CN114175979A - 一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，包括如下步骤：步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。本发明将不同的菌株和不同的茭白品种结合，加快了茭白的育种进程，有望在较短时间内育成一大批符合地域要求。
Description
技术领域
本发明涉及茭白育种技术领域，尤其涉及一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法。
背景技术
茭白是我国重要的水生蔬菜之一，随着农业产业结构的调整，茭白栽培面积呈逐年扩大的趋势，已成为长江流域多地的支柱产业和地理标志产品。茭白品种选育是一个无性系种墩筛选过程，费时费力；且无性繁殖植物遗传变异频率较低，因此茭白新品种选育迄今尚无实质性突破。但是茭白是菰受到菰黑粉菌侵染茎基部数节膨大产生的白色肉质茎，菰黑粉菌的繁殖单位数量极大，发生变异的绝对数容易超过一般植物，导致茭白分株繁殖后代差异大，常有脱离菰黑粉菌侵染的茎尖组织不膨大的“雄茭”和嫩茎内充满灰黑粉末的“灰茭”的产生，二者无经济价值，且年发生率高，造成巨大的经济损失。研究发现，与正常茭白相比，雄茭长势较旺，分蘖多，同时茭白品种之间差异形成与其体内的菰黑粉菌的存在密切相关，如能通过从茭白体内分离的菰黑粉菌的不同菌株和不同品种雄茭进行组合人工接种，使其人工孕茭，有望加快育种进程，减少变异率和增加产量，培育出新的茭白品种。但目前尚未见到通过人工接种不同品种的菰黑分菌使雄茭产生正常茭白的方法。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，目的是从茭白体内分离的菰黑粉菌的不同菌株和不同品种雄茭进行组合人工接种，加快茭白的育种进程。
基于上述目的，本发明提供了一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，包括如下步骤：
步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；
步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；
步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；
步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。
所述步骤一中单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株的方法包括如下步骤：挑取成熟老化期正常茭白YD-3号肉质茎内产生的黑色冬孢子堆，经无菌水稀释、固体PDA培养基培养、冲洗平板制备孢子悬浮液、显微镜观察已萌发成杆状的孢子数目在5个以下，在显微镜下挑取单个孢子点在新的PDA培养基上进行扩大培养得到。
所述固体PDA培养基培养的温度为28℃，培养时间为2d。
所述引物组包括Pra1-F/R引物、Pra2-F/R引物和Pra3-F/R引物，Pra1-F/R 引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示；Pra2-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；Pra3-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述多重PCR的反应体系为：ddH2O 6μL，2×M5 Taq PCR Mix 10μL，模板1μL，Pra1-F/R、Pra2-F/R、Pra3-F/R引物各0.5μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。
所述步骤三中交配型基因不同的单菌落分别为UeYD-3 MT10、 UeYD-3MT12和UeYD-3 MT24，通过挑取PCR验证出交配型基因不同的单菌落UeYD-3 MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3 MT24转接于PDB培养基培养，之后取不同交配型基因菌液两两混匀进行配对，经PDA平板培养后观察配对菌株是否产生白色菌丝。
所述步骤四中接种的菌液是将产生白色菌丝的单倍体菌株培养活化后，刮取UeYD-3 MT10、UeYD-3 MT12和UeYD-3 MT24长出的单菌落边缘，分别转接于PDB培养基中，经培养、离心、洗涤、无菌水重悬后，分别将 UeYD-3 MT10和UeYD-3 MT24、以及UeYD-3 MT12和UeYD-3 MT24的两种菌液1:1等量混合得到。
所述步骤四中双季茭白雄茭的芽萌发方法是挖取双季茭白YD-10雄茭地下部产生的带顶芽游茭进行移栽，移栽后平铺于基质表面，覆盖浅水层，于室温23～28℃培养至芽萌发。
所述步骤四中双季茭白雄茭进行接种的方法是双季茭白雄茭芽萌发10d 时，将苗连完整根系挖出或剥去苗茎基部附近基质，剥去雄茭苗最外面一层叶鞘，在靠近雄茭生长锥的茎基部注射菌液，直至在苗的中心叶位置，有多余菌液溢出为止。
