CN101481693A - 小麦耐盐基因TaCHP及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦耐盐基因即小麦CHP类锌指蛋白基因TaCHP及含有所述基因TaCHP的植物表达载体，本发明还公开了所述基因TaCHP在培育抗盐植物特别是小麦中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的抗盐能力明显提高。

Description

小麦耐盐基因TaCHP及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及耐盐基因——锌指蛋白基因TaCHP及其应用。

背景技术

土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种，用于在盐碱地种植是一项具有广阔应用前景的技术。

利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力提高。

目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因，其中大部分为转录因子相关基因。它们可通过调节下游耐盐相关基因的表达，来调控植物的耐盐能力。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力。

锌指蛋白是一类非常重要的蛋白质，根据序列特征，锌指蛋白可分为多种类型，不同类型锌指蛋白在细胞中的功能具有显著差异。近年来已有试验表明，部分锌指蛋白在植物耐盐过程中发挥重要作用。但有关CHP类锌指蛋白基因在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐盐基因——小麦CHP类锌指蛋白基因TaCHP及其应用。

本发明的技术方案在于从小麦中分离得到CHP类锌指蛋白基因——小麦CHP类锌指蛋白基因TaCHP，然后将该基因转到小麦等农作物中以实现农作物在盐渍化土壤中种植，重复利用次质土壤。

本发明提供的小麦耐盐基因名称为小麦CHP类锌指蛋白基因TaCHP，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含上述的小麦CHP类锌指蛋白基因TaCHP的植物表达载体pBI121或pUN1301。

本发明所述基因TaCHP在培育耐盐植物中的应用。所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

将本发明所述基因导入植物细胞，植物就可以获得富集重金属的能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaCHP的植物表达载体(pBI121或pUN1301)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pUN1301。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐农作物物品种。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦CHP类锌指蛋白基因TaCHP，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入小麦和拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高。

附图说明

图1 TaCHP基因全长cDNA序列的扩增结果

A，3’race分别在山融3号和济南177中获得长约700bp的PCR产物。B，5’race分别在山融3号和济南177中获得长约600bp的PCR产物。C，山融3号和济南177中TaCHP基因开放阅读框的扩增获得650bp的片段。D，山融3号和济南177中TaCHPDNA序列扩增获得约800bp片段。SR3，山融3号(Shanrong No.3)；JN177，济南177(Jinan177)；下同。

M为λ DNA/(EcoR I+Hind III)Marker；下同。

图2 山融3号和济南177盐胁迫根系中TaCHP的RT-PCR分析。

图3 RT-PCR分析PEG处理后山融3号不同组织中TaCHP基因的表达量。

图4 RT-PCR分析H2O2处理后山融3号不同组织中TaCHP基因的表达量。

图5 盐胁迫和ABA处理后TaCHP基因在山融3号和济南177中的Real-time分析结果。

图6 TaCHP基因mRNA在根部的组织原位杂交定位。

a为JN177未经盐处理的对照根尖；b为a信号部位的放大，c为d信号部位的放大，d，SR3未经盐处理的对照根尖；e，JN177经200mM NaCl处理后的根尖；f，SR3经200mMNaCl处理后的根尖；g，JN177未经盐处理对照的根部成熟区；h，SR3未经盐处理对照的根部成熟区；i，JN177经200mM NaCl处理后的根部成熟区；j，SR3经200mM NaCl处理后的根部成熟区；k，为TaCHP基因正义RNA探针杂交的纵切。l：为h信号部位放大。→：杂交信号。C：皮层细胞V：微管组织；RM：根尖。

图7 pET24a/TaCHP在大肠杆菌DE3中的诱导表达。

图8 SacI和KpnI双酶切pUN1301质粒和中间载体pMD18-T/TaCHP。

图9 pUN1301/TaCHP表达载体的验证。

图10 植物表达载体pBI121/TaCHP构建

A：SacI和XbaI双酶切pBI121和pMD18-T/TaCHP。分别得到12kb大片段和650bpTaCHP片段；B：pBI121/TaCHP表达载体阳性克隆的PCR鉴定。扩增获得350bp的片段。

