因型而SeC04J为B基因型的的材料有4份，SeC03J和SeC04J均为A基因型的材料有21份。T测验结果表明分子标记SeC03J和SeC04J均为B基因型的材料在油菜薹硒含量上均极显著高于其他三种类型材料(P<0.01)。
以上的结果足以说明我们制备的分子标记SeC04J和SeC03J在联用后，在油菜硒富集能力上的提升，因而可联用于油菜硒高效性状的分子标记辅助选择。
表1：分子标记SeC03J和SeC04J在油菜薹硒含量极端材料中的基因型
Figure BDA0003262065210000071
Figure BDA0003262065210000081
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C04紧密连锁的分子标记及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaaattggt tttaaattgg aagccaagga atcttttcac tatgtcttaa taa 53
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaaattggt tttaaattgg aagtcaagga atcttttcac tatgtcttaa taa 53
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtgatgct caaaccaact tcacatacac tatacagaat ccaaacctaa cactt 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtgatgct caaaccaact tcatatacac tatacagaat ccaaacctaa cactt 55
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaaattggt tttaaattgg aagc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaaattggt tttaaattgg aagt 24
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttattaagac atagtgaaaa gattccttg 29
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtgatgct caaaccaact tcac 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagtgatgct caaaccaact tcat 24
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagtgttagg tttggattct gtatagtg 28
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaggtgacc aagttcatgc t 21

Claims (4)

1. 针对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C04染色体上第49453541个碱基设计的引物在油菜硒富集能力筛选育种中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的引物为：SeC04J-F1：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGC、SeC04J-F2：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGT和SeC04J-R：TTATTAAGACATAGTGAAAAGATTCCTTG。
3. 针对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C04染色体上第49453541个碱基设计的引物联合C03染色体上第11408528个碱基设计的引物在油菜硒富集能力筛选育种中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，所述的引物为：SeC04J-F1：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGC、SeC04J-F2：GCAAATTGGTTTTAAATTGGAAGT和SeC04J-R：TTATTAAGACATAGTGAAAAGATTCCTTG ；SeC03J-F1：CAGTGATGCTCAAACCAACTTCAC、SeC03J-F2：CAGTGATGCTCAAACCAACTTCAT和SeC03J-R：AAGTGTTAGGTTTGGATTCTGTATAGTG。
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