CN102121008B - 小麦耐盐基因TaOPR及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦耐盐基因TaOPR及含有所述基因的植物表达载体pSTART-TaOPR或pXQUbi-TaOPR,本发明还公开了所述基因TaOPR及其表达载体在培育抗盐植物特别是拟南芥或普通小麦中的应用。实验证明,本发明所述转基因植株的抗盐能力明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域,尤其涉及耐盐基因——基因TaOPR及其应用。
背景技术
土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展,土壤盐渍化愈来愈严重,已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多,而土壤盐渍化更为严重,已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此,除了缓解土壤盐渍化以外,培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。
利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中,以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植,是一项具有广阔应用前景的技术。
利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展,克隆了大量相关基因,并将这些基因转入植物中,用于耐盐机制研究。一些实验表明,将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中,其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。
目前,已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因,但有关OPR类基因在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种耐盐基因——小麦基因TaOPR及其应用。
本发明的技术方案在于从小麦中分离得到小麦基因TaOPR,然后将该基因转化到拟南芥中以实现研究OPR基因的功能以及植物的耐盐机理。
本发明提供的小麦耐盐基因名称为小麦基因TaOPR,所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了含上述的小麦基因TaOPR的植物表达载体pSTART-TaOPR或pXQUbi-TaOPR。
本发明所述基因TaOPR在培育耐盐植物中的应用。其中所述植物优选是普通小麦或拟南芥。
将本发明所述基因导入植物细胞,植物就可以获得富集重金属的能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选,可以对含有所述基因TaOPR的植物表达载体(pSTATR-TaOPR或pXQUbi-TaOPR)进行加工,如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素,卡那霉素,庆大霉素等)等。
任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用,本发明优选的载体是pSTART。
本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐农作物品种。
本发明的有益效果:利用现有的植物基因工程技术,本发明首次克隆得到了小麦基因TaOPR,并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥,经过比较分析证明,转基因植株的耐盐能力明显提高。
附图说明
图1 TaOPR 基因全长cDNA 序列的扩增结果
分别在山融3号(SR3)和济南177(JN177)中获得开放阅读框长约1100bp 的PCR 产物;M为λDNA/(BamHⅠ+SacⅠ)Marker;下同。
图2 山融3号和济南177在200mM NaCl盐胁迫TaOPR的RT-PCR分析。
177表示济南177,SR3表示山融3号,Leaf表示叶,root表示根,Actin表示拟南芥Actin(内参),数字表示胁迫时间(小时)。
图3 pET32a-TaOPR在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达。
ES 1~4分别表示转pET32a-TaOPR大肠杆菌的四个克隆,0h和4h表示添加IPTG诱导0小时和4小时,箭头表示表达产物。
图4 BamHI和SacI双酶切中间载体pMD18-T-TaOPR和pSTART质粒。
左图表示pMD18-T-TaOPR载体经双酶切后的电泳图,右图表示pSTART质粒经双酶切后的电泳图。
图5 pSTART-TaOPR表达载体的BamHI和SacI双酶切验证。
大片段为质粒片段,小片段为TaOPR基因,1、2分别为两个克隆。
图6 转基因拟南芥阳性植株的基因组PCR验证。
1 为基因特异引物检测结果;2 为35S启动子正向引物加基因特意反向引物结果;