图11 转基因拟南芥株系及对照在不同浓度NaCl处理下的生长

左：转入pBI121空载体的对照株系；

右：转入pBI121/TaCHP基因的株系；

A：1/2MS+0mM NaCl；B：1/2MS+50mM NaCl；C：1/2MS+100mM NaCl；D：1/2MS+150mM NaCl。

图12 盐胁迫对转基因拟南芥株系与对照根系的生长的影响。

图13 转基因小麦株系及对照在盐水浇灌条件下的生长情况。

两张照片代表两个转基因株系，照片中右边为pUN1301空载体、左边为pUN1301/TaCHP株系。

图14 pUN1301/TaCHP转基因株系的PCR鉴定。

其中1，2，3，4，5，6，8为阳性株系，--为未转基因植株对照；+：为质粒对照。

具体实施方式

实施例1、TaCHP的克隆

1.1 提取小麦Total RNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4.4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min或过夜；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，10D＝40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1ul RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。

1.2 第一链cDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)

1.Poly-A RNA controls的制备(用Poly-A control dilution buffer稀释Poly-Acontrol stock)，按照下面的比例稀释：

2.反应体系

反应试剂                     体积

RNA样品(1ug/ul)              8μl

Diluted poly-A RNA controls   2μl

T7-oligo(dT)Primer，50uM           2μl

RNase-free water                   0μl

总体积                             12μl

将上述试剂样品轻轻混匀，70℃温浴10分钟，置于冰上至少2分钟，离心片刻；

3.期间按照下表配制剩余组分：

反应试剂                          体积

5×1st Strand Reaction Mix         4μl

DTT(0.1M)                         2μl

dNTP(10mM)                        1μl

总体积                            7μl

混匀，42℃，温浴2分钟；2uL(8～16ug起始)。

4.将混合液加入已经完成反应的12μl RNA/T7-oligo(dT)溶液中，轻弹管壁混匀，轻微离心50秒，加入1μl SuperScript II RT(200U/μl)，使总反应体积为20μl。混匀后立即放入42℃温育1小时，4℃冷却5分钟。

1.3 第二链cDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)

1.将1st cDNA合成产物置于冰上，加入下列试剂：

试剂组分                             体积

RNase-Free water                     91μl

5×2nd Strand Buffer                  30μl

dNTP(10mM)                           3μl

E.coli DNA Ligase(10U/ul)             1μl

E.coli DNA Polymerase(10U/ul)         4μl

E.coli RNase H(10U/ul)                1μl

总体积                               130μl

混匀，16℃，反应2小时；

2.加入2μl T4 DNA Polymerase，混匀，16℃，5分钟；

3.加入10μl EDTA(0.5M)，混匀，终止反应。-20℃保存。

1.4 快速扩增cDNA末端

(RACE，Rapid Amplification of cDNA Ends，参照Clonetech，SMART RACE cDNAAmplification Kit操作指南进行)

BD SMART II^TM A Oligonucleotide引物序列：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’

3’-RACE CDS Primer A(3’-CDS)引物序列：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)

5’-RACE CDS Primer(5’-CDS)引物序列：

5’-(T)25V N-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)

10X Universal Primer A Mix(UPM)引物序列：

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

Nested Universal Primer A(NUP)引物序列：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

设计合适的5’RACE基因特异引物

设计合适的3’RACE基因特异引物。

1.5 5’RACE的一链cDNA合成

1.在0.5ml离心管中加入以下成分：3μl(1-5μg)total RNA；1μl 5’-CDSprimer；1μlSMART II A Oligo，混匀，70℃变性10min，置于冰浴中至少2min，短暂离心。

