CN102146130B - 植物耐逆性相关蛋白SeVP2及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐性性相关蛋白SeVP2及其编码基因与应用。本发明的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质。实验证明，本发明蛋白及其编码基因能显著提高植物的耐盐性和耐低磷性，本发明为抗盐和耐低磷作物遗传改良提供了理论基础和基因资源，在植物的遗传育种领域具有广阔的应用前景。

Description

植物耐逆性相关蛋白SeVP2及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白SeVP2及其编码基因与应用。

背景技术

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度Na⁺对许多植物的生长和发育造成很大的伤害。盐胁迫对植物的伤害主要有两方面的因素引起的，一是离子胁迫，二是渗透胁迫。由于离子胁迫的毒害作用，大量的Na⁺进入到植物内，不但打破了植物体内的离子平衡，而且植物细胞内过量的Na⁺可以影响植物细胞的生化代谢，使细胞内的活性氧水平上升增加，过氧化作用加剧，造成膜脂或膜蛋白损伤，质膜透性增加，胞内可溶性物质外渗。盐分也使土壤中的水势降低，从而造成渗透胁迫，引起植物体水分缺乏。随着植物遗传学和分子生物学的发展，人们对植物对盐胁迫反应的分子机制有了较为深入的认识。目前，许多植物耐盐相关基因已相继被克隆，而且这些基因与植物耐盐性状的关系也得到初步确认。

磷作为植物生长发育所必需的大量元素之一，它几乎参与了植物所有的生命活动过程，它的缺乏必然严重影响植物的生长发育。植物主要通过根系吸收土壤中的可溶性磷酸盐来满足其磷营养需求。深入研究植物高效吸收利用土壤磷素的分子生物学基础，挖掘利用植物乃至其他生物的高效磷营养基因资源，培育磷高效作物品种，已成为植物生物学领域研究的热点。植物根系形态的变化无疑是植物对低磷胁迫的最显著的适应机制。大量研究表明低磷胁迫导致植物根系形态发生显著变化，包括根冠比、总根长、侧根的长度和数目以及根系吸收面积增加，根系平均直径缩减等，以扩大根系与土壤的接触面积，提高土壤磷素的吸收利用效率。近年来，对植物根系的发生及变化机理的研究有了很大的突破，主要集中在生长素等激素在根系形成尤其是侧根发生中的作用。生长素被认为在根系构型和侧根发生过程中起重要作用。

H⁺-PPase是定位于植物液泡膜上的一种H⁺转运蛋白，它能够把PPi水解产生的自由能和H⁺跨膜转运相耦联，在将PPi水解为2个Pi的同时，还将细胞质中的H⁺泵入液泡内，起质子泵的作用。H⁺-PPase与液泡膜H⁺-ATPase一起建立H⁺跨液泡膜电化学梯度，一方面为各种溶质(如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等)分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力，既能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些无机离子(如Na⁺和Cl^-)对细胞质的毒害；另一方面可以使液泡酸化和细胞质碱化，有利于细胞质中生理生化反应的顺利进行。

盐角草(Salicornia europaea)是属于藜科的一种肉质化真盐生植物，广泛分布在沿海和内陆盐湖附近，能够积累高到干重50％的NaCl，被认为是世界上最耐盐的一种高等植物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种一种蛋白及其编码基因。

本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质。

所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第129-2420位(为读码框)或5-2559位核苷酸所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围；所述引物对具体为SEQ ID NO：3所示DNA分子和SEQ ID NO：4所示DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为在表达载体pCAMBIA3300-ubiquitin的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体；

所述pCAMBIA3300-ubiquitin按照如下方法构建：向pCAMBIA3300的HindIII和BamHI间插入ubiquitin启动子序列；所述ubiquitin启动子序列如SEQ ID NO：5所示。

上述任一所述蛋白、所述编码基因、重组载体在提高植物的耐逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐和/或耐低磷。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向出发植物中导入上述任一所述蛋白的编码基因，得到耐逆性高于所述出发植物的目的转基因植物。

