CN102492028A

CN102492028A - 水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用

Info

Publication number: CN102492028A
Application number: CN2011103876184A
Authority: CN
Inventors: 高南; 李俊林; 苏彦华; 李虹颖
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: CN102492028B

Abstract

水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。编码上述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子的基因，序列如SEQIDNo.1所示。本发明首先从粳稻（OryzasativaL）中克隆得到了OsAKT2/3基因，验证了该水稻OsAKT2/3基因具有高效转运K⁺的功能，还有双向整流型的特性。通过OsAKT2/3可转运钾的能力，获得了其它Sharker型家族基因不可比拟的既主导K⁺内流又允许K⁺的渗漏性外流的双向整流特征。并成功利用这一基因，提高植物对钾的有效利用能力。

Description

水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子及应用。

技术背景

钾是植物细胞中最主要的渗透物质，它一方面控制细胞的体积和膨压，对细胞/组织的伸长和韧性有重要的调控作用，与作物体内水分的保持和抗旱性密切相关；另一方面，K⁺控制细胞的膜电位，对作物吸收和运输营养离子具有非常重要的影响(印莉萍等，2006)。在植株内部，由Shaker类型的钾离子通道所介导的高通量K⁺流动，是实现膜电位快速调控的基础。拟南芥的Shaker类型通道家族由9类成员组成：KAT1、KAT2、AKT1、AKT5、AKT6、AKT2/3、AtKC1、SKOR和GORK，分为内向整流型、双向整流型和外向整流型(Véry and Sentenac，2003；Szczerba et al.，2009)。到目前为止，AKT2/3是Shaker类型通道中唯一的既主导K⁺内流又允许在去极化情况下K⁺的渗漏性外流的通道，其电生理特征表现为弱向整流、能够感应K⁺水平并受钙离子和质子调控。其独有的渗漏型电流，是该类通道与众不同的特征，可能在生理上代表了在过量K⁺迅速吸收进入细胞而导致膜电位去极化情况下，通过胞内K⁺的渗漏从而实现对膜电位的精确微调作用，进而增加钾的体内循环利用。

水稻是一年生禾本科作物，世界上近一半的人口以稻米为食。水稻缺钾症状表现为：老叶叶尖及前端叶缘褐变或焦枯，同时出现褐色斑点；植株伸长受抑制而萎缩；叶色加深，呈暗绿色且无光泽；根系细弱，多褐根，老化早衰；抽穗不整齐，秕谷率增加，正常受精的谷粒也不饱满，产量和品质下降。除了合理施肥外，从水稻本身的钾营养分子基础研究入手，增加作物吸收钾和体内循环利用的效率。

从水稻基因组的数据分析，水稻存在已知的所有类型的植物钾离子通道，至少有11个编码Shaker型家族的钾离子通道的基因。水稻的Shaker型钾离子通道目前有4个结果：OsAKT1是电压依赖的内向整流钾离子通道，对盐胁迫敏感(Golldack et al.，2003；Fuchs et al.，2005)；OsKAT1能增加水稻细胞钾的含量，增加对盐胁迫的抗性(Obata et al.，2007；李等，2011)。如果能克隆到水稻中既主导K⁺内流又允许K⁺的渗漏性外流的双向整流型钾离子通道并验证其功能，进而筛选出可以利用的基因资源，为进一步通过转基因等技术应用于农作物来提高其对钾的有效利用能力奠定基础。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子，通过其提高植物对钾的有效利用能力。本发明的另一目的是提供上述水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子在控制植物双向整流和提高钾营养利用方面的应用。

技术方案：一种水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

编码上述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子的基因。

编码上述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子的基因，序列如SEQ ID No.1所示。

含上述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子基因的真核表达载体。

真核表达载体，所述真核表达载体为将水稻OsAKT2/3构建到pCI或pTracer-CMV3载体，所得的到重组质粒pCI-OsAKT2/3或pTracer-CMV3-OsAKT2/3。

本发明提供了所述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子在控制植物中既主导K⁺内流又允许K⁺的渗漏性外流的双向整流方面的应用。从而，本发明也提供了一种控制植物双向整流的方法，所述方法将所述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子基因导入植物中并表达的步骤。

