CN110747210A - 茶树糖基转移酶基因ugt91q2在提高植物抗寒性上的应用 - Google Patents

茶树糖基转移酶基因ugt91q2在提高植物抗寒性上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了茶树糖基转移酶基因UGT91Q2在提高植物抗寒性上的应用，所述茶树糖基转移酶基因UGT91Q2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的茶树糖基转移酶基因UGT91Q2与植物的抗寒性相关，在茶树中沉默该基因可显著降低茶树的抗冷能力，在拟南芥和烟草中过量表达该基因后，再对转基因植株低温处理，显著提高了模式植物的抗冻性。

Description

茶树糖基转移酶基因UGT91Q2在提高植物抗寒性上的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及茶树糖基转移酶基因UGT91Q2在提高植物抗寒性上的应用。
背景技术
植物的生长发育，产量与外界环境因素息息相关。植物在生长发育过程中不可避免的受到逆境胁迫的影响。逆境胁迫分为生物胁迫和非生物胁迫。目前，低温已经成为非生物胁迫中，影响植物的生长，发育和分布的主要限制因子。
茶是世界上最受欢迎的非酒精类保健饮料，茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze))属山茶科山茶属,是近30个国家(包括中国，日本，印度和美国)的最重要的经济作物之一。系亚热带多年生常绿植物,原产于我国西南地区、缅甸北部和印度阿萨姆一带。主要种植于热带和亚热带区域。茶树是我国重要的经济作物,茶也是日常生活中的重要饮品。
尽管这种常绿的多年生植物可以在各种农业气候条件不同的地区种植，但由于其嗜热的性质，大多数茶叶生产仅限于热带和亚热带气候。近年来茶叶需求量增加,茶树种植区域北移,但茶树喜温畏寒的特性使得一些南方优良种质向北方茶区引种栽培时受年平均温度的制约,越冬困难。我国大部分茶区严冬季节都曾遭受过冻害,导致茶树大幅减产。低温是限制茶树生长，存活和地理分布的最关键的环境因素之。因此，有必要更好地了解冷胁迫的生理反应并探索提高茶树耐寒性的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一个能提高植物抗寒性的茶树糖基转移酶基因。
本发明的技术方案为：茶树糖基转移酶基因UGT91Q2在提高植物抗寒性上的应用，所述茶树糖基转移酶基因UGT91Q2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述应用为在植物中过表达茶树糖基转移酶基因UGT91Q2，从而提高植物抗寒性。
优选地，所述植物为拟南芥、烟草或茶树。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的茶树糖基转移酶基因UGT91Q2与植物的抗寒性相关，在茶树中沉默该基因可显著降低茶树的抗冷能力，在拟南芥和烟草中过量表达该基因后，再对转基因植株低温处理，显著提高了模式植物的抗冻性。
附图说明
图1为UGT91Q2基因在茶树低温转录组中的表达量变化，NA为对照(正常条件下生长的茶苗)；CS为低温4℃处理6小时；CA为低温4℃处理7天；FA为低温0℃处理7天；DA为低温25℃处理7天；通过该基因在不同低温条件下的表达量可以得出该基因在低温下强烈诱导，发挥一定的作用。
图2为不同茶树基因型中UGT91Q2基因及冷响应转录因子CBF基因的变化趋势，1-4为不同的茶树基因型，抗冷能力依次增强。抗冷能力强的基因型中该基因的表达能力更强，而且该基因与CBF的表达高度相关。(CBF为植物冷响应转录因子，低温下响应强烈)。说明该基因与茶树抵御低温的能力呈正相关。
图3为茶树沉默UGT91Q2基因后叶绿素荧光成像图。左图为注射正义链的对照，右图为沉默后植株；色阶0-1代表Fv/Fm值，数值越大，抗冷能力越强。沉默后的植株抗冷能力显著降低。
图4为野生型拟南芥植株(CK)与转基因植株(Treat)在-5℃低温条件下的叶绿素荧光图。色阶0-1代表Fv/Fm值，数值越大，抗冷能力越强。转基因拟南芥植株的抗冷能力显著强于野生型。
图5为野生型烟草(CK)与转基因烟草(Treat)在-5℃低温条件下的叶绿素荧光图。
色阶0-1代表Fv/Fm值，数值越大，抗冷能力越强。转基因烟草植株的抗冷能力显著强于野生型。
具体实施方式
实施例1UGT91Q2的克隆
1、cDNA模板的获取：将茶叶的鲜叶液氮处理磨碎后，用商业化提取植物RNA试剂盒提取，之后用商业化反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。
PCR引物序列：
UGT91Q2F:GGTTCCGCGTGGATCCATGAACGGTGACTCCCAACAACA(SEQ ID No.2)UGT91Q2R:GGCCGCTCGAGTCGACTTAAGGGTGCTTACAAGCTTTGATTACCTCCAAC(SEQ ID No.3)
反应体系：
Figure BDA0002309446310000031
反应程序：
2、重组质粒pGEX4T1-UGT91Q2的构建
将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-UGT91Q2，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2茶树低温胁迫
对茶树进行低温胁迫处理，检测UGT91Q2基因在茶树低温转录组中的表达量。结果如图1所示。
