CN104328128A - 小麦耐盐基因TaSOD2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦耐盐基因即小麦基因TaSOD2及含有所述基因TaSOD2的植物表达载体，本发明还公开了所述基因TaSOD2在培育抗盐植物特别是小麦中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的抗盐能力明显提高。

Description

小麦耐盐基因TaSOD2及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种小麦耐盐基因(基因TaSOD2)及其应用。

背景技术

土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因技术改良植物将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

目前，利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。

检索表明已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因，但有关SOD基因在植物耐盐过程中的作用报道较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐盐基因——小麦基因TaSOD2及其应用。

本发明的技术方案是：从小麦中分离得到小麦基因TaSOD2，然后将该基因转化到拟南芥和小麦中，进行转基因功能验证(小麦和拟南芥转化筛选及盐胁迫表性分析)，以实现研究SOD基因的功能以及植物的耐盐机理和其生产应用。

本发明所述的小麦耐盐基因名称为小麦耐盐基因TaSOD2，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含上述的小麦基因TaSOD2的植物表达载体pSTART-TaSOD2或pXQUbi-TaSOD2。

本发明所述的基因TaSOD2可广泛用于培育耐盐农作物品种。

本发明所述基因TaSOD2在培育抗盐植物中的应用。进一步的，本发明所述含基因TaSOD2的植物表达载体pSTART-TaSOD2或pXQUbi-TaSOD2在培育抗盐植物中的应用。

其中：所述植物优选是普通小麦。

将本发明所述基因TaSOD2导入植物细胞，植物即可相应的获得耐盐的能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaSOD2的植物表达载体(pSTATR-TaSOD2或pXQUbi-TaSOD2)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

实际上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pSTART。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦耐盐基因TaSOD2，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥和小麦，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高。

附图说明

图1：TaSOD2基因全长cDNA序列的扩增结果

其中：M为λDNA/(BamHⅠ+SacⅠ)Marker；下同。

图2：山融3号和济南177小麦在200mM NaCl盐胁迫条件下TaSOD2的RT-PCR分析

其中：177表示济南177小麦，SR3表示山融3号小麦，Leaf表示叶，root表示根，Actin表示拟南芥Actin(内参)，数字表示胁迫时间(小时)。

图3：pXQUbi-TaSOD2小麦表达载体构建过程

其中：A为带酶切位点的TaSOD2片段扩增；B为KpnI和BamH1对TaSOD2片段和pXQUbi载体进行双酶切条带；C为pXQUbi-TaSOD2载体的双酶切验证。

图4：小麦TaSOD2转基因植株检测

其中：VC为空载体转基因株系；OE1-4为四个独立的转基因株系；TaActin为小麦Actin基因内参。

图5：pSTART-TaSOD2拟南芥表达载体构建过程

其中：A为带酶切位点的TaSOD2片段扩增；B为XbaI和BamH1对TaSOD2片段和pSTART载体进行双酶切条带；C为pSTART-TaSOD2载体的双酶切验证；D为pSTART-TaSOD2载体的PCR验证

图6：拟南芥TaSOD2转基因植株检测

其中：A为基因组PCR验证TaSOD2整合到拟南芥基因组；B为RT-PCR验证TaSOD2在转基因株系中正常表达；V C为空载体转基因株系；OE1-2为两个独立的转基因株系；+为阳性质粒；M为分子量标记；AtTubulin为拟南芥Tubulin基因内参。

图7：盐胁迫下转基因拟南芥株系与对照根系的生长状况

其中：A：转基因小麦，WT为未转化小麦株系，CE1/CE2为两个独立的转基因株系；B转基因拟南芥，Col-0为未转化拟南芥植株，OE1/OE2为两个独立的转基因株系；C：小麦根长统计；D：拟南芥根长统计。

具体实施方式

实施例1、TaSOD2的克隆

1.1提取小麦Total RNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4.4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤；4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNA Marker作为对照。

1.2cDNA反转录

反转录酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1.12μl体系：

2.65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer    4μl

0.1M DTT                  2μl

RNaseOUT(Invitrogen)      1μl

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μl M-MLV RT，混匀，37℃反应50min；

5.70℃温育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μl RNase H(Invitrogen)，37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3开放阅读框的克隆和序列测定

1.引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物，扩增基因的开放阅读框。

2.PCR反应体系(50μl)：

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由上海Invirtron公司完成。结果见图1。

1.4基因表达分析(RT-PCR)

a.胁迫下RNA的提取

山融3号和济南177小麦种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)开始施加盐胁迫(200mM NaCl)，处理0、1、6、24，72，96小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。

b.反转录(RT)产生cDNA

反转录产生cDNA，方法同上。

c.PCR反应及电泳

1.以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下

TaAct-S：5’-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’

TaAct-A:5’-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3’

2.PCR体系：

3.PCR程序：

95℃5min,25～30cycles 95℃20s,57℃60s,72℃60s；72℃7min.