有益效果：本发明首先从粳稻(Oryza sativa L)中克隆得到了OsAKT2/3基因，验证了该水稻OsAKT2/3基因具有高效转运K⁺的功能，还有双向整流型的特性。通过OsAKT2/3可转运钾的能力，获得了其它Sharker型家族基因不可比拟的既主导K⁺内流又允许K⁺的渗漏性外流的双向整流特征。并成功利用这一基因，提高植物对钾的有效利用能力。

附图说明

图1水稻OsAKT2/3基因克隆；其中图1A：lane1、2为水稻总RNA；图1B：M为Maker，lane 1为OsAKT2/3的PCR结果；图1C：M为Maker，lane 1为TA-OsAKT2/3的PCR鉴定结果；

图2水稻OsAKT2/3基因表达的组织特异性和对环境的响应；其中图2A：OsAKT2/3基因在水稻地上部和根部的分布；图3B：地上部OsAKT2/3基因对钾离子浓度变化的响应；图2C：地上部OsAKT2/3基因对PEG和ABA的响应；

图3重组质粒pCI-OsAKT2/3和pTracer-CMV3-OsAKT2/3的酶切和PCR鉴定。其中图3A：M为Maker，lane 1为pCI-OsAKT2/3的SmaI/NotI双酶切结果；图3B：M为Maker，lane1为pCI-OsAKT2/3的PCR鉴定结果；图3C：M为Maker，lane 1为pTracer-CMV3-OsAKT2/3的KpnI酶切结果；图3D：M为Maker，lane 1为pTracer-CMV3-OsAKT2/3的PCR鉴定结果；

图4水稻OsAKT2/3钾离子转运活性验证；其中图4A：注射OsAKT2/3或注射水时蛙卵转运钾离子特征电流曲线；图4B：注射OsAKT2/3或注射水时蛙卵转运钾离子的电流与膜电位的关系曲线；

图5水稻OsAKT2/3对细胞外钾离子浓度的依赖性；其中图5A：水稻OsAKT2/3转运不同浓度钾离子特征电流曲线；图5B：水稻OsAKT2/3转运不同浓度钾离子的电流与膜电位的关系曲线。

具体实施方式

实施例1：水稻OsAKT2/3基因的克隆

提取水培生长15天的水稻叶(Oryza sativa L)的总RNA(图1A)并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反转录，得到反转录产物cDNA。以此cDNA为模板，以特异引物F2N和R2进行PCR扩增。

上游引物F2NHindIII：CCAAGCTTATGGATGTGGCGTCGACTATCC(加入HindIII酶切位点，for pTracer-CMV3)

上游引物F2NSmaI：GGCCCGGGATGAAGACCTCGAGCTTC(加入SmaI酶切位点，forpCI)

下游引物R2：TCCGCGGCCGCCTATGATCCAGACACCGAGTCCA(加入NotI酶切位点)

基因全长PCR反应体系：

试剂	加入量
		Pfu DNA Polymerase(2.5U/μL)	0.5μL
10×Pfu Buffer with MgSO₄	5μL
		dNTPs(2.5mM each)	4μL
上游引物F2N(10mM)	2μL
		下游引物R2(10mM)	2μL
二甲基亚砜(DMSO)	2.5μL
		模板cDNA	2μL
超纯水	32μL
		矿物油	1滴

基因全长PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测，结果得到约2.5kb左右的单一产物(图1B)。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带的凝胶块，用Geneclean II Kit(Qbiogene)回收目的片段。将次回收的目的条带与pMD18-T Simple Vector连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α.。挑取单克隆重组质粒TA-OsAKT2/3进行PCR鉴定。

以此TA-OsAKT2/3为模板，以特异引物F1和R1进行PCR扩增。

上游引物F 1：TCGCCAGGCTCCTCGTCCTCAAC

下游引物R1：TCAATCTCCGCTCCTTCGTCGTT

PCR反应体系：

试剂	加入量
		rTaq(5U/μL)	0.05μL
10×PCR Buffer(Mg²⁺free)	1μL
		MgCl2(25mM)	0.6μL
dNTPs(2.5mM each)	0.8μL
		上游引物F1(10mM)	0.4μL
下游引物R1(10mM)	0.4μL
		模板	1μL
超纯水	6.75μL

PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，33个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测，结果得到约420bp的单一产物(图1C)。选取阳性克隆并测序。