所述黑暗培养是在24-28℃黑暗培养3d；光照/黑暗交替培养是先在温室中栽培，光照时间为16-18h光照/6-8h黑暗，当验证菰黑粉菌成功接种于雄茭苗中后，再将接种成功的雄茭苗，放置于8-12h黑暗/12-16h光照，15-18 ℃黑暗/25-28℃光照的环境中生长30d；然后进行8h光照/16h黑暗处理，温度为15℃黑暗/25℃光照，处理25～30d后，接种成功后的雄茭开始孕茭，孕茭20d后，剥去叶鞘，切开膨大的肉质茎，其内部为可食用的白色正常茭白。
优选的，所述黑暗培养是在25℃黑暗培养3d；光照/黑暗交替培养是先在温室中栽培，光照时间为16h光照/8h黑暗，当验证菰黑粉菌成功接种于雄茭苗中后，再将接种成功的雄茭苗，放置于10h黑暗/14h光照，18℃黑暗/28℃光照的环境中生长30d。
本发明的有益效果：本发明中，将黑粉菌引入菰植株培育茭白新品种作为一种全新的育种技术，成功用于茭白育种，将不同的菌株和不同的茭白品种结合(来源不同的单季茭白和双季雄性茭白)，加快了茭白的育种进程，改变了茭白的孕茭时间，相对原有的茭白孕茭时间有很大的提升，且产生的茭白是白色正常的可食用茭白。通过该方法有望在较短时间内育成一大批符合地域要求，上市时间要求，栽培条件要求的茭白的新品种，降低了种植者每年用与茭白选种的大量劳力，进而可调动种植者的栽培茭白的积极性，增加了农民收入，带来了一定经济价值和社会效益，有很好的产业化应用前景。本发明的方法可为茭白的品种选育工作者提供理论参考和方法参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明菰黑粉菌的PCR鉴定示意图；其中，1-40为40个待检测菌；M为DL5000的Marker；
图2为本发明菰黑粉菌交配型的PCR鉴定示意图；其中，M为DL2000 Marker；1-3为UeYD-3 MT10、UeYD-3 MT12、UeYD-3 MT24菌株；
图3为本发明菰黑粉菌接种雄茭、孕茭及产生茭茭白的照片；其中，A、注射法接种雄茭；B、接种不同品种菰黑粉菌的雄茭孕茭；C、接种不同品种菰黑粉菌的雄茭产生白色的肉质茎。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明涉及一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，包括如下步骤：
步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；
步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；
步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；
步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。
下面通过具体的优选实例进行详细说明。
一、材料的准备：
1.两组可以成功接种雄茭植株，并能产生正常茭白的单倍体菰黑粉菌组合。分别是：从单季茭白YD-3分离、培养的单倍体菌株组合1：UeYD-3 MT10和UeYD-3 MT24；组合2：UeYD-3 MT12和UeYD-3 MT24。单季茭白YD-3采收期为10月中下旬。
2.来自于双季茭白YD-10的雄茭。双季茭白YD-10采收期为6月上旬和9月中下旬。
二、单季茭白YD-3号菰黑粉菌单倍体MT菌株的获得
单倍体菌株分离：
挑取成熟老化期正常茭白YD-3号肉质茎内产生的黑色冬孢子堆，用无菌水稀释孢子，取50μl稀释孢子液涂布于固体PDA培养基上，于28℃下培养2d后，用无菌水冲洗平板，制备孢子悬浮液，用移液枪将平板上的孢子悬浮液吸于2ml离心管内，于显微镜下观察，同时用无菌水稀释孢子悬浮液，每次稀释一倍，直至在显微镜目镜10X，物镜20X的视野下，出现的已萌发成杆状的孢子数目在5个以下，用毛细吸管在显微镜下挑取单个孢子点在新的PDA培养基上进行扩大培养。
菰黑粉菌单倍体鉴定：
1)菰黑粉菌鉴定：
以待测菌株的DNA为模板，使用菰黑粉菌特异验证引物Lam16A-F/R (见表1，Lam16A-F/R正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行PCR验证，扩增片段大小为 442bp。其中1-17、19-20、24-31、33-40出现单一条带，被鉴定为菰黑粉菌。菰黑粉菌的PCR鉴定如图1所示。
2)菰黑粉菌交配型鉴定：
以菰黑粉菌交配信息素肽基因Pra1-F/R、Pra2-F/R、Pra3-F/R的引物(见表1，Pra1-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；Pra2-F/R引物的正向引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；Pra3-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)进行多重PCR验证分离的单倍体菌株交配型。多重PCR反应体系：ddH2O 6μL，2×M5 Taq PCR Mix 10μL，模板1μL，Pra1-F/R、 Pra2-F/R、Pra3-F/R引物各0.5μL。反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。1％的凝胶电泳验证，条带单一的菌落即为单倍体菰黑粉菌。如图2所示。其中UeYD-3MT10与 UeYD-3 MT12为Pra3(MAT3)型交配位点，UeYD-3 MT24为Pra2(MAT2) 型交配位点。