2.在上述管中加入以下成分：2.0μl 5×first-strand buffer；1.0μlDTT(20mmol/L)；1.0μl dNTP mix(each 10mmol/L)；1.0μl PowerScript ReverseTranscriptase。

3.轻轻混匀各成分，短暂离心，42℃空气浴中反应1-1.5hr。

4.加入100μl Tricine-EDTA buffer稀释第一链反应产物。

5.72℃加热7min，样品5’-RACE-Ready cDNA贮存于-20℃冰箱中保存。

1.6 5′-RACE

根据已测序EST的信息，设计基因内部引物GSP，利用BD SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit进行快速扩增cDNA末端(RACE，Rapid Amplification of cDNAEnds，参照Clonetech，SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南进行)，得到全长cDNA，包括5’、3’非编码区。

1.在50μl反应体系中加入下列成分：

PCR-grade Water 4.5μl

10×Advantage 2 PCR buffer 5μl

DNTP Mix(10mmol/L)1μl

50×Advantage 2 Polymerase Mix 1μl

10×UPM 5μl

GSP(10μmol/L)1μl

5’-RACE-Ready cDNA 2.5μl

Final Volume 50μl

轻轻混匀后，短暂离心，反应液上方滴加两滴石蜡油。

2.反应按以下Touchdown PCR条件进行：94℃ 5min，94℃ 15-30sec，72℃2-5min，5cycles；94℃ 15-30sec，70℃ 15-30sec，72℃ 2-5min，5cycles；94℃15-30sec，65-68℃ 15-30sec，72℃ 2-5min，25-30cycles；10℃保存。最后循环的退火温度，根据设计的基因特异引物GSP的Tm值进行调整。

3.从反应液中取5μl电泳检查，若扩增带较弱可增加5个循环；若扩增带为弥散的smear带，可考虑进行巢式PCR。

4.巢式PCR：用Tricine-EDTA buffer稀释5μl第一步PCR产物至250μl，取5μl作为巢式PCR的模板；反应体系中的引物为1μl NUP primer和1μl NGSP；反应条件按上述Touchdown PCR的最后循环进行15-20cycles。结果见图1B。

1.7 3’RACE扩增

3’RACE的一链cDNA合成基本步骤同1.5，用3’-CDS primer替代5’-CDSprimer

做反转录反应。3’RACE扩增基本步骤同1.6。扩增片段连接T-Vector后选取阳性克隆测序。结果见图1A。

1.8 开放阅读框的克隆和序列测定

1.引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物，扩增基因的开放阅读框。

2.PCR反应体系(50μL)：

2×GC buffer I                10μl

模板cDNA                      1ul

dNTPs(2.5mM each)             0.5μl

Primer1(10μM)                 1μl

Primer2(10μM)                 1μl

LA Taq(TaKaRa)                0.5ul

ddH₂O                         加至终体积50μl

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段的回收、与T载体的连接转化方法同上，测序由上海Invirtron公司完成。结果见图1C。

1.9 基因组序列的扩增

a.CTAB法提取山融3号，济南177以及长穗偃麦草的基因组DNA

1.取100mg左右的新鲜叶片，放入1.5ml离心管中，液氮速冻，研磨器中磨碎，加入600μl预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液，混匀置于65℃水浴中放置90min；

2.混合物冷至室温后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000rpm离心10min；

3.取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000rpm离心10min；

4.取上清，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和0.7倍体积的异丙醇，仔细混匀，室温放置15min，沉淀DNA；

5.用一玻璃钩将DNA钩出，并转移至一装有800μl 70％乙醇的干净Eppendorf管中，室温放置数分钟洗涤沉淀，6000g离心5min；

6.尽量去尽上清，空气干燥数分钟，溶于适量TE缓冲液中。

b.基因组序列的PCR扩增

基因组序列的扩增以山融3号，济南177和长穗偃麦草的基因组DNA为模板，PCR

引物用基因特异引物，PCR体系同上。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。产物电泳，扩增片段的回收，与T载体的连接转化及鉴定方法同上，测序由上海Invirtron公司完成。