+ 代表模板为阳性质粒对照;- 为CLO-0野生型拟南芥基因组为模板的阴性对照;OE 1~3分别表示三个转基因株系。数据表明转基因株系OE1-3和阳性对照扩增出了目标大小条带,而阴性对照没有扩增出条带。
图7盐胁迫(100 mM NaCl)胁迫下转基因拟南芥株系与对照根系的生长状况。
Vector control表示转化pSTART空载体的转基因株系,Overexpress TaOPR 1或2为转化pSTART-TaOPR的转基因株系。数据表明转化TaOPR的转基因拟南芥的耐盐能力明显增加。
具体实施方式
实施例1、TaOPR的克隆
1.1提取小麦Total RNA
1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中,在液氮中充分研磨成粉末;
2.待液氮挥发干,立即转移到2ml的离心管中,每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液,融化后,用加样枪反复吸吹,剧烈振荡混匀样品,使样品充分裂解,室温放置5分钟;
3.加入0.2ml氯仿(chloroform),剧烈振荡混匀15秒,室温放置10分钟;
4.4℃,12000rpm离心15分钟;
5.用移液器小心吸出上层水相,加入新的1.5ml的离心管中,加入500μl的异丙醇(1:1体积),充分混匀,-20℃,沉淀30min或过夜;
6.4℃,12000rpm离心10min,小心弃去上清液;
7.RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃,8000rpm离心10min收集沉淀;
8.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀;
9.去上清,RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟,RNA略显透明,加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存);
10.紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。
注:a)用紫外分光光度计检测RNA的产量,在260nm处的吸光度,1OD=40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值,检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9~2.1之间)。
b)用1%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水,加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色,另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。
1.2 cDNA反转录
反转录酶:M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。
1. 12μl体系: Oligo(dT) 1μl
Total RNA 100ng-5μg
dNTP 1μl
DEPC水 补至12μl
2. 65℃变性5min,迅速插入冰中,然后依次加入:
5×First-Strand Buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
RNaseOUT(Invitrogen) 1μl
3.轻轻混匀,37℃反应2min;
4.加入1μl M-MLV RT,混匀,37℃反应50min;
5.70℃温育15min使M-MLV RT失活;
6.加入1μl RNase H(Invitrogen),37℃反应20min;
7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。
1.3 开放阅读框的克隆和序列测定
1.引物序列:根据测序结果,设计基因上下游引物,扩增基因的开放阅读框。
2.PCR 反应体系(50μl):
2×GC bufferⅠ 10μl
模板cDNA 1ul
dNTPs(2.5mM each) 0.5μl
Primer1 (10μM) 1μl
Primer2(10μM) 1μl
LA Taq(TaKaRa) 0.5ul
ddH2O 加至终体积50μl
3.PCR 反应程序为: 94℃ 预变性5min;94℃变性45sec,55℃复性45sec,72℃延伸1.5min,循环35 次;72℃延伸7min。
4.扩增片段回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌DH10B,测序由上海Invirtron 公司完成。结果见图1。
1.4 基因表达分析(RT-PCR)
a.胁迫下RNA 的提取
山融3号和济南177种子正常萌发,Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)开始施加盐胁迫(200mM NaCl),处理0、1、6、24、72或96小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。
b. 反转录(RT)产生cDNA
反转录产生cDNA,方法同上。
c. PCR 反应及电泳
1. 以cDNA 为模板,进行PCR 反应。引物如下