OsAKT2/3的cDNA序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

实施例2：水稻OsAKT2/3基因表达的组织特异性和对环境的响应

为了解OsAKT2/3基因在水稻不同组织器官中的表达情况，分别提取了水稻根和地上部的总RNA，以Oligo(dT)₁₈为引物反转录，得到反转录产物cDNA。以此cDNA为模板，以特异引物F1和R1进行实时荧光定量PCR分析。

上游引物F 1：TCGCCAGGCTCCTCGTCCTCAAC

下游引物R1：TCAATCTCCGCTCCTTCGTCGTT

PCR反应体系：

结果显示，在水稻地上部OsAKT2/3基因的表达较强，而在根中未检测到其表达(图2A)。以上实验结果表明OsAKT2/3基因在水稻中有明显的组织特异性，其在地上部的表达较为活跃。

接下来，采用相同的反应参数分析了地上部OsAKT2/3基因对钾离子浓度变化的响应。结果显示，不供钾和供应高浓度钾时，水稻地上部OsAKT2/3基因的表达均增强(图2B)。以上结果表明水稻OsAKT2/3基因对水稻提高钾效率有可能发挥重要作用。

进一步分析了地上部OsAKT2/3基因对聚乙二醇(PEG)模拟干旱和脱落酸(ABA)模拟非生物胁迫的响应。结果显示，在添加PEG和ABA时，水稻地上部OsAKT2/3基因的表达均增强(图2C)。以上结果表明在水稻遇到干旱等非生物胁迫时，OsAKT2/3基因对水稻提高抗逆性能发挥重要作用。

实施例3：重组质粒pCI-OsAKT2/3和pTracer-CMV3-OsAKT2/3的构建

将水稻OsAKT2/3基因经SmaI/NotI构建到pCI(该载体购自Promega公司)或pTracer-CMV3上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒并酶切(图2A)和PCR(图2B)鉴定。PCR反应参数见实施例1。结果表明已经成功获得重组质粒pCI-OsAKT2/3。

将水稻OsAKT2/3基因经HindIII/NotI双酶切构建到pTracer-CMV3上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒并酶切(图2C)和PCR(图2D)鉴定。PCR反应参数见实施例1。结果表明已经成功获得重组质粒pTracer-CMV3-OsAKT2/3。

实施例4：水稻OsAKT2/3基因的电生理功能分析

将水稻OsAKT2/3基因构建到pCI或pTracer-CMV3上，转化大肠杆菌后检测(如图3)。质粒小提试剂盒提取质粒DNA。通过显微注射技术将其注射到非洲爪蟾蛙(Xenopus oocytes)中表达约2天，再用双电极电压钳(Two-Electrode Voltage-Clamp，TEVC)技术对OsAKT2/3基因做电生理分析。

1、水稻OsAKT2/3基因的钾转运活性分析

1)溶液配制：

50mM钾离子溶液：50mM KCl，50mM NaCl，1.0mM MgCl₂，1.8mM CaCl₂，5.0mMHEPES-NaOH，pH7.4；

2)测定程序设置：

钳制电压-40mV，阶越电压为10mV，共21个刺激电压，从-140mV到+60mV。刺激间隔2s，采样频率10kHz。

表达OsAKT2/3的爪蟾蛙卵记录到大量的双向整流电流，而注射水的爪蟾蛙卵没有双向整流电流(图4)。结果表明OsAKT2/3基因具有主导K⁺内流又允许K⁺的渗漏性外流的双向整流活性。

2、水稻OsAKT2/3对细胞外钾离子浓度依赖性分析

1)溶液配制：

不同钾浓度溶液：保证K⁺和Na⁺总摩尔数为100mM，1.0mM MgCl₂，1.8mM CaCl₂，5.0mMHEPES-NaOH，pH7.4；KCl浓度分别为0mM、1mM、5mM、10mM、25mM和100mM。

