CN102121008B - 小麦耐盐基因TaOPR及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦耐盐基因TaOPR及含有所述基因的植物表达载体pSTART-TaOPR或pXQUbi-TaOPR，本发明还公开了所述基因TaOPR及其表达载体在培育抗盐植物特别是拟南芥或普通小麦中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的抗盐能力明显提高。

Description

小麦耐盐基因TaOPR及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及耐盐基因——基因TaOPR及其应用。

背景技术

土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。

目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因，但有关OPR类基因在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐盐基因——小麦基因TaOPR及其应用。

本发明的技术方案在于从小麦中分离得到小麦基因TaOPR，然后将该基因转化到拟南芥中以实现研究OPR基因的功能以及植物的耐盐机理。

本发明提供的小麦耐盐基因名称为小麦基因TaOPR，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含上述的小麦基因TaOPR的植物表达载体pSTART-TaOPR或pXQUbi-TaOPR。

本发明所述基因TaOPR在培育耐盐植物中的应用。其中所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

将本发明所述基因导入植物细胞，植物就可以获得富集重金属的能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaOPR的植物表达载体（pSTATR-TaOPR或pXQUbi-TaOPR）进行加工，如可以加入选择标记（GUS等）或者具有抗性的抗生素标记物（潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等）等。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pSTART。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐农作物品种。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦基因TaOPR，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高。

附图说明

图1  TaOPR 基因全长cDNA 序列的扩增结果 

分别在山融3号（SR3）和济南177（JN177）中获得开放阅读框长约1100bp 的PCR 产物；M为λDNA/(BamHⅠ+SacⅠ)Marker；下同。

图2 山融3号和济南177在200mM NaCl盐胁迫TaOPR的RT-PCR分析。

177表示济南177,SR3表示山融3号，Leaf表示叶，root表示根，Actin表示拟南芥Actin（内参），数字表示胁迫时间（小时）。

图3 pET32a-TaOPR在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达。

ES 1～4分别表示转pET32a-TaOPR大肠杆菌的四个克隆，0h和4h表示添加IPTG诱导0小时和4小时，箭头表示表达产物。

图4 BamHI和SacI双酶切中间载体pMD18-T-TaOPR和pSTART质粒。

左图表示pMD18-T-TaOPR载体经双酶切后的电泳图，右图表示pSTART质粒经双酶切后的电泳图。

图5 pSTART-TaOPR表达载体的BamHI和SacI双酶切验证。

大片段为质粒片段，小片段为TaOPR基因，1、2分别为两个克隆。

图6 转基因拟南芥阳性植株的基因组PCR验证。

1 为基因特异引物检测结果；2 为35S启动子正向引物加基因特意反向引物结果；

+ 代表模板为阳性质粒对照；- 为CLO-0野生型拟南芥基因组为模板的阴性对照；OE 1～3分别表示三个转基因株系。数据表明转基因株系OE1-3和阳性对照扩增出了目标大小条带，而阴性对照没有扩增出条带。

图7盐胁迫（100 mM NaCl）胁迫下转基因拟南芥株系与对照根系的生长状况。

Vector control表示转化pSTART空载体的转基因株系，Overexpress TaOPR 1或2为转化pSTART－TaOPR的转基因株系。数据表明转化TaOPR的转基因拟南芥的耐盐能力明显增加。

具体实施方式

实施例1、TaOPR的克隆

1.1提取小麦Total RNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4.4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。

1.2 cDNA反转录

反转录酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1.   12μl体系： Oligo（dT）      1μl

                 Total RNA        100ng-5μg

                 dNTP             1μl

                 DEPC水          补至12μl

2.   65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer     4μl

0.1M DTT                   2μl

RNaseOUT(Invitrogen)       1μl

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μl M-MLV RT，混匀，37℃反应50min；

5.70℃温育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μl RNase H（Invitrogen），37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3 开放阅读框的克隆和序列测定

1．引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物，扩增基因的开放阅读框。

2．PCR 反应体系（50μl）：

2×GC bufferⅠ          10μl

模板cDNA               1ul

dNTPs（2.5mM each）   0.5μl

Primer1 (10μM)          1μl

Primer2(10μM)          1μl

LA Taq(TaKaRa)         0.5ul

ddH₂O                 加至终体积50μl

3．PCR 反应程序为： 94℃ 预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35 次；72℃延伸7min。