TaAct-S: 5’- GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’
TaAct-A: 5’- GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’
2. PCR 体系:
ddH2O 13.5μl
10×Taq buffer(Mg2+free) 2μl
MgCl2(25mM) 1.2μl
Primer1(10μM) 1μl
Primer2(10μM) 1μl
dNTP(10mM each) 0.2μl
rTaq polymerase(5U/μl) 0.1μl
逆转录cDNA 模板 1μl
Total Volume 20μl
3. PCR 程序:
95℃ 5min, 25~30 cycles 95℃ 20s, 57℃ 60s, 72℃ 60s;72℃ 7min。根据内参Actin 的扩增情况确定PCR 的循环数,调整cDNA 模板的加入量。
4. 1%琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。
实施例2、原核表达分析
2.1 原核表达载体的构建
所用表达载体为Pet32a,受体菌为DE3。选用Hind III 和EcoRⅠ分别对pET32a和含有目的基因的pMD18-T 载体进行双酶切,分别回收载体大片段和目的基因小片段,用T4 DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞,鉴定重组子后即得到带有目的基因的原核表达载体,然后转化受体菌BL21(DE3) 感受态用于蛋白表达。
1. pET32a 和pMD18-T 的酶切
碱裂解法提取pET32a 和pMD18-T 的质粒,各取 10ul 进行HindIII 和EcoRⅠ双酶切。质粒提取方法如上,质粒双酶切体系如下:
EcoRⅠ 1μl
HindIII 1μl
10×K buffer 1μl
质粒 300ng
ddH2O 至20μl
于37℃恒温水浴锅酶切4 小时以上。
2.酶切质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测及回收方法同上。
3.基因与酶切得到的pET32a 大片段的连接
连接反应组成: 10×连接酶缓冲液 1μl
T4 DNA 连接酶 1μl
回收基因目的片断 6μl
回收产物pET32a 2μl
加ddH2O 至终反应体积10μl,16℃连接过夜(回收目的基因与pET32a 的摩尔比为4:1)。
4. 转化大肠杆菌,方法同上。
5. 重组子的鉴定
① 质粒的酶切鉴定
挑取单菌落分别接种于5ml 含Amp 的LB 液体培养基中37℃震荡培养过夜,碱变性法提取质粒,选取合适的酶进行酶切,1℅的琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期分子量大小的片段。
② 质粒的PCR 验证
用基因特异引物进行PCR 扩增,1℅的琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期分子量大小的片段。
6. 转化受体菌BL21(DE3)
构建好的原核表达载体热击法转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞。
2. 2 样品的制备
蛋白质提取液: 400mg SDS
100mg DTT
2.5ml 0.5 M Tris-HCl (pH6.8)
2ml glycerol
3mg 溴酚兰
混合后,加蒸馏水至10ml。
1.将含有表达片段的阳性克隆接种于5ml 含卡那霉素30μg/ml 的LB液体培养基中,37℃振荡培养3-5 小时。到OD600 约为1.0 时,吸出1ml 菌液留作对照组。
2.其余的培养液中加入1M 的IPTG 使终浓度分别为1.0mM。培养4h诱导蛋白表达。
3.未诱导和诱导的菌液都加入1.5ml 离心管中,10000rpm 离心1min 收集菌体,弃上清,加入100μl 蛋白提取液,旋涡振荡混匀, 沸水浴10min,13000rpm 离心15min,上清备用。
2. 3 SDS-PAGE 电泳
1. 药品配制:
(1) 10×电极缓冲液:取Tris 30.3g, Glycine 144g, SDS 10g, 加蒸馏水溶解后定容至1000ml;
(2) 40%丙烯酰胺母液(Acr):取40g Acr,加蒸馏水溶解后定容到100ml;
(3) 2%甲叉双丙烯酰胺(Bis);取2g Bis-Acr,加蒸馏水溶解后定容到100ml;
(4) 3 mol/L Tris-HCl (pH 8.8): 取36.3g Tris 溶入蒸馏水,定容至100ml,用1mol/L 的HCl 调pH 至8.8;
(5) 1mol/L Tris-HCl (pH 6.8): 取12.1g Tris 溶入蒸馏水,定容至100ml,用1mol/L 的HCl 调pH 至6.8;
(6) 10%SDS:称取SDS 粉末10g 加蒸馏水溶解定容至100ml;
(7) 10%AP:称取过硫酸铵1g 加蒸馏水溶解定容至10ml;
(8) TEMED:购自Amersham 公司;
(9) 固定染色液:取20ml 冰醋酸,80ml 甲醇加蒸馏水定容至200ml,称取200 mg 考马斯亮蓝R-250 溶解于上述溶液中。
2.SDS-PAGE 凝胶的制备
(1) 玻璃板洗净干燥之后,用1%琼脂封板。玻璃板放到制胶架上(带耳胶板在外),用夹子固定,向下端封口的塑料槽中加入适量熔化的琼脂,静置,直至琼脂凝固。