退火温度和延伸时间根据引物的性质调节。结果见图1D。

1.10 基因表达分析(RT-PCR和real-time PCR)

a.胁迫下RNA的提取

山融3号和济南177种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)

开始施加盐胁迫(200mM NaCl)、干旱胁迫(15％ PEG)、AlCl3(200uM)、100μMH₂O₂。分别在处理后的0、1、3、6、24，48小时取幼嫩的叶片和根系，Trizol法提取RNA，方法同上。

b.逆转录(RT)产生cDNA

逆转录产生cDNA，方法同上。

c.PCR反应及电泳

1.以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下

TaAct-S：5’-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’

TaAct-A：5’-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3’

2.PCR体系：

ddH₂O                         13.5μl

10×Taq buffer(Mg2+free)      2μl

MgCl₂(25mM)                   1.2μl

Primer1(10μM)                1μl

Primer2(10μM)                1μl

dNTP(10mM each)               0.2μl

rTaq polymerase(5U/μl)        0.1μl

逆转录cDNA模板                1μl

Total Volume                  20μl

3.PCR程序：

95℃ 5min，25～30 cycles 95℃ 20s，57℃ 60s，72℃ 60s；72℃ 7min.

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

4.1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2，3，4。

d.Real-Time PCR

按组分配置PCR反应液(在冰上进行)

试剂                          使用量

10XPCR buffer                 2μl

Mg2+(25mM)                    2μl

SYBR GREEN                    1μl

dNTP(各10mM)                  0.5μl

PCR Forward Primer(10uM)      0.4μl

PCR Reverse Primer(10uM)      0.4μl

Taq DNA polymerase(5u/ul)      0.2μl

H2O                           12.5μl

Total                         20μl

进行Real time PCR反应

PCR反应管用离心机轻轻离心后放入DNA Engine Opticon连续的荧光检测系统中进行PCR反应。采用两步法PCR反应程序。

95℃                            2min

Repeat 45 times     95℃        10s

                    60℃        20s

                    72℃        Read plat

               82℃         Read plat

               72℃         10min

Melting curve 80℃～95℃/0.5℃

每个样本均做3个平行管，内标基因配材内也相应的做3个平行管。在同一反应体系中，用RNA和水做为对照。整个PCR反应在Opticon PTC200 system(MJ Research，USA)中进行。

反应结束后确认Real time PCR的扩增曲线和溶解曲线，可以通过溶解曲线分析，确认PCR反应的特异性。进行PCR定量时制作标准曲线。计算CT值，根据CT的平均值，计算不同模板的C值。结果见图5。

实施例2、原核表达分析

2.1 原核表达载体的构建

所用表达载体为pET24a，受体菌为DE3。选用Hind III和EcoR I分别对pET24a和含有目的基因的pMD18—T载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的原核表达载体，然后转化受体菌DE3感受态用于蛋白表达。

1.pET24a和pMD18—T的酶切

碱裂解法提取pET24a和pMD18—T的质粒，各取10ul进行HindIII和EcoRI双酶切。质粒提取方法如上，质粒双酶切体系如下：

EcoR I        1μl

HindIII       1μl

10×K buffer  1μl

质粒          300ng

ddH₂O         至20μl

于37℃恒温水浴锅酶切4小时以上。

2.酶切质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及回收方法同上。

3.基因与酶切得到的pET24a大片段的连接

连接反应组成：10×连接酶缓冲液       1μl

              T4DNA连接酶           1μl

              回收基因目的片断       6μl

              回收产物pET24a         2μl

加dd H2O至终反应体积10μl，16℃连接过夜(回收目的基因与pET24a的摩尔比为4：1)。

4.转化大肠杆菌，方法同上。

5.重组子的鉴定

①质粒的酶切鉴定

挑取单菌落分别接种于5ml含kan的LB液体培养基中37℃震荡培养过夜，碱变

性法提取质粒，选取合适的酶进行酶切，1℅的琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期分子量大小的片段。