4．扩增片段回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由上海Invirtron 公司完成。结果见图1。

1.4 基因表达分析（RT-PCR）

a.胁迫下RNA 的提取

山融3号和济南177种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时（约3周时间）开始施加盐胁迫（200mM NaCl），处理0、1、6、24、72或96小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。

b. 反转录（RT）产生cDNA

反转录产生cDNA，方法同上。

c． PCR 反应及电泳

1. 以cDNA 为模板，进行PCR 反应。引物如下

TaAct-S： 5’- GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’

TaAct-A: 5’- GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’

2. PCR 体系：

ddH₂O                       13.5μl

10×Taq buffer（Mg²⁺free）  2μl

MgCl₂（25mM）               1.2μl

Primer1（10μM）            1μl

Primer2（10μM）            1μl

dNTP（10mM each）           0.2μl

rTaq polymerase（5U/μl）   0.1μl

逆转录cDNA 模板             1μl

Total Volume                20μl

3. PCR 程序：

95℃ 5min, 25～30 cycles 95℃ 20s, 57℃ 60s, 72℃ 60s；72℃ 7min。根据内参Actin 的扩增情况确定PCR 的循环数，调整cDNA 模板的加入量。

4. 1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。

实施例2、原核表达分析

2.1 原核表达载体的构建

所用表达载体为Pet32a，受体菌为DE3。选用Hind III 和EcoRⅠ分别对pET32a和含有目的基因的pMD18－T 载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T₄ DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的原核表达载体，然后转化受体菌BL21（DE3） 感受态用于蛋白表达。

1. pET32a 和pMD18－T 的酶切

碱裂解法提取pET32a 和pMD18－T 的质粒，各取 10ul 进行HindIII 和EcoRⅠ双酶切。质粒提取方法如上，质粒双酶切体系如下：

EcoRⅠ       1μl

HindIII      1μl

10×K buffer 1μl

质粒         300ng

ddH₂O        至20μl

于37℃恒温水浴锅酶切4 小时以上。

2．酶切质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测及回收方法同上。

3．基因与酶切得到的pET32a 大片段的连接

连接反应组成： 10×连接酶缓冲液   1μl

T₄ DNA 连接酶      1μl

回收基因目的片断   6μl

回收产物pET32a     2μl

加ddH₂O 至终反应体积10μl，16℃连接过夜（回收目的基因与pET32a 的摩尔比为4：1）。

4. 转化大肠杆菌，方法同上。

5. 重组子的鉴定

① 质粒的酶切鉴定

挑取单菌落分别接种于5ml 含Amp 的LB 液体培养基中37℃震荡培养过夜，碱变性法提取质粒，选取合适的酶进行酶切，1℅的琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期分子量大小的片段。

② 质粒的PCR 验证

用基因特异引物进行PCR 扩增，1℅的琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期分子量大小的片段。

6. 转化受体菌BL21（DE3）

构建好的原核表达载体热击法转化大肠杆菌BL21（DE3） 感受态细胞。

2. 2 样品的制备

蛋白质提取液： 400mg SDS

100mg DTT

2.5ml 0.5 M Tris-HCl (pH6.8)

2ml glycerol

3mg 溴酚兰

混合后，加蒸馏水至10ml。

1．将含有表达片段的阳性克隆接种于5ml 含卡那霉素30μg/ml 的LB液体培养基中，37℃振荡培养3-5 小时。到OD600 约为1.0 时，吸出1ml 菌液留作对照组。

2．其余的培养液中加入1M 的IPTG 使终浓度分别为1.0mM。培养4h诱导蛋白表达。

3．未诱导和诱导的菌液都加入1.5ml 离心管中，10000rpm 离心1min 收集菌体，弃上清，加入100μl 蛋白提取液，旋涡振荡混匀, 沸水浴10min，13000rpm 离心15min，上清备用。

2. 3 SDS-PAGE 电泳

1． 药品配制:

(1) 10×电极缓冲液：取Tris 30.3g, Glycine 144g, SDS 10g, 加蒸馏水溶解后定容至1000ml；

(2) 40%丙烯酰胺母液(Acr)：取40g Acr，加蒸馏水溶解后定容到100ml；

(3) 2%甲叉双丙烯酰胺(Bis)；取2g Bis-Acr，加蒸馏水溶解后定容到100ml；

(4) 3 mol/L Tris-HCl (pH 8.8): 取36.3g Tris 溶入蒸馏水，定容至100ml，用1mol/L 的HCl 调pH 至8.8；

(5) 1mol/L Tris-HCl (pH 6.8): 取12.1g Tris 溶入蒸馏水，定容至100ml，用1mol/L 的HCl 调pH 至6.8；

(6) 10%SDS：称取SDS 粉末10g 加蒸馏水溶解定容至100ml；

(7) 10％AP：称取过硫酸铵1g 加蒸馏水溶解定容至10ml；

(8) TEMED：购自Amersham 公司；

(9) 固定染色液：取20ml 冰醋酸，80ml 甲醇加蒸馏水定容至200ml，称取200 mg 考马斯亮蓝R-250 溶解于上述溶液中。

2．SDS-PAGE 凝胶的制备

(1) 玻璃板洗净干燥之后，用1％琼脂封板。玻璃板放到制胶架上（带耳胶板在外），用夹子固定，向下端封口的塑料槽中加入适量熔化的琼脂，静置，直至琼脂凝固。

(2) 配胶 按照下表中的比例配制12%分离胶和4%浓缩胶。

聚丙烯酰胺凝胶组成       12%分离胶 26ml         4%浓缩胶 10ml

40% Acr                          7.62ml            0.986ml

2% Bis                           4.16ml            0.54ml

3 M Tris-HCl (pH 8.8)            3.28ml            ----

1 M Tris-HCl (pH6.8)             ----              1.25ml

10% SDS                          0.26ml            0.1ml

蒸馏水                           10.56ml           7.14ml

TEMED                            10.4μl            10μl

10% APS                          98μl              75μl

(3) 倒入分离胶后，在胶面上加一层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。

(4) 倒置胶板，流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽多余的水，配制浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气泡，静置至胶凝。

(5) 将胶板从制胶架上取下，去净胶板下部残留的琼脂；将胶板固定到电泳槽上（带耳胶板在内），直立电泳槽，夹子固定胶板。

(6) 拔出梳子，向电泳槽下槽加入电泳缓冲液，吹出进入玻璃板之间的气泡。将8μl 样品液点入点样孔中。然后将电泳槽放入4℃层析柜中，注意要水平，10mA 稳流电泳至指示剂迁移至凝胶底部后继续电泳30 分钟，再停止电泳。

(7) 电泳结束，取下胶板，揭开玻璃板，露出胶，用刀片切去浓缩胶，切掉分离胶一角作标记，进行染色。

(8) 染色与脱色。取下胶，置200ml 染色液中摇荡染色过夜，然后转移到装有蒸馏水的塑料盘中摇荡脱色2-4 小时，其间更换蒸馏水数次，直至到背景脱色干净为止。

(9) 保存结果。脱色干净的胶的电泳图谱用凝胶成像仪照相保存并分析。

结果见图3。

实施例3、植物表达载体的构建（35S启动子）

3.1 35S 启动子植物表达载体的构建

利用植物表达载体pSTART，选用SacI和BamHⅠ分别对pSTART 和含有目的基因的pMD18-T 载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T₄ DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

（1）质粒pSTART空载体和pMD18-T 的SacI和BamHⅠ双酶切

碱裂解法提取pSTART 空载体和pMD18-T 质粒，各取10μg 酶切，酶切体系如下：

BamHⅠ                        1μl

SacI                         1μl

pSTART载体/pMD18-T质粒      1~2μl

10×Buffer K                  1μl

ddH₂O 补充至                  20μl

于30℃恒温水浴锅酶切2 小时以上。双酶切后以1×TAE 为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART中14kb 的载体大片段和pMD18-T 中大约1.1 kb 的目的基因条带，回收该条带。