无钾溶液：100mM NaCl，1.0mM MgCl₂，1.8mM CaCl₂，5.0mM HEPES-NaOH，pH7.4。

2)测定程序设置：

钳制电压-40mV，阶越电压为10mV，共19个刺激电压，从-140mV到+40mV。刺激间隔2s，采样频率10kHz。

结果表明OsAKT2/3基因具有的双向整流活性对细胞外钾离子具有浓度依赖性，随着浓度的增加，转运活性也在增加(图5)。

实施例5：转OsAKT2/3基因番茄的制备

1.基因表达载体构建

通过设计引物上游引物F3NSmaI：GGCCCGGGATGAAGACCTCGAGCTTC(加入SmaI酶切位点)和下游引物R3SmaI：GGCCCGGGCTATGATCCAGACACCGAGTCCA(加入NotI酶切位点)，利用PCR扩增出目的片段。将pBI121载体和PCR扩增得到的OsAKT2/3基因进行SmaI单酶切，回收载体和基因片段，利用T4连接酶16℃连接过夜，转化涂板，于37℃培养箱过夜培养，调取单菌落进行菌落PCR，将阳性克隆测序碱性，所得载体命名为pBI121-OsAKT2/3，将载体转入LBA4404中。

2.农杆菌的培养

从平板上挑取单菌落，接种于含100mg L^-1kanamycin(Kan)，25mg L^-1rifampicin(Rif)和50mg L^-1streptomycin(Strep)的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，28℃，250rpm震荡培养至OD_600nm＝1.0，用LB液体培养基稀释菌液10倍，继续震荡培养4h；将菌液倒入无菌螺口带盖离心管内，盖上管盖，4000rpm离心10min；弃去上清，倒置离心管1min，流尽残余液体；向离心管中加入适量共培养培养基-I(MS，30g L^-1蔗糖，pH 5.8)，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用共培养液体培养基-I，再次稀释至OD_600nm＝0.1。

3.子叶的预培养

番茄种子在自来水下冲洗15min，转移至超净工作台。用无菌水冲洗4次，先用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次；再用2％(g/100mL)的次氯酸钠剧烈振荡灭菌15-20min，无菌水冲洗8次且持续时间不少于30min。表面灭菌后的种子接种于种子萌发培养基(MS，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)上。放置无菌培养室培养，光周期16h/8h，光照强度为72μmol m^-2s^-1，培养温度为23±1℃。将6-8d苗龄的番茄无菌苗的子叶剪成约25mm²的块状，正向放置在预培养培养基(MS培养基，2mg L^-1玉米素，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH5.8)上预培养1d。

4.农杆菌介导测转化

将经过预培养的子叶浸入制备好的菌悬液中，浸染15min。将浸染后的子叶在无菌滤纸上轻轻吸干，接种到共培养培养基-II(MS培养基，100μM乙酰丁香酮，2mg L^-1玉米素，0.1mg L^-1吲哚乙酸，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.2)上共培养3d。

5.转基因植株的再生和培育

将经过3d共培养的子叶转接到再生培养基(MS培养基，50mg L^-1kanamycin，200mg L^-1timentin，1mg L^-1玉米素，0.1mg L^-1吲哚乙酸，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)上，每3周继代培养一次。直到抗性芽出现，并长到约5mm高时，将其自子叶切下，插入到生根培养基-I(MS培养基，50mg L^-1kanamycin，200mg L^-1timentin，0.2mg L^-1吲哚乙酸，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)中诱导生根。再将生根的植株转接到生根培养基-II(MS培养基，50mg L^-1kanamycin，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)上继续培养1周。将完整的转基因植株移栽在温室菜园土中。

6.转基因番茄植株的PCR检测

分别剪取每棵转化植株的一片叶片，提取总DNA，以总DNA为模板，用引物：上游引物F1：TCGCCAGGCTCCTCGTCCTCAAC和游引物R1：TCAATCTCCGCTCCTTCGTCGTT进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳。以野生型番茄的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现基因条带，证明目的基因的片段已经整合到植物基因组中。

转OsAKT2/3基因番茄钾高效利用能力检测

T₁代转基因番茄移栽至土壤中1个月后，收获转基因番茄的地上部样品和对照样品，用去离子水洗净，分成不同的部分，105℃杀青30min，65℃烘干至恒重；粉碎；称重；H₂SO₄-H₂O₂消化，火焰光度计测定植株钾含量(鲁如坤，1999)。结果表明，在相同的供钾条件下，转基因番茄的含钾量明显提高，普通番茄的含钾量为2.8％，转基因番茄的含钾量为3.6％，生物量(干重)明显改善。说明了转OsAKT2/3基因番茄有高效利用钾的能力。