表1 PCR引物序列
单倍体性亲和菌株筛选：
挑取PCR验证出交配型基因不同的单菌落UeYD-3 MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24转接于PDB培养基，28℃，180rpm培养48h，吸取不同交配型基因菌液各2.5μl，两两混匀进行配对，点在PDA平板上， 28℃培养。7天后观察，配对菌株是否产生白色菌丝。交配位点相同的 UeYD-3 MT10-12组合未能产生菌丝，而不同交配位点的UeYD-3 MT10-24 与MT12-24菌株在3～4天时在菌落边缘出现白色菌丝，且不同菌株组合配合产生的菌丝具有明显差异，UeYD-3 MT12-24的菌株组合产生的菌丝较长，UeYD-3 MT10-24组合产生的菌丝较短，将能产生菌丝的单倍体菌株 UeYD-3MT10、UeYD-3MT12、UeYD-3MT24分别于-80℃冰箱进行保存。
三、雄茭人工接种菰黑分菌产生正常茭白的方法
1)接种菌株准备
-80℃冰箱菌株在PDA平板划线，于28℃培养箱活化后，接种环刮取 UeYD-3 MT10、UeYD-3 MT12和UeYD-3 MT24长出的单菌落边缘，分别转接于PDB培养基中，28℃，180rpm培养4d，3500rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤1遍，再次离心收集菌体，用无菌水重悬，分别将UeYD-3 MT10 和UeYD-3 MT24、以及UeYD-3 MT12和UeYD-3 MT24两种菌液1:1等量混合备用。
2)接种苗的准备
挖取双季茭白YD-10雄茭地下部产生的带顶芽游茭进行移栽，长度 20cm左右，移栽后平铺于基质表面，覆盖浅水层(刚好没过游茭)，于室温 23～28℃，14d后芽萌发。
3)接种方法
芽萌发10d时，进行黑粉菌接种，轻柔将苗连完整根系挖出或轻轻剥去苗茎基部附近基质，剥去雄茭苗最外面一层叶鞘，用1ml医用注射器，在靠近雄茭生长锥的茎基部注射菌液，直至在苗的中心叶位置，有多余菌液溢出为止。尽量1次性完成注射，减少注射器对于植株的物理伤害。接种后放置在25℃黑暗培养3天，然后转移至温室中栽培，光照时间为16h光照/8h黑暗。接种14d，提取接种苗的叶鞘部位的DNA用引物Lam16A-F/R进行PCR 扩增，扩增扩增片段大小为442bp左右，说明菰黑粉菌已经成功接种于雄茭苗中。之后将接种成功的雄茭苗，放置于10h黑暗/14h光照，18℃黑暗/28 ℃光照的环境中生长30d；然后进行8h光照/16h黑暗(短日照)处理，温度为15℃黑暗/25℃光照，处理25～30d后，接种成功后的雄茭开始孕茭，孕茭20d后，剥去叶鞘，切开膨大的肉质茎，其内部为可食用的白色正常茭白。
对比例1
对单季茭白YD-3采用现有常规方法培养，YD-3从萌发到孕茭需要7 个月左右。
对比例2
对单季茭白YD-10采用现有常规方法培养，YD-10从萌发到孕茭需要 4个月左右。
经过上述实例验证，本发明成功的用于茭白育种，可以根据需要将不同的菌株和不同的茭白品种(单季茭白和双季雄性茭白)结合，加快了茭白的育种进程，改变了茭白的孕茭时间，相对原有的茭白孕茭时间有很大的提升，且产生的茭白是白色正常的可食用茭白。通过该方法有望在较短时间内育成一大批符合地域要求，上市时间要求，栽培条件要求的茭白的新品种，降低种植者每年用与茭白选种的大量劳力。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法
<130> 1
<141> 2021-11-19
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgaagac atcaaatcc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtaaagtcc gcatagca 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgactggttc ggtcaatcac ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggtactgc tggcttggac tc 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgacttatct gtgggacttg gag 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgttgagaa gacaaagcag cag 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgactgtttg gtctgagctg c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgtgaccg actttccgac 20