上述过程中，所述编码基因是通过上述任一所述重组载体导入的。

上述过程中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

上述过程中，所述耐逆性为耐盐和/或耐低磷。

上述过程中，所述双子叶植物具体为拟南芥。

实验证明，本发明蛋白及其编码基因能显著提高植物的耐盐性和耐低磷性，本发明为抗盐和耐低磷作物遗传改良提供了理论基础和基因资源，在植物的遗传育种领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为NaCl和低磷胁迫下，SeVP2在盐角草根和地上部分中的转录本相对积累量。

(a)200和800mM NaCl处理；(b)低磷(10μM Pi)处理。

图2为SeVP2在各拟南芥株系中的转录本积累情况。

WT，野生型；avp1，功能缺失突变体；SeVP2-1，-2，-3，过表达SeVP2的转基因株系；avp1：SeVP2，表达SeVP2的功能互补株系。

图3为150mM NaCl处理下各转基因拟南芥种子的萌发率。

(a)种子萌发后5天的生长情况；(b)种子萌发7天内的萌发率统计。WT为野生型；L1-L3分别为过表达株系SeVP2-1，SeVP2-2和SeVP2-3。

图4为拟南芥幼苗在正常生长条件和盐胁迫条件下的生长情况。

WT，野生型；avp1，功能缺失突变体；SeVP2-1，-2，-3，过表达SeVP2的转基因株系；avp1：SeVP2，表达SeVP2的功能互补株系。

图5为拟南芥幼苗在盐胁迫10天时的主根长(a)，鲜重(b)和叶绿素含量(c)。

WT，野生型；avp1，功能缺失突变体；SeVP2-1，-2，-3，过表达SeVP2的转基因株系；avp1：SeVP2，表达SeVP2的功能互补株系。*和**表示在同-处理条件下，与野生型相比，该值分别在P＜0.0和P＜0.01水平上达到显著差异。

图6为低磷处理下各转基因拟南芥种子的萌发率。

WT为野生型；L1-L3分别为过表达株系SeVP2-1，SeVP2-2和SeVP2-3。

图7为拟南芥幼苗在正常生长条件和缺磷胁迫条件下的生长情况。

WT，野生型；avp1，功能缺失突变体；SeVP2-1，-2，-3，过表达SeVP2的转基因株系；avp1：SeVP2，表达SeVP2的功能互补株系。

图8为拟南芥幼苗在缺磷处理10天时的主根长(a)，侧根数(b)和鲜重(c)。

WT，野生型；avp1，功能缺失突变体；SeVP2-1，-2，-3，过表达SeVP2的转基因株系；avp1：SeVP2，表达SeVP2的功能互补株系。*和**表示在同一处理条件下，与野生型相比，该值分别在P＜0.0和P＜0.01水平上达到显著差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pCAMBIA3300-ubiquitin按照如下方法构建：向pCAMBIA3300的HindIII和BamHI间插入ubiquitin启动子序列；所述ubiquitin启动子序列如SEQ ID NO：5所示。

pCAMBIA3300购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

农杆菌C58菌株在文献“Overexpression of Organellar and Cytosolic AtHSP90in Arabidopsis thaliana Impairs Plant Tolerance to Oxidative Stress.HongmiaoSong，Pengxiang Fan，Yinxin Li.Plant Mol Biol Rep(2009)27：342-349.”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。

拟南芥功能缺失突变体avp1购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis biologicalresource center，ABRC)，产品目录号为Salk_046492C。

盐角草(S.europeae L.)种子购自江苏省大丰市晶隆海洋产业发展有限公司。

将盐角草种子均匀播种在蛭石中，待种子萌发，用1/2Hoagland(Hoagland，1935)营养液浇灌。幼苗在中科院植物所温室中培养，白天温度维持在25～30℃，夜间温度在18～20℃，相对湿度维持在60～80％，光照条件为16h光照/8h黑暗。