(2) 配胶 按照下表中的比例配制12%分离胶和4%浓缩胶。
聚丙烯酰胺凝胶组成 12%分离胶 26ml 4%浓缩胶 10ml
40% Acr 7.62ml 0.986ml
2% Bis 4.16ml 0.54ml
3 M Tris-HCl (pH 8.8) 3.28ml ----
1 M Tris-HCl (pH6.8) ---- 1.25ml
10% SDS 0.26ml 0.1ml
蒸馏水 10.56ml 7.14ml
TEMED 10.4μl 10μl
10% APS 98μl 75μl
(3) 倒入分离胶后,在胶面上加一层正丁醇,静置,直至分离胶凝固。
(4) 倒置胶板,流出正丁醇,用蒸馏水冲洗胶面,用滤纸吸尽多余的水,配制浓缩胶,混匀后倒入玻璃板之间,将梳子放置在玻璃板间,注意不要产生气泡,静置至胶凝。
(5) 将胶板从制胶架上取下,去净胶板下部残留的琼脂;将胶板固定到电泳槽上(带耳胶板在内),直立电泳槽,夹子固定胶板。
(6) 拔出梳子,向电泳槽下槽加入电泳缓冲液,吹出进入玻璃板之间的气泡。将8μl 样品液点入点样孔中。然后将电泳槽放入4℃层析柜中,注意要水平,10mA 稳流电泳至指示剂迁移至凝胶底部后继续电泳30 分钟,再停止电泳。
(7) 电泳结束,取下胶板,揭开玻璃板,露出胶,用刀片切去浓缩胶,切掉分离胶一角作标记,进行染色。
(8) 染色与脱色。取下胶,置200ml 染色液中摇荡染色过夜,然后转移到装有蒸馏水的塑料盘中摇荡脱色2-4 小时,其间更换蒸馏水数次,直至到背景脱色干净为止。
(9) 保存结果。脱色干净的胶的电泳图谱用凝胶成像仪照相保存并分析。
结果见图3。
实施例3、植物表达载体的构建(35S启动子)
3.1 35S 启动子植物表达载体的构建
利用植物表达载体pSTART,选用SacI和BamHⅠ分别对pSTART 和含有目的基因的pMD18-T 载体进行双酶切,分别回收载体大片段和目的基因小片段,用T4 DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞,鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。
(1)质粒pSTART空载体和pMD18-T 的SacI和BamHⅠ双酶切
碱裂解法提取pSTART 空载体和pMD18-T 质粒,各取10μg 酶切,酶切体系如下:
BamHⅠ 1μl
SacI 1μl
pSTART载体/pMD18-T质粒 1~2μl
10×Buffer K 1μl
ddH2O 补充至 20μl
于30℃恒温水浴锅酶切2 小时以上。双酶切后以1×TAE 为电泳缓冲液,将酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART中14kb 的载体大片段和pMD18-T 中大约1.1 kb 的目的基因条带,回收该条带。
(2)pSTART质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。
(3)经酶切和脱磷的pSTART 载体片段(约14kb)和pMD18-T 双酶切回收片段(约1.1kb)以摩尔比1:4 的比例进行16℃连接过夜。
(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B 感受态细胞,转化菌在含Kan 50μg/ml 的LB 固体平板上37℃培养16 小时左右。
(5)重组子的鉴定
① 质粒的PCR 验证
挑取单菌落分别接种于5ml 含Kan 的LB 液体培养基中37℃振荡培养过夜,碱变性法提取质粒,用基因特异引物进行PCR 扩增,体系如下:
PCR 反应条件如下:预变性94℃ 3min,35 个循环为:94℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃1min,最后,72℃延伸10min。PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
② 质粒酶切鉴定
提质粒进行SacI 和BamHI 双酶切,酶切体系同上。0.8%琼脂糖凝胶电泳,检测是否含有预期分子量大小的片段,验证载体的正确构建。结果见图4,5。
实施例4、农杆菌感受态的制备与转化
4.1 农杆菌AGL1/EHA105 感受态的制备
(1)从YEP 平板(含50μg/ml 利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落,接种于含50μg/ml
利福平的YEP 液体培养基中,200rpm/min,28℃培养过夜。
(2)取2ml 过夜培养液接种于50ml 含相同抗生素的YEP 液体培养基中在相同条件下培养至OD600 达0.5。
(3)菌液冰浴30min,4℃,5000rpm 离心10min,收集菌体。
(4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L 的NaCl 中,离心收集菌体。
(5)再悬浮于1ml 20mmol/L 冰预冷的CaCl2 溶液中,以200μl/管将菌液分装在1.5ml Eppendorf 管中,置液氮中速冻1min,-70℃保存备用。
4.2 冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105