（2）pSTART质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

（3）经酶切和脱磷的pSTART 载体片段(约14kb)和pMD18-T 双酶切回收片段（约1.1kb）以摩尔比1:4 的比例进行16℃连接过夜。

（4）连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml 的LB 固体平板上37℃培养16 小时左右。

（5）重组子的鉴定

① 质粒的PCR 验证

挑取单菌落分别接种于5ml 含Kan 的LB 液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR 扩增，体系如下：

PCR 反应条件如下：预变性94℃ 3min，35 个循环为：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR 产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

② 质粒酶切鉴定

提质粒进行SacI 和BamHI 双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。结果见图4，5。

实施例4、农杆菌感受态的制备与转化

4.1 农杆菌AGL1/EHA105 感受态的制备

（1）从YEP 平板(含50μg/ml 利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml

利福平的YEP 液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

（2）取2ml 过夜培养液接种于50ml 含相同抗生素的YEP 液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀ 达0.5。

（3）菌液冰浴30min，4℃，5000rpm 离心10min，收集菌体。

（4）将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L 的NaCl 中，离心收集菌体。

（5）再悬浮于1ml 20mmol/L 冰预冷的CaCl₂ 溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml Eppendorf 管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

4．2 冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

（1）在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg 表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

（2）置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

（3）加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3小时。

（4）7000rpm 离心30s 收集菌体，涂于含50μg/ml 利福平、50μg/ml Kan 的YEP 平板上，28℃倒置暗培养2-3 天。

4.3 菌体PCR 鉴定

实施例5、转基因功能验证－拟南芥转化筛选及盐胁迫表性分析

5.1 拟南芥种植

将种子放入EP 管中，70%乙醇中浸泡5min，然后清洁剂(20% 漂水（白猫，上海），0.1% Triton)洗涤10-15min，无菌水冲洗4 次，4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5% agarose (冷却至40 度 以免把种子烫死，加agarose 是为了有利于种子散开)，铺于1/2 MS固体培养基上，超净台上吹干，（可多吹一会，以免种子萌发过程中培养皿盖子上有水汽）。转入人工气候室中培养一周左右，可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot，70℃烘干2 小时以上（杀死虫卵等，否则会长虫），然后将pot 放在营养液中，使其充分吸水，将在1/2 MS 固体培养基上生长7-10 天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中，盖上保鲜膜，转入人工气候室中培养。1-2 天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水 （浇在pot底下的铁盘子里）。

5.2 拟南芥转化

（1）当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导测花序的生成。转化前将材料浇透营养液。

（2）转化前一天，取2ml 活化的农杆菌AGL1 加到含相应抗生素的200ml YEP 培养基中，过夜培养至OD₆₀₀=1.0-1.2。

（3）离心收集菌体，并重悬于浸染液（5%蔗糖，0.04% Silwet L-77）中，使OD₆₀₀=0.8。

（4）将花序浸入浸染液30 秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

（5）用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，至于19-22℃培养室培养。

（6）隔5-7 天再同法浸染一次。

（7）大约一个月后收获种子。

5.3 拟南芥转化阳性株系筛选

（1） 收获的T₀ 代种子消毒后（75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3－5 次），铺于含50μg/ml Kan 或50μg/ml Hygo 的MS 筛选培养基上 （方法同上）。

（2） 4℃春化48h，移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。

（3） 等植物绝大多数花苞已经结果荚，用小绳将植物单株绑起，以便单株收种子T₁代种子。

（4） PCR 扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物进行基因组PCR，鉴定阳性克隆。结果见图6。

（5） T₁ 种子处理同前，在T₂ 代植物中挑选抗性比为3:1 的单插入独立株系。

5.4 拟南化阳性株系盐胁迫表性分析

（1）将拟南芥种子用0.1%升汞表面灭菌15min，用无菌水洗3-4遍，然后摆放到1/2 MS固体培养基平板上，4°C同步化4天后转入培养间，竖直培养。

（2）3天后将长势一致的已经长出子叶和根部的小苗转入含有添加100mMNaCl培养基的方皿中，用封口膜封好，并竖直培养，在合适的时间照相记录。结果见图7。

Claims (2)

1.一种小麦耐盐基因TaOPR，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.权利要求1所述基因TaOPR在培育抗盐拟南芥或普通小麦中的应用。

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