图1为UGT91Q2基因在茶树低温转录组中的表达量变化，NA为对照(正常条件下生长的茶苗)；CS为低温4℃处理6小时；CA为低温4℃处理7天；FA为低温0℃处理7天；DA为低温25℃处理7天；通过该基因在不同低温条件下的表达量可以得出该基因在低温下强烈诱导，发挥一定的作用。
图2为不同茶树基因型中UGT91Q2基因及冷响应转录因子CBF基因的变化趋势，1-4为不同的茶树基因型，抗冷能力依次增强。抗冷能力强的基因型中该基因的表达能力更强，而且该基因与CBF的表达高度相关。(CBF为植物冷响应转录因子，低温下响应强烈)。说明该基因与茶树抵御低温的能力呈正相关。
实施例3茶树(模式植物)基因沉默方法：
(1)设计反义寡聚核苷酸引物：利用网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl设计特定基因的反义寡聚核苷酸引物；
(2)选择合成特异性引物：通过茶树基因组数据库http://tpia.teaplant.org/index.html比对找到该基因特异性反义寡聚核苷酸引物序列，送公司合成；引物序列：TGATGCCGGCTTTGGCTAGG(SEQ ID No.4)
(3)引物稀释：引物终浓度为20uM,用RNA-Free H2O稀释；
(4)选择待沉默样本(健康的完整植株)；
(5)沉默方法：
注射：选择长势良好有芽的一年生完整植株，黑暗处理15min，用1mL注射器抽取稀释好的20uM的引物溶液，用注射器针头轻轻摩擦植株第一、二叶叶背，注射引物，直至注射满整片叶子，对照为相同浓度的正义链稀释引物溶液；注射后植株室室温培养24小时后进行下一步处理或者采取一二叶液氮固样，-80保存，进行下一步检测分析；该实验不低于3个重复。
结果如图3所示，图3为茶树沉默UGT91Q2基因后叶绿素荧光成像图。左图为注射正义链的对照，右图为沉默后植株；色阶0-1代表Fv/Fm值，数值越大，抗冷能力越强。沉默后的植株抗冷能力显著降低。
实施例4拟南芥过量表达
(1)种植拟南芥
土壤比例:蛭石：草木灰：泥炭土：珍珠岩＝6：2：1：1
拌好土后，直接撒播拟南芥种子，播种后要在花盆底盘浇水并覆膜，覆膜是为了保湿，避光2天后进行光照。待拟南芥发芽后，可移栽至大盆。注意移栽拟南芥后也需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。总之盖膜时间自己灵活掌握。
(2)构建载体
构建转基因载体，电转农杆菌，一般为GV3101。
(3)摇菌
先用3ml LB(带有抗性)摇过夜，再转至300ml摇过夜，至OD600值为1.2-1.6，室温离心5000rpm,15min，弃上清，用渗透培养基悬浮。
(4)重悬浮
渗透培养基配方(1L)：5％(wt/vol)蔗糖溶液，可灭菌后使用，也可不灭菌，因为后面的侵染也不在无菌环境下进行。
一个基因通常至少转化20-30株拟南芥，需使用300-500ml渗透液。
将花盆套上两个垃圾袋，重悬浮渗透液倒入袋中，侵染时加入200μl Silwet77(终浓度0.02％)，摇匀。
将拟南芥整株，尤其是花的部位，浸入渗透液，浸泡28S后取出。
套上透明保鲜袋，上端封口，以利于保湿，移入恒温室避光培养24小时后，正常光照培养，保鲜袋第二天需打开透气。
*PS:渗透液及农杆菌务必灭菌后丢弃。可进行二次浸染，或者直接喷施于花上，提高转染效率。
(5)T0代种子筛选
使用1/2MS培养基(不含蔗糖)+对应的抗生素进行筛选。
种子消毒：
用异丙醇浸泡15-60S，弃废液；
50％次氯酸钠NaClO浸泡5min,弃废液；
无菌水清洗3-4次；
0.1％琼脂糖重悬浮，混匀，均匀倒入培养基；
4℃培养2天后，挪入组培室培养6-10天，挑选长势好的植株，移至生根培养基。注意：阳性植株长的比较绿，比阴性植株长的高一点，阴性植株较矮且发黄。
(6)移苗生根
移出阳性小苗，转移至含有蔗糖的1/2MS培养基进行生根培养。
待生根较长，植株健壮，即可移至土壤栽培。
(7)低温处理
将转基因拟南芥移至低温冰箱(-5℃)冷冻处理3小时，利用叶绿素荧光成像系统观察Fv/Fm条件下的叶片成像情况，并统计Fv/Fm值，可以通过叶片颜色及Fv/Fm值判断叶片损伤程度，从而反映叶片对低温的抵御能力。其中叶片蓝色代表正常叶片，由绿色到黄色到黑色损伤程度逐渐加深，Fv/Fm值越大，损伤程度越小，抗冷能力越强。
图4为野生型拟南芥植株(CK)与转基因植株(Treat)在-5℃低温条件下的叶绿素荧光图。色阶0-1代表Fv/Fm值，数值越大，抗冷能力越强。转基因拟南芥植株的抗冷能力显著强于野生型。
实施例5烟草过量表达：
(1)烟草栽培：
栽培条件：25°，16h light/8h dark，长到4叶片时就可以用了，大约一个月。转化烟草前，先将烟草浇足了水，以便容易的转化烟草。
(2)用于转化烟草的农杆菌现转现用或者用之前平板划线，以便保持农杆菌的活性。
在平板上挑取单克隆接种于5mlLB(kan+str)液体培养基中，28°200rpm振荡培养过夜，测OD600大约1.5左右。取500ul菌液，1:1000转接到5mlLB(kan+str)液体培养基中，28°200rpm振荡培养至OD600＝0.6。3000rpm离心收集菌体沉淀，用转染缓冲液悬浮并调OD600＝1.0。用注射器将转染液打入苗龄约一个月的烟草叶片中，从叶片背面打入。在48-72小时内观察。
(3)将转基因烟草移至低温冰箱(-5℃)冷冻处理3小时，利用叶绿素荧光成像系统观察Fv/Fm条件下的叶片成像情况，并统计Fv/Fm值，可以通过叶片颜色及Fv/Fm值判断叶片损伤程度，从而反映叶片对低温的抵御能力。其中叶片蓝色代表正常叶片，由绿色到黄色到黑色损伤程度逐渐加深，如下图5所示。Fv/Fm值越大，损伤程度越小，抗冷能力越强。