②质粒的PCR验证

用基因特异引物进行PCR扩增，1℅的琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期分子量大小的片段。

6.转化受体菌DE3

构建好的原核表达载体热击法转化大肠杆菌DE3感受态细胞，筛选与鉴定方法同上。

2.2 样品的制备

蛋白质提取液：400mg SDS

             100mg DTT

             2.5ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8)

             2ml glycerol

             3mg溴酚兰

             混合后，加蒸馏水至10ml。

1.将含有表达片段的阳性克隆接种于5ml含卡那霉素30μg/ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养3-5小时。到OD600约为1.0时，吸出1ml菌液留作对照组。

2.其余的培养液中加入1M的IPTG使终浓度分别为1.0mM。分别培养不同时间(0h，3h，5h)诱导诱导蛋白的表达。

3.未诱导和诱导的菌液都加入1.5ml离心管中，10000rpm离心1min收集菌体，弃上清，加入100μl蛋白提取液，旋涡振荡混匀，沸水浴10min，13000rpm离心15min，上清备用。

2.3 SDS-PAGE电泳

1.药品配制：

(1)10×电极缓冲液：取Tris 30.3g，Glycine 144g，SDS 10g，加蒸馏水溶解后定容至1000ml；

(2)40％丙烯酰胺母液(Acr)：取40g Acr，加蒸馏水溶解后定容到100ml；

(3)2％甲叉双丙烯酰胺(Bis)；取2g Bis-Acr，加蒸馏水溶解后定容到100ml；

(4)3mol/LTris-HCl(pH 8.8)：取36.3g Tris溶入蒸馏水，定容至100ml，用1mol/L的HCl调pH至8.8；

(5)1mol/LTris-HCl(pH 6.8)：取12.1g Tris溶入蒸馏水，定容至100ml，用1mol/L的HCl调pH至6.8；

(6)10％SDS：称取SDS粉末10g加蒸馏水溶解定容至100ml；

(7)10％AP：称取过硫酸铵1g加蒸馏水溶解定容至10ml；

(8)TEMED：购自Amersham公司；

(9)固定染色液：取20ml冰醋酸，80ml甲醇加蒸馏水定容至200ml，称取200mg考马斯亮蓝R-250溶解于上述溶液中。

2.SDS-PAGE凝胶的制备

(1)玻璃板洗净干燥之后，用1％琼脂封板。玻璃板放到制胶架上(带耳胶板在外)，

用夹子固定，向下端封口的塑料槽中加入适量熔化的琼脂，静置，直至琼脂凝固。

(2)配胶按照下表中的比例配制12％分离胶和4％浓缩胶。

聚丙烯酰胺凝胶组成      12％分离胶26ml        4％浓缩胶10ml

40％ Acr                7.62ml               0.986ml

2％ Bis                 4.16ml               0.54ml

3M Tris-HCl(pH8.8)      3.28ml               ----

1M Tris-HCl(pH6.8)      ----                 1.25ml

10％ SDS                0.26ml               0.1ml

蒸馏水                  10.56ml              7.14ml

TEMED                   10.4μl               10μl

10％ APS                98μl                 75μl

(3)倒入分离胶后，在胶面上加一层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。

(4)倒置胶板，流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽多余的水，配制浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气泡，静置至胶凝。

(5)将胶板从制胶架上取下，去净胶板下部残留的琼脂；将胶板固定到电泳槽上(带耳胶板在内)，直立电泳槽，夹子固定胶板。

(6)拔出梳子，向电泳槽下槽加入电泳缓冲液，吹出进入玻璃板之间的气泡。将8μl样品液点入点样孔中。然后将电泳槽放入4℃层析柜中，注意要水平，10mA稳流电泳至指示剂迁移至凝胶底部后继续电泳30分钟，再停止电泳。