序列表

<110> 中国科学院南京土壤研究所

<120> 水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2568

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atgaagacct cgagcttcga gagcgctagt agcagcggcg gcagcggcgg tggcggtggc 60

ggcggtggcg gcgagggctc cggctcgttc aacctccgga acctatccaa gctcatcctg 120

ccgcctctcg gcgtgccggc cggcggccac gcccagtccg gccatgccgg ccccaacgac 180

aggcgtgtca tctcgcctct cgactccaga tacaggtgct gggacacgtt catggtggtg 240

ctggtggcgt actcggcgtg ggtgtacccg ttcgaggtgg cgttcatgaa cgcgtcgccc 300

aagggcggcc tcgaggtggc cgacatcgtc gtcgacctct tcttcgccgt cgacatcgtc 360

ctcaccttct tcgtcgccta catcgactcc aggactcagc tcctcgtccg cgacaggcgg 420

aggattgcca ccagatatct gtcgacgttc ttcatcatgg atgtggcgtc gactatcccg 480

ttccaaggcc ttgcctacat cgtcaccggc gaggtcaggg agagcccggc gttcagcctc 540

ctcggcatcc tccggctatg gcgtctcagg aaggtcaagc agttcttcac aaggctggag 600

aaggacatca ggttcaacta cttctggatc cgctgcgccc ggctcatcgc ggtgacgctg 660

ttcctggtgc actgcgcggg gtgcctgtac tacctgatcg cggacaggta cccgcacagg 720

gagaagacgt ggatcggcgc ggtgatcccg gacttccagg aggcgagcct gtggatccgc 780

tacacctcct ccgtctactg gtccatcacc accatgacca ccgtcggcta cggcgacatg 840

cacgcccaga acaccgtcga gatgatcttc aacatcttct acatgctctt caacctcggc 900

ctcaccgcct acctcatcgg caacatgacc aacctcgtcg ttgagggcac ccgccgtacc 960

atggaattca ggaacagcat tcgtgctgcc tccaatttcg tgggccggaa ccacctgccg 1020

cctaggctga agcagcagat actggcctac atgtgcctca agttcagggc agagagcctg 1080

aaccagcagc agctgatgga tcagctcccc aaatccatct gcaagggcat ctgcgagtac 1140

ctcttcctcc ccgtcgtcaa ggacgtctac ctcttcaagg gtgtctcaag agaagtgctc 1200

cttctcatgg ttacgaagat gaagccggag tacataccgc cgaaggagga cgtgatcgtg 1260

cagaacgagg cgccggacga cgtctacatc gtggtgtccg gcgaggtgga ggtgatctac 1320

tccgacggcg aagccgagga gcgggtggtg gcgacgctgg ggacgagggg cgtgttcggc 1380

gaggtgagcg cgctcagcga ccgcccgcag agcttcacgc tgcggacgcg gacgctgtgc 1440

cagctgctgc gcctgcgcca ggccgcgctc aaggaggcca tgcagagcaa gcccgaggac 1500

agcgtcgtca tcatcaagaa cttcctcaag catcagatcg agatgcacga catgaaggtg 1560

gaggacttgc tcggggagga cgccgccggc gagtacgacc acggcaacat accgtgcaat 1620

ctgctgacgg tggcagccac cgggaacagc agcttccttg aggatctcct gaaagttgga 1680

atggatcctg acgtcggtga ctccaaggga agaactgcac tgcatatagc ggcatcgaag 1740

gggtacgagg actgcgtgct ggttctcctc aagcaagcgt gcaacgtaaa catcaaagac 1800

gcgcagggca acacggcgct gtggaacgcc atcgccgcga ggcaccacaa gatcttcaac 1860

atcctgtacc acttcgcgcg cgtctcgagc ccgcaccacg ccgccggcga cctcctctgc 1920

ctcgccgcgc gccggggcga cctcgacacg ctccgggagc tcctcaagca cggcctcgcc 1980