图5为野生型烟草(CK)与转基因烟草(Treat)在-5℃低温条件下的叶绿素荧光图。色阶0-1代表Fv/Fm值，数值越大，抗冷能力越强。转基因烟草植株的抗冷能力显著强于野生型。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 茶树糖基转移酶基因UGT91Q2在提高植物抗寒性上的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1359
<212> DNA
<213> 茶树糖基转移酶基因UGT91Q2(Camellia sinensis)
<400> 1
atggagagaa aagaaattca cgttgttctc cttccatggc tagcattcgg tcacatgatg 60
ccatttcacg agctcgccat atccctagcc aaagccggca tcaaagtctc ctacatctca 120
accccaaaca atctccgccg cctccccacc cctccgccgc ctctcgccgc cctcatcact 180
ccggtggcgc ttccacttcc gccgctcgac ttgccggaaa acgccgaagc caccgtcgac 240
attcccatgg agaaactcct ctccttaacc atggccttcg atctcctcca ccgacccttc 300
aagcaattcg tctccgatca ctcgccggac tggatcatct ccgatttcat cccccattgg 360
acctccgacg tagctcgaga cttgggtgtt cctctattga ccttctctgc tttctcggcg 420
gcgaccaatg tgttcttcgg cccgccggag tttctctccg gcgagggtca gaaaagagtc 480
cgatcatcca tcgagagcct gacttcgccg ccggagtggg tcacgtttcc ttcggcggtg 540
gcgtaccgga gattcgaagc cgccggagct cttttcgggt tttttgggga taatccgacc 600
gggatctccg cggcgggaag agtcgggaaa actctagaag gttctagagc tgttgcgatt 660
cggagttgta gagagatcga gggtgagtat ttgagcttgt tcgagcagat cattgggaag 720
cctgtgattc cagtgggttt gcttccgcca ttgaaatcga ataaagctca aaaacaaacc 780
agagatgaga attggactca aatcttcaaa tggcttgatt atcagaaacc cagatcggtt 840
ctttttgttg ggtttgggag tgagtgtaaa ctcaacaaag aagaaattca cgagatcgct 900
catgggcttg agaaatcgga gcttccattt ttgtgggctc tgagaaaacc cacttgggca 960
attgaagatc tcgattctgt gccgattgaa ttcactgatc ggacattgga gagagggaga 1020
gtgagcttcg gatgggcacc gcagagagag attctggaac acccatcaat cggagggtct 1080
ctgtttcacg caggttgggg atcggtgatt gaaacactgc aatttggaca ctcgatggtg 1140
gttcttccat tgataatcga tcagggtttg aatgcgaggt tgatggttga aaagggtttg 1200
gcgattgaag cggagagaag tgaagatggg tcgtttagca gagacgacat agctaaggct 1260
ctgaaactag ctatggtgtc caaggaagga gatgaaatga gagctcggtt gagagaagct 1320
gcgaagatgg ctggacatca gaaactgcat gatggttag 1359
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttccgcgt ggatccatga acggtgactc ccaacaaca 39
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccgctcga gtcgacttaa gggtgcttac aagctttgat tacctccaac 50
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatgccggc tttggctagg 20

Claims (3)

1.茶树糖基转移酶基因UGT91Q2在提高植物抗寒性上的应用，所述茶树糖基转移酶基因UGT91Q2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为在植物中过表达茶树糖基转移酶基因UGT91Q2，从而提高植物抗寒性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥、烟草或茶树。
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