Claims (10)
1.一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；
步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；
步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；
步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。
2.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤一中单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株的方法包括如下步骤：挑取成熟老化期正常茭白YD-3号肉质茎内产生的黑色冬孢子堆，经无菌水稀释、固体PDA培养基培养、冲洗平板制备孢子悬浮液、显微镜观察已萌发成杆状的孢子数目在5个以下，在显微镜下挑取单个孢子点在新的PDA培养基上进行扩大培养得到。
3.根据权利要求2所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述固体PDA培养基培养的温度为28℃，培养时间为2d。
4.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述引物组包括Pra1-F/R引物、Pra2-F/R引物和Pra3-F/R引物，Pra1-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；Pra2-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；Pra3-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
5.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述多重PCR的反应体系为：ddH2O 6μL，2×M5 Taq PCR Mix 10μL，模板1μL，Pra1-F/R、Pra2-F/R、Pra3-F/R引物各0.5μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。
6.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤三中交配型基因不同的单菌落分别为UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24，通过挑取PCR验证出交配型基因不同的单菌落UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24转接于PDB培养基培养，之后取不同交配型基因菌液两两混匀进行配对，经PDA平板培养后观察配对菌株是否产生白色菌丝。
7.根据权利要求6所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤四中接种的菌液是将产生白色菌丝的单倍体菌株培养活化后，刮取UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24长出的单菌落边缘，分别转接于PDB培养基中，经培养、离心、洗涤、无菌水重悬后，分别将UeYD-3MT10和UeYD-3MT24、以及UeYD-3MT12和UeYD-3MT24的两种菌液1:1等量混合得到。
8.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤四中双季茭白雄茭的芽萌发方法是挖取双季茭白YD-10雄茭地下部产生的带顶芽游茭进行移栽，移栽后平铺于基质表面，覆盖浅水层，于室温23～28℃培养至芽萌发。
9.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤四中双季茭白雄茭进行接种的方法是双季茭白雄茭芽萌发10d时，将苗连完整根系挖出或剥去苗茎基部附近基质，剥去雄茭苗最外面一层叶鞘，在靠近雄茭生长锥的茎基部注射菌液，直至在苗的中心叶位置，有多余菌液溢出为止。
10.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述黑暗培养是在24-28℃黑暗培养3d；光照/黑暗交替培养是先在温室中栽培，光照时间为16-18h光照/6-8h黑暗，当验证菰黑粉菌成功接种于雄茭苗中后，再将接种成功的雄茭苗，放置于8-12h黑暗/12-16h光照，15-18℃黑暗/25-28℃光照的环境中生长30d；然后进行8h光照/16h黑暗处理，温度为15℃黑暗/25℃光照，处理25-30d后，接种成功后的雄茭开始孕茭，孕茭20d后，剥去叶鞘，肉质茎内部为白色正常茭白。
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