gtcgactcgg aggaccggga cggcgccacg gcgctccgcg tcgcgctcgc cgagggccac 2040

gccgacgtcg ccaggctcct cgtcctcaac ggcgccagcg tcgacagggc ggccagccac 2100

aacgagcagc aggcggcggc ggcggtgtcg gtcgacgagc tgcgggagct catgaagacg 2160

cgcgagctcg cgcacccggt caccatcgtc gtcgactcgc cgtcgccggc cgccgcagcc 2220

gtcatccggg aggtcggctc gtcgggggac agccggaatg ggcggcgcca gagcgcgaga 2280

tcagacggcg cgcactggcc acgggtgagc atatacaggg gccatccatt cgtcagaaac 2340

cgtagctcag aagccggcaa gctgatcaac ctgcccggca ccatggaaga attcagaatc 2400

atcatagagg agaaactgaa agtcgacgcg aggaagacgc tgatcatgaa cgacgaagga 2460

gcggagattg actcgatcga cgtgatccgg gacaacgata agctgttcat agtgaccgag 2520

gagcatatga cagcagtagc atcgatggac tcggtgtctg gatcatag 2568

<210> 2

<211> 855

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 2

Met Lys Thr Ser Ser Phe Glu Ser Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Ser Gly Ser Phe Asn Leu

20 25 30

Arg Asn Leu Ser Lys Leu Ile Leu Pro Pro Leu Gly Val Pro Ala Gly

35 40 45

Gly His Ala Gln Ser Gly His Ala Gly Pro Asn Asp Arg Arg Val Ile

50 55 60

Ser Pro Leu Asp Ser Arg Tyr Arg Cys Trp Asp Thr Phe Met Val Val

65 70 75 80

Leu Val Ala Tyr Ser Ala Trp Val Tyr Pro Phe Glu Val Ala Phe Met

85 90 95

Asn Ala Ser Pro Lys Gly Gly Leu Glu Val Ala Asp Ile Val Val Asp

100 105 110

Leu Phe Phe Ala Val Asp Ile Val Leu Thr Phe Phe Val Ala Tyr Ile

115 120 125

Asp Ser Arg Thr Gln Leu Leu Val Arg Asp Arg Arg Arg Ile Ala Thr

130 135 140

Arg Tyr Leu Ser Thr Phe Phe Ile Met Asp Val Ala Ser Thr Ile Pro

145 150 155 160

Phe Gln Gly Leu Ala Tyr Ile Val Thr Gly Glu Val Arg Glu Ser Pro

165 170 175

Ala Phe Ser Leu Leu Gly Ile Leu Arg Leu Trp Arg Leu Arg Lys Val

180 185 190

Lys Gln Phe Phe Thr Arg Leu Glu Lys Asp Ile Arg Phe Asn Tyr Phe

195 200 205

Trp Ile Arg Cys Ala Arg Leu Ile Ala Val Thr Leu Phe Leu Val His

210 215 220

Cys Ala Gly Cys Leu Tyr Tyr Leu Ile Ala Asp Arg Tyr Pro His Arg

225 230 235 240

Glu Lys Thr Trp Ile Gly Ala Val Ile Pro Asp Phe Gln Glu Ala Ser

245 250 255

Leu Trp Ile Arg Tyr Thr Ser Ser Val Tyr Trp Ser Ile Thr Thr Met

260 265 270

Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Met His Ala Gln Asn Thr Val Glu Met

275 280 285

Ile Phe Asn Ile Phe Tyr Met Leu Phe Asn Leu Gly Leu Thr Ala Tyr

290 295 300

Leu Ile Gly Asn Met Thr Asn Leu Val Val Glu Gly Thr Arg Arg Thr

305 310 315 320

Met Glu Phe Arg Asn Ser Ile Arg Ala Ala Ser Asn Phe Val Gly Arg

325 330 335

Asn His Leu Pro Pro Arg Leu Lys Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Met Cys