1/2Hoagland营养液配方如下：

实施例1、基因的制备

一、基因的克隆

(1)SeVP2基因中间片段的获得

盐角草叶片总RNA，利用全式金反转录系统获得第一链cDNA。设计兼并引物ZP2：(5′-CATTGTAGCATTCAG(GA)TCTGGAG-3′)与ZP3(5′-GACACAATTAGCATAGTCGGGTTTGGCAG-3′)。以盐角草cDNA为模版，扩增获得中间片段。将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并对所需的DNA片段切胶回收，连入T载体后进行测序。

(2)5′RACE基因片段的获得

使用5′RACE锚定引物(UPM)和基因特异性的引物GSP1(5′-CGAGGCAACAACAAGAGCAGCACAGG-3′)，以热启动Hot

Taq DNA聚合酶(购自Takara公司)按照Clontech SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit的方法和步骤进行cDNA5′末端扩增。具体PCR反应条件如下：94℃5min；5cycles：94℃30sec，68℃30sec，72℃2min；30cycles：94℃30sec，65℃30sec，72℃2min；72℃10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并对所需的DNA片段切胶回收，连入T载体后，进行测序。

(3)3′RACE基因片段的获得

根据中间片段序列设计基因特异性的引物GSP3(5′-GGTCTTGGCGGTTCCTCAATGGCTCT-3′)，按照Clontech SMART^TM RACEcDNA Amplification Kit的方法和步骤进行cDNA3′末端扩增。具体PCR反应条件同上。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并对所需的DNA片段切胶回收，连入T载体后，进行测序。

(4)全长cDNA序列的获得和生物信息学分析

使用生物信息学软件Genetool对5′和3′RACE的序列信息进行序列组装，根据序列组装的结果，在基因的ORF(Open Reading Frame)两侧设计引物PF2(5′-GGGACTGGCTGTAGGAGTTATTA-3′)(SEQ ID NO：3，与序列2的5-25碱基匹配)和PR2(5′-ACCCAAAATGACAACAGAAATGAGT-3′)(SEQ ID NO：4，与序列2的2534-2559碱基匹配)，然后以盐角草幼茎cDNA为模板用高保真Taq聚合酶来扩增全长cDNA。将获得的全长cDNA连入T载体，进行测序确认。

测序结果表明，扩增的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，该cDNA序列全长2766bp，我们将其命名为SeVP2。该基因序列包含128bp的5′非翻译区(5′UTR)和346bp的3′非翻译区(3′UTR)以及一个2289bp的开放读码框(SEQ ID NO：2中第129-2420位核苷酸为开放读码框)。该读码框编码了763个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

二、盐和低磷条件下基因表达分析

盐角草在蛭石中萌发，4周后转入Hoagland营养液培养，4周后向营养液中加入200或800mM的NaCl，分别在处理0、6h、12h、24h、48h时，取地上部分和根，用于基因表达检测。

由于盐角草的最适生长需要200-400mM的NaCl，所以低磷处理实验是在含有200mM NaCl的Hoagland营养液的基础上展开的。蛭石中萌发4周后盐角草，转入含有200mM NaCl的Hoagland营养液培养4周，然后用含10μM KH₂PO₄的Hoagland营养液处理。分别在处理0、6h、12h、24h、48h时，取地上部分和根，用于基因表达检测。

使用Trizol试剂提取总RNA，提取的总RNA经DNase消化，反转录后，利用SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(Toyobo，Japan)进行荧光定量RT-PCR检测。以盐角草actin基因作为内参，通过2^-ΔΔCt的方法对基因表达进行相对定量。

荧光定量RT-PCR中所用引物序列如下：

盐角草内标actin引物：

SeActup1：5′-TGAGAGATTCCGTTGCCCAG-3′

SeActdn1：5′-CCACCACTGAGCACGATGTTAC-3′

盐角草SeVP2基因引物：

P2-1：5′-GGTTTTGTCTGTTAGTTTTGGTATG-3′

P2-2：5′-ATTGTGCTAGTTAATCTAATGTGGTT-3′.