(7)电泳结束，取下胶板，揭开玻璃板，露出胶，用刀片切去浓缩胶，切掉分离胶一角作标记，进行染色。

(8)染色与脱色。取下胶，置200ml染色液中摇荡染色过夜，然后转移到装有蒸馏水的塑料盘中摇荡脱色2-4小时，其间更换蒸馏水数次，直至到背景脱色干净为止。

(9)保存结果。脱色干净的胶的电泳图谱用凝胶成像仪照相保存并分析。

3.融合蛋白纯化及蛋白酶抑制活性检测

(1)含有重组质粒的大肠杆菌细胞在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃培养。直至OD₆₀₀约为0.6，加入IPTG，使终浓度为0.5mM，37度培养5-6小时。诱导蛋白表达。

(2)收集细菌细胞，40mL初始缓冲液(20mM磷酸钾缓冲液，pH7.4，0.5mMNaCl)重悬。

(3)加入5mg溶菌酶室温30min裂解细胞。

(4)冰浴20200W超声波破碎细胞10s，每次间隔10s。12000rpm离心15min 4度。

(5)用0.1mM的NiSO4平衡Hi-Trap(Amersham)柱子。蛋白纯化方法参考chu等(chu，2003)。BSA法测定蛋白含量参考Bradford’s(1976)。

(6)得到的蛋白产物用15％SDS-PAGE电泳。烤马斯亮蓝R-250染色观察。

(7)取2ug胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich，St.Louis)与纯化的融合蛋白3ml，25度孵育10min。同时以商业化的大豆BBI(Sigma-Aldrich)作为对照。

(8)胰蛋白酶活性检测，使用TAME(Sigma-Aldrich)247n检测，参考Hummel’s(1959)。胰凝乳蛋白酶活性用ATEE(Sigma-Aldrich)237nm检测参考Schwert’s(1955)。结果见图7。

实施例3、组织原位杂交

组织原位杂交参照Roche公司Detection of mRNA intissue sections usingDIG-labeled RNA的方法进行。结果见图6。

实施例4、植物表达载体的构建(Ubi/35S启动子)

4.1 Ubiquitin启动子植物表达载体的构建

利用植物表达载体pCAMBIA1301，在BamH I和Hind III之间插入了Ubiquitin启动子，在EcoR I和Kpn I之间插入了Nos终止子，构建了中间载体pUN1301。选用SacI和Kpn I分别对pUN1301和含有目的基因的pMD18-T载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。不同基因的载体构建的酶切位点根据情况调整。

(1)质粒pUN1301空载体和pMD18-T的KpnI和SacI双酶切

碱裂解法提取pUN1301空载体和pMD18-T质粒，各取10μg酶切，酶切体系如下：

KpnI                      1μl

SacI                      1μl

pUN1301载体/pUCm-T质粒    1~2μl

10×Buffer K              1μl

ddH₂O To                  20μl

于37℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果见图8。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pUN1301中14kb的载体大片段和pMD18-T中大约0.6kb的目的基因条带，回收该条带。

(2)pUN1301质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

(3)经酶切和脱磷的pUN1301载体片段(约14kb)和pMD18-T双酶切回收片段(约0.6kb)以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

(5)重组子的鉴定

①质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增，体系如下：

PCR反应条件如下：预变性94℃ 3min，35个循环为：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图9。

②质粒酶切鉴定

提质粒进行KpnI和BamHI双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

4.2 35S启动子植物表达载体的构建

植物表达载体pBI121是含有35S启动子和NPTII基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶KpnI和SacI位点。分别用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切载体pROK2和目的基因片断。完全酶切的载体在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收、用CIAP脱磷酸，然后与双酶切的cDNA片段相连，构建获得植物表达载体。酶切体系，转化大肠杆菌DH10B感受态，鉴定重组子。连接、回收、转化及鉴定方法同上。结果见图10。