340 345 350

Leu Lys Phe Arg Ala Glu Ser Leu Asn Gln Gln Gln Leu Met Asp Gln

355 360 365

Leu Pro Lys Ser Ile Cys Lys Gly Ile Cys Glu Tyr Leu Phe Leu Pro

370 375 380

Val Val Lys Asp Val Tyr Leu Phe Lys Gly Val Ser Arg Glu Val Leu

385 390 395 400

Leu Leu Met Val Thr Lys Met Lys Pro Glu Tyr Ile Pro Pro Lys Glu

405 410 415

Asp Val Ile Val Gln Asn Glu Ala Pro Asp Asp Val Tyr Ile Val Val

420 425 430

Ser Gly Glu Val Glu Val Ile Tyr Ser Asp Gly Glu Ala Glu Glu Arg

435 440 445

Val Val Ala Thr Leu Gly Thr Arg Gly Val Phe Gly Glu Val Ser Ala

450 455 460

Leu Ser Asp Arg Pro Gln Ser Phe Thr Leu Arg Thr Arg Thr Leu Cys

465 470 475 480

Gln Leu Leu Arg Leu Arg Gln Ala Ala Leu Lys Glu Ala Met Gln Ser

485 490 495

Lys Pro Glu Asp Ser Val Val Ile Ile Lys Asn Phe Leu Lys His Gln

500 505 510

Ile Glu Met His Asp Met Lys Val Glu Asp Leu Leu Gly Glu Asp Ala

515 520 525

Ala Gly Glu Tyr Asp His Gly Asn Ile Pro Cys Asn Leu Leu Thr Val

530 535 540

Ala Ala Thr Gly Asn Ser Ser Phe Leu Glu Asp Leu Leu Lys Val Gly

545 550 555 560

Met Asp Pro Asp Val Gly Asp Ser Lys Gly Arg Thr Ala Leu His Ile

565 570 575

Ala Ala Ser Lys Gly Tyr Glu Asp Cys Val Leu Val Leu Leu Lys Gln

580 585 590

Ala Cys Asn Val Asn Ile Lys Asp Ala Gln Gly Asn Thr Ala Leu Trp

595 600 605

Asn Ala Ile Ala Ala Arg His His Lys Ile Phe Asn Ile Leu Tyr His

610 615 620

Phe Ala Arg Val Ser Ser Pro His His Ala Ala Gly Asp Leu Leu Cys

625 630 635 640

Leu Ala Ala Arg Arg Gly Asp Leu Asp Thr Leu Arg Glu Leu Leu Lys

645 650 655

His Gly Leu Ala Val Asp Ser Glu Asp Arg Asp Gly Ala Thr Ala Leu

660 665 670

Arg Val Ala Leu Ala Glu Gly His Ala Asp Val Ala Arg Leu Leu Val

675 680 685

Leu Asn Gly Ala Ser Val Asp Arg Ala Ala Ser His Asn Glu Gln Gln

690 695 700

Ala Ala Ala Ala Val Ser Val Asp Glu Leu Arg Glu Leu Met Lys Thr

705 710 715 720

Arg Glu Leu Ala His Pro Val Thr Ile Val Val Asp Ser Pro Ser Pro

725 730 735

Ala Ala Ala Ala Val Ile Arg Glu Val Gly Ser Ser Gly Asp Ser Arg

740 745 750

Asn Gly Arg Arg Gln Ser Ala Arg Ser Asp Gly Ala His Trp Pro Arg

755 760 765

Val Ser Ile Tyr Arg Gly His Pro Phe Val Arg Asn Arg Ser Ser Glu

770 775 780

Ala Gly Lys Leu Ile Asn Leu Pro Gly Thr Met Glu Glu Phe Arg Ile

785 790 795 800

Ile Ile Glu Glu Lys Leu Lys Val Asp Ala Arg Lys Thr Leu Ile Met

805 810 815

Asn Asp Glu Gly Ala Glu Ile Asp Ser Ile Asp Val Ile Arg Asp Asn

820 825 830

Asp Lys Leu Phe Ile Val Thr Glu Glu His Met Thr Ala Val Ala Ser

835 840 845

Met Asp Ser Val Ser Gly Ser

850 855

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaagcttat ggatgtggcg tcgactatcc 30

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcccgggat gaagacctcg agcttc 26

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccgcggccg cctatgatcc agacaccgag tcca 34

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgccaggct cctcgtcctc aac 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcaatctccg ctccttcgtc gtt 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcccgggat gaagacctcg agcttc 26

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggcccgggct atgatccaga caccgagtcc a 31

Claims

1.一种水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子的基因。

3.编码权利要求1所述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子的基因，其特征在于序列如SEQ ID No.1所示。

4.含权利要求2所述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子基因的真核表达载体。

5.根据权利要求4所述的真核表达载体，其特征在于所述真核表达载体为将水稻OsAKT2/3构建到pCI或pTracer-CMV3载体，所得到的重组质粒pCI-OsAKT2/3或pTracer-CMV3-OsAKT2/3。

6.权利要求1所述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子在控制植物双向整流和提高钾营养利用方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为番茄。

8.控制植物双向整流和提高钾营养利用的方法，其特征在于该方法包括将权利要求3所述水稻钾离子通道OsAKT2/3分子基因导入植物中表达的步骤。