荧光定量RT-PCR检测结果表明，在200和800mM NaCl条件下，SeVP2在根和地上部分的转录水平的表达量都呈现先升高后降低的变化趋势(图1，a)。200mM NaCl处理12h和24h时，SeVP2在根和地上部分的表达量都明显高于未处理对照植株。与较低浓度的NaCl处理相比，800mM NaCl对SeVP2表达的诱导程度更大。800mM NaCl处理12h时，SeVP2在根和地上部分的相对表达量分别为对照的10倍和4倍。

在低磷胁迫下，SeVP2在根和地上部分的相对表达量也都呈现先升高后降低的变化趋势(图1，b)，其中在处理12h或6h时，表达水平最高。低磷胁迫对SeVP2表达的诱导作用在根中表现尤为明显，在处理12h时，该基因的表达水平提高了40倍。

实施例2、基因的应用

1、植物表达载体的构建

所用植物表达载体为pCAMBIA3300-ubiquitin，含有ubiquitin启动子及除草剂Basta选择标记基因bar。利用该载体多克隆位点的SmaI和SacI，将SeVP2基因插入到pCAMBIA3300-ubiquitin，构建了pCAMBIA3300-ubiquitin-SeVP2载体。

对pCAMBIA3300-ubiquitin-SeVP2载体进行测序验证，结果在pCAMBIA3300-ubiquitin-SeVP2载体的SmaI和SacI位点间，沿着从SmaI至SacI的方向，基因的序列如SEQ ID NO：2中第129-2420位核苷酸所示。

2、重组菌

用热激的方法将构建的植物表达载体pCAMBIA3300-ubiquitin-SeVP2转化农杆菌C58菌株，得到阳性重组菌。

3、转化

用携带植物表达载体pCAMBIA3300-ubiquitin-SeVP2的农杆菌C58菌株，利用农杆菌介导的浸花法分别转化野生型拟南芥(Col-0)及拟南芥功能缺失突变体avp1，以获得过表达株系和功能互补株系。收获的拟南芥的种子(T₀代)经表面灭菌后均匀地撒播于含0.02％Basta的1/2MS固体培养基上，首先暗处于4℃下放置2天，然后置于22℃光照下培养5-10天后，将存活苗转入不含抗生素的1/2MS培养基上，生长3天左右，移至培养土中生长至种子成熟。重复此步骤，直到获得T2或T3代转基因纯系。

同时设如下对照：

转控载体对照1：向野生型拟南芥(Col-0)中转入pCAMBIA3300-ubiquitin，得到的转空载体拟南芥。

转控载体对照2：向拟南芥功能缺失突变体avp1中转入pCAMBIA3300-ubiquitin，得到的转空载体拟南芥。

4、转基因株系的鉴定

来自野生型、突变体和各转基因株系的种子表面灭菌后，播种于1/2MS培养基上，在4℃下暗培养2天，于22℃光照下培养两周后，各取10株(约100ng)，提取总RNA经DNase消化，反转录后，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo，Japan)进行荧光定量RT-PCR检测。以拟南芥Actin基因作为内参，通过2^-ΔΔCt的方法对基因表达进行相对定量。

荧光定量RT-PCR中所用引物序列如下：

拟南芥内标Actin基因引物：

AtAct1：5′-CCCGCTATGTATGTCGCCA-3′

AtAct2：5′-AACCCTCGTAGATTGGCACA-3′

盐角草SeVP2基因特异引物：

Vp2up：5′-CAAAGTCAAGGTTTCGTCGGAG-3′

Vp2down：5’-ATGGCATTCTGTATCTCGGCG-3′

结果，共获得了6个过表达株系和3个功能互补株系。取3个过表达株系和1个互补株系，设计SeVP2特异引物进行基因表达量分析。如图2所示，过表达株系中SeVP2的转录本水平比野生型提高了8-16倍。突变体avp1中该基因的转录本水平显著低于野生型的。SeVP2在互补株系avp1：SeVP2中的表达量显著高于野生型和过表达株系的，其转录本水平约是野生型的30倍。这些结果表明，SeVP2已经转入拟南芥，并能稳定表达。转空载体对照1与野生型一致，转空载体对照2与突变体一致。