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

4.1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。

实施例2、植物表达载体的构建

利用植物表达载体pSTART，选用XbaI和BamHⅠ分别对pSTART和含有目的基因的pMD18-T载体进行双酶切；利用植物表达载体pXQUbi，选用KpnI和BamH1分别对pSTART和含有目的基因的pMD18-T载体进行双酶切。回收载体大片段和目的基因小片段，用T₄DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

(1)双酶切，以pSTART空载体和pMD18-T为例

碱裂解法提取pSTART空载体和pMD18-T质粒，各取10μg酶切，酶切体系如下：

于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART中14kb的载体大片段和pMD18-T中大约1.1kb的目的基因条带，回收该条带。

(2)pSTART质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

(3)经酶切和脱磷的pSTART载体片段(约14kb)和pMD18-T双酶切回收片段(约1.1kb)以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

(5)重组子的鉴定

①质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增。

PCR反应条件如下：预变性94℃3min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

②质粒酶切鉴定

提质粒进行SacI和BamHI双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。结果见图3，5。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

4.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

(1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

(3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

(5)再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

4.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

(1)在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

(2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

(3)加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3小时。

(4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

4.3菌体PCR鉴定

实施例4、转基因功能验证－小麦和拟南芥转化筛选及盐胁迫表性分析

5.1小麦和拟南芥种植

将种子放入EP管中，70％乙醇中浸泡5min，然后清洁剂(20％漂水(白猫，上海)，0.1％Triton)洗涤10-15min，无菌水冲洗4次，4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5％agarose(冷却至40度以免把种子烫死，加agarose是为了有利于种子散开)，铺于1/2MS固体培养基上，超净台上吹干，(可多吹一会，以免种子萌发过程中培养皿盖子上有水汽)。转入人工气候室中培养一周左右，可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot，70℃烘干2小时以上(杀死虫卵等，否则会长虫)，然后将pot放在营养液中，使其充分吸水，将在1/2MS固体培养基上生长7-10天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中，盖上保鲜膜，转入人工气候室中培养。1-2天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水(浇在pot底下的铁盘子里)。

5.2小麦和拟南芥转化

(1)当小麦和拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导测花序的生成。转化前将材料浇透营养液。

(2)转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

(3)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

(4)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

(5)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，至于19-22℃培养室培养。

(6)隔5-7天再同法浸染一次。

(7)大约一个月后收获种子。

5.3小麦和拟南芥转化阳性株系筛选

(1)收获的T₀代种子消毒后(75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3－5次)，铺于含50μg/ml Kan或50μg/ml Hygo的MS筛选培养基上(方法同上)。

(2)4℃春化48h，移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。

(3)等植物绝大多数花苞已经结果荚，用小绳将植物单株绑起，以便单株收种子T₁代种子。

(4)PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物进行基因组PCR，鉴定阳性克隆。结果见图4、6。

(5)T₁种子处理同前，在T₂代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。

5.4小麦和拟南化阳性株系盐胁迫表性分析

(1)将种子用0.1％升汞表面灭菌15min，用无菌水洗3-4遍，然后摆放到1/2MS固体培养基平板上，4℃同步化4天后转入培养间，竖直培养。

(2)3天后将长势一致的已经长出子叶和根部的小苗转入含有添加不同浓度NaCl培养基的方皿中，用封口膜封好，并竖直培养，在合适的时间照相记录。

综合数据表明转化TaSOD2的转基因小麦和拟南芥的耐盐能力明显增加。结果见图7。

Claims (7)

1.一种小麦耐盐基因TaSOD2，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaSOD2的植物表达载体pSTART-TaSOD2。

3.一种含有权利要求1所述基因TaSOD2的植物表达载体pXQUbi-TaSOD2。

4.权利要求1所述基因TaSOD2在培育抗盐植物中的应用。

5.权利要求2所述植物表达载体pSTART-TaSOD2在培育抗盐植物中的应用。

6.权利要求3所述植物表达载体pXQUbi-TaSOD2在培育抗盐植物中的应用。

7.如权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于：所述植物是普通小麦。