(1)在室温下融化农杆菌感受态细胞,加入1μg 表达载体质粒DNA,混匀后冰浴30min。
(2)置液氮速冻1min,迅速移至37℃保温3min。
(3)加入无抗生素的YEP 800μl,28℃震荡培养3小时。
(4)7000rpm 离心30s 收集菌体,涂于含50μg/ml 利福平、50μg/ml Kan 的YEP 平板上,28℃倒置暗培养2-3 天。
4.3 菌体PCR 鉴定
实施例5、转基因功能验证-拟南芥转化筛选及盐胁迫表性分析
5.1 拟南芥种植
将种子放入EP 管中,70%乙醇中浸泡5min,然后清洁剂(20% 漂水(白猫,上海),0.1% Triton)洗涤10-15min,无菌水冲洗4 次,4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5% agarose (冷却至40 度 以免把种子烫死,加agarose 是为了有利于种子散开),铺于1/2 MS固体培养基上,超净台上吹干,(可多吹一会,以免种子萌发过程中培养皿盖子上有水汽)。转入人工气候室中培养一周左右,可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot,70℃烘干2 小时以上(杀死虫卵等,否则会长虫),然后将pot 放在营养液中,使其充分吸水,将在1/2 MS 固体培养基上生长7-10 天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中,盖上保鲜膜,转入人工气候室中培养。1-2 天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水 (浇在pot底下的铁盘子里)。
5.2 拟南芥转化
(1)当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时,将花序顶端减掉以诱导测花序的生成。转化前将材料浇透营养液。
(2)转化前一天,取2ml 活化的农杆菌AGL1 加到含相应抗生素的200ml YEP 培养基中,过夜培养至OD600=1.0-1.2。
(3)离心收集菌体,并重悬于浸染液(5%蔗糖,0.04% Silwet L-77)中,使OD600=0.8。
(4)将花序浸入浸染液30 秒,其间前后摆动花序,使花序上形成一层膜。
(5)用保鲜膜覆盖花序,暗培养一天后揭去保鲜膜,至于19-22℃培养室培养。
(6)隔5-7 天再同法浸染一次。
(7)大约一个月后收获种子。
5.3 拟南芥转化阳性株系筛选
(1) 收获的T0 代种子消毒后(75%乙醇5min,清洁剂洗涤10-15min,无菌水冲洗3-5 次),铺于含50μg/ml Kan 或50μg/ml Hygo 的MS 筛选培养基上 (方法同上)。
(2) 4℃春化48h,移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。
(3) 等植物绝大多数花苞已经结果荚,用小绳将植物单株绑起,以便单株收种子T1代种子。
(4) PCR 扩增以转化株系的基因组DNA为模板,使用基因特异引物进行基因组PCR,鉴定阳性克隆。结果见图6。
(5) T1 种子处理同前,在T2 代植物中挑选抗性比为3:1 的单插入独立株系。
5.4 拟南化阳性株系盐胁迫表性分析
(1)将拟南芥种子用0.1%升汞表面灭菌15min,用无菌水洗3-4遍,然后摆放到1/2 MS固体培养基平板上,4°C同步化4天后转入培养间,竖直培养。
(2)3天后将长势一致的已经长出子叶和根部的小苗转入含有添加100mMNaCl培养基的方皿中,用封口膜封好,并竖直培养,在合适的时间照相记录。结果见图7。
Claims (2)
1.一种小麦耐盐基因TaOPR,其特征在于:所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.权利要求1所述基因TaOPR在培育抗盐拟南芥或普通小麦中的应用。
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CN101481693A (zh) * | 2009-01-19 | 2009-07-15 | 山东大学 | 小麦耐盐基因TaCHP及其应用 |
CN101508997A (zh) * | 2009-02-20 | 2009-08-19 | 山东大学 | 小麦盐敏基因TaDi19A及其应用 |
-
2010
- 2010-12-24 CN CN201010605041A patent/CN102121008B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Cuiling Li et al.TaCHP: a wheat zinc finger protein gene down-regulated by abscisic acid and salinity stress plays a positive role in stress tolerance.《Plant Physiology》.2010,第154卷(第1期),211-221. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN102121008A (zh) | 2011-07-13 |
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