5、转基因拟南芥的抗盐性检测

(1)种子萌发实验

来自野生型(WT)和5个过表达株系(L1、L2、L3)的拟南芥种子，经表面灭菌后，分别播种与1/2MS和含有150mM NaCl的1/2MS培养基上。在4℃下暗培养2天，然后于22℃光照下培养，每天统计种子萌发率，22℃光照培养的第二天记作第1天。

结果如表1和图3所示。

在正常生长条件下，来自转基因株系和野生型的种子的萌发速率无明显差异，第3天时，所有株系的种子萌发率几乎都达到了100％。150mM NaCl胁迫，显著抑制了拟南芥种子的萌发，几乎所有株系的种子在第4天时才开始萌发。与野生型相比，除了SeVP2-3外，其他两个过表达株系的种子萌发率都显著高于野生型的，其中在第5和第6天时，这种差异最明显。第7天时，野生型种子的萌发率只有70％，而SeVP2-1，SeVP2-2和SeVP2-3的种子萌发率分别为87％，92％和76％。这些结果表明，盐胁迫下，SeVP2基因的过表达显著提高了拟南芥的种子萌发率。

表1、种子萌发率

“-”表示不加NaCl，“+”表示添加150mM NaCl。

(2)苗期抗盐性检测

来自野生型、avp1突变体、3个过表达株系和1个功能互补株系的拟南芥种子在1/2MS培养基上生长3天后(培养条件：温度为22℃，16h光照/8h黑暗)，挑取生长一致的小苗分别转到1/2MS和含有150mM NaCl的1/2MS培养基上进行竖直培养(竖直培养条件：将培养皿竖直放置，倾斜60度培养，温度为22℃，16h光照/8h黑暗。)。处理10天后，测定植株主根长、鲜重及叶绿素含量。

叶绿素含量的测定方法：取整株拟南芥的地上部分，用80％丙酮浸提法提取叶绿素，分光光度计法，按以下公式计算叶绿素含量：C_T＝20.29D₆₄₅+8.05D₆₆₃。。

结果如下：

主根长(em)：WT：1.62±0.36，SeVP2-1：2.39±0.65，SeVP2-2：2.67±0.69，SeVP2-3：2.4±0.8，avp1：1.07±0.24，avp1：SeVP2-2：2.19±0.33。

鲜重(g/3株)：WT：0.019±0.003，SeVP2-1：0.025±0.003，SeVP2-2：0.024±0.003，SeVP2-3：0.026±0.002，avp1：0.007±0.003，avp1：SeVP2-2：0.029±0.005。

叶绿素含量(mg/g鲜重)：WT：0.21±0.04，SeVP2-1：0.29±0.02，SeVP2-2：0.29±0.05，SeVP2-3：0.26±0.06，avp1：0.17±0.07，avp1：SeVP2-2：0.38±0.06。

如图4所示，在正常生长条件下，转基因株系和野生型没有明显差别。在150mMNaCl胁迫处理10天时，拟南芥的主根长生长明显受到抑制，叶片变黄，突变体avp1大部分已经死亡。生理指标的统计结果表明，盐处理10天时，SeVP2过表达株系的主根长、鲜重及叶绿素含量都明显高于野生型的，部分达到显著差异水平；而突变体的主根长和鲜重都显著低于野生型的，功能互补株系的各个指标都高于突变体和野生型的(图5)。盐胁迫条件下，过表达植株的鲜重比野生型高25％左右，说明SeVP2的过表达提高了拟南芥苗期的抗盐性。

6、转基因拟南芥的耐低磷性测定

(1)种子萌发实验

来自野生型和过表达株系的拟南芥种子，经表面灭菌后，分别播种与1/2MS和缺磷1/2MS培养基上。在4℃下暗培养2天，然后于22℃光照下培养，每天统计种子萌发率，22℃光照培养的第二天记作第1天。