实施例5、农杆菌感受态的制备与转化

5.1 农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

(1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

(3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

(5)再悬浮于1ml20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

5.2 冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

(1)在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

(2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

(3)加入无抗生素的YEP800μl，28℃震荡培养3hr。

(4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

5.3 菌体PCR鉴定

菌体PCR方法及程序同上。

实施例6、转基因功能验证—拟南芥转化及筛选

6.1 拟南芥种植

将种子放入EP管中，70％乙醇中浸泡5min，然后清洁剂(20％漂水(白猫，上海)，0.1％Triton)洗涤10-15min，无菌水冲洗4次，4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5％agarose(冷却至40度以免把种子烫死，加agarose是为了有利于种子散开)，铺于1/2MS固体培养基上，超净台上吹干，(可多吹一会，以免种子萌发过程中培养皿盖子上有水汽)。转入人工气候室中培养一周左右，可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot，70度烘干2小时以上(杀死虫卵等，否则会长虫)，然后将pot放在营养液中，使其充分吸水，将在1/2MS固体培养基上生长7-10天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中，盖上保鲜膜，转入人工气候室中培养。1-2天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水(浇在POT底下的铁盘子里)。

6.2 拟南芥转化

(1)当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导测花序的生成。转化前将材料浇透营养液。

(2)转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

(3)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％ Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

(4)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

(5)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，至于19-22℃培养室培养。

(6)隔5-7天再同法浸染一次。

(7)大约一个月后收获种子。

6.3 拟南芥转化阳性株系筛选

(1)收获的TO代种子消毒后(75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3—5次)，铺于含50μg/mL Kan或50μg/mL Hygo的MS筛选培养基上(方法同上)。

(2)4℃春化48h，移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。

(3)等植物绝大多数花苞已经结果荚，用小绳将植物单株绑起，以便单株收种子T1代种子。

(4)PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物。PCR反应体系和反应条件见前。

(5)T1种子处理同前，在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。结果见图11，12。

实施例7、生长点转化小麦山融3号及转基因植株分析

7.1 生长点转化山融3号小麦

采用本实验建立生长点转化的方法(国家发明专利ZL200410075773.2)，将构建的单子叶植物表达载体转化小麦。

具体步骤如下：

(1)济南小麦177浸种后露白，4℃春化30-35天；

(2)小苗长至3-5cm左右时准备农杆菌菌液，开始侵染；

(3)农杆菌AGL1中携带质粒，其摇菌活化过程同上；

(4)农杆菌菌体5000rpm离心5min，菌体重悬于加As的浸染液中；

(5)解剖镜下无菌刀片小心纵切小苗下部，暴露出生长点；

(6)用注射器将浸染液小心滴到生长点位置；

(7)植株恢复生长7天左右，移栽到土中；

(8)对植株外加抗生素压力进行筛选。

7.2 转基因阳性植株鉴定

(1)CTAB法提取基因组DNA。

(2)PCR鉴定阳性植株。

PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，引物分别用基因特异引物。PCR反应体系和反应条件见前。结果见图13，14。

序列表

<110>山东大学

<120>小麦耐盐基因TaCHP及其应用

<141>2009-1-16

<160>1

<210>1

<211>645

<212>cDNA

<213>小麦

<221>小麦耐盐基因TaCHP基因

<222>(1)…(645)

<400>1

Claims (7)

1.一种小麦耐盐基因TaCHP，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaCHP的植物表达载体pBI121。

3.一种含有权利要求1所述基因TaCHP的植物表达载体pUN1301。

4.权利要求1所述基因TaCHP在培育抗盐植物中的应用。

5.权利要求2所述植物表达载体pBI121在培育抗盐植物中的应用。

6.权利要求3所述植物表达载体pUN1301在培育抗盐植物中的应用。

7.如权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于：所述植物是普通小麦。

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