缺磷1/2MS培养基组成及各组分浓度：

缺磷1/2MS培养基母液的配制和保存

以上各种母液中，大量元素母液为20倍浓缩液，微量元素母液和铁盐母液为200倍浓缩液，有机成分母液为100倍浓缩液。用于培养拟南芥时，用水稀释成1/2MS，加1％的蔗糖和0.488g/L MES，用1M的NaOH溶液调pH＝5.8～6.0，最后加8％的琼脂粉，高压灭菌。

与盐胁迫下不同，低磷处理对拟南芥种子的最终萌发率没有明显影响，只是降低了种子萌发速率。正常条件下，拟南芥种子在第3天时萌发率就几乎达到了100％，而在低磷条件下，野生型种子的萌发率在第3天时只有30％左右，到第4天时才达到90％以上。这种萌发延迟现象在过表达株系中表现不明显，在第3天时，各转基因株系的种子萌发率仍达到了90％左右，显著高于野生型的(图6)。

(2)苗期耐低磷能力测定

来自野生型、avp1突变体、3个过表达株系和1个功能互补株系的拟南芥种子在1/2MS培养基上生长3天后(培养条件：温度为22℃，16h光照/8h黑暗)，挑取生长一致的小苗分别转到1/2MS和缺磷的1/2MS培养基上进行竖直培养(竖直培养条件：将培养皿竖直放置，倾斜60度培养，温度为22℃，16h光照/8h黑暗。)。处理10天后，测定植株主根长、侧根数目及鲜重。

结果如下：

主根长(cm)：WT：4.03±0.68cm，SeVP2-1：4.4±0.27，SeVP2-2：3.84±0.77，SeVP2-3：4.27±0.47，avp1：2.04±1.31，avp1：SeVP2-2：3.98±0.8。

鲜重(g/3株)：WT：0.008±0.001g，SeVP2-1：0.01±0，SeVP2-2：0.01±0.001，SeVP2-3：0.01±0.002，avp1：0.009±0.004，avp1：SeVP2-2：0.09±0.001。

侧根数目：WT：10.78±2.39，SeVP2-1：14.1±6.4，SeVP2-2：18±4.2，SeVP2-3：17±2.4，avp1：8.56±3.81，avp1：SeVP2-2：16.8±1.8。

如图7所示，在正常生长条件下，转基因株系和野生型没有明显差别。在缺磷处理10天时，拟南芥的主根长生长明显受到抑制，而侧根数目明显增多，叶片变红。生理指标的统计结果显示(图8)，缺磷处理10天时，SeVP2-1和SeVP2-3的植株主根显著长于野生型，而avp1突变体的显著短于野生型。3个过表达株系和一个互补株系的侧根数目都显著多于野生型。而在植物鲜重方面，除了SeVP2-1显著高于野生型外，其余株系和野生型无显著差异。

上述抗盐性与抗低磷性实验中，转空载体对照组1的结果均与野生型一致。转空载体对照组2的结果均与突变体一致。

Claims (10)

1.一种蛋白，是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)所示：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第129-2420位或5-2559位核苷酸所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示DNA分子。

4.扩增权利要求2或3所述编码基因全长的引物对：所述引物对为SEQ ID NO：3所示DNA分子和SEQ ID NO：4所示DNA分子。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在表达载体pCAMBIA3300-ubiquitin的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体；

所述pCAMBIA3300-ubiquitin按照如下方法构建：向pCAMBIA3300的HindIII和BamHI间插入ubiquitin启动子序列；所述ubiquitin启动子序列如SEQ ID NO：5所示。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因、权利要求5或6所述的重组载体在提高植物的耐逆性中的应用。

8.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向出发植物中导入权利要求1所述蛋白的编码基因，得到耐逆性高于所述出发植物的目的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求5或6所述重组载体导入的。

10.根据权利要求7所述的应用或权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物；

所述耐逆性为耐盐和/或耐低磷。

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