CN104004077B - 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsMSRB2与应用 - Google Patents

一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsMSRB2与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsMSRB2与应用。该蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。本发明通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗碱胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。

Description

一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsMSRB2与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsMSRB2与应用。
背景技术
盐碱逆境一直是我国逆境生态区农业发展所面临的重大问题，已经严重制约了我国东北地区乃至全国的农业生产。据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，我国盐碱地总面积为9913万hm2，东北松嫩平原西部有盐碱地373万hm2，其中黑龙江省盐碱地面积就高达1740余万亩。为确保我国粮食供给的安全，全国耕地面积必须保证在18亿亩以上，但实际上我国的耕地面积却逐年减少，目前已逼近这一红线。因此，开发利用盐碱地和挖掘逆境生态区的生产潜力成为了保障我国农业稳定持续高效发展的重要课题。
随着分子生物学的飞速发展和基因工程技术的日臻成熟，通过转基因分子育种手段来改良作物的耐盐碱性和提高作物产量已成为可能。然而，其实现的重要前提就是挖掘耐盐碱的关键调控基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有提高植物抗逆性的蛋白及其相关的生物材料。
本发明所提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码上述蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组原生质体、或含有B2)所述重组载体的重组原生质体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组酵母菌、含有B2)所述重组载体的重组酵母菌。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子的核苷酸序列是序列表中序列1。
上述蛋白质、或上述相关生物材料在提高植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述抗逆性为抗碱胁迫。
上述蛋白质在与GsCBRLK蛋白相互作用中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种构建转基因植物的方法。
本发明所提供的构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使上述蛋白质在出发植物中过表达，进而使植物的抗逆性提高。
上述方法中，所述使上述蛋白质在受体植物中过表达的方法为：向受体植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与受体植物相比，抗逆性提高。
上述方法中，所述抗逆性为抗碱胁迫。
上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗碱胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
附图说明
图1为GsCBRLK蛋白在酵母细胞NMY51中的表达。
图2为酵母双杂交筛选及回转验证。图2A为在10mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上的复筛；图2B为在2mM3-AT、10mM3-AT、40mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上的复筛。
图3为采用酵母双杂交技术在酵母体内验证GsMSRB2与GsCBRLK蛋白相互作用，其中Ost1-NubI为阳性对照，NubG为阴性对照，NubG-GsMSRB2.1为重组酵母菌。
图4为采用BiFc技术在植物体内验证GsMSRB2与GsCBRLK蛋白相互作用。
图5为GsMSRB2蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析。
图6为GsMSRB2基因在盐碱胁迫条件下的表达模式分析。结果显示碱胁迫处理后，GsMSRB2基因表达量呈上升趋势，并在胁迫处理3h(叶)和6h(根)后达到顶峰。
图7为GsMSRB2转基因拟南芥种子耐碱性分析。图7A为野生型种子的萌发和幼苗长势情况明显不如转基因拟南芥种子；图7B为在碱胁迫下野生型种子萌发率显著低于转基因拟南芥种子的萌发率。
图8为GsMSRB2转基因拟南芥植株耐碱性分析。图8A为转基因植株的长势优于野生型；图8B为转基因植株存活率显著高于野生型；图8C为转基因植物相对导电率低于野生型。
图9为载体pPR3-N的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、野生大豆中耐碱相关蛋白编码基因GsMSRB2的分离
一、野生大豆酵母双杂交cDNA文库的构建
1、选取饱满的野生大豆G50109种子，用浓H2SO4处理10min，无菌水冲洗3～4次，25℃暗培养2-3d催芽。待芽长到1～2cm时，将其转移至1/4Hogland营养液中，置于人工气候箱中培养。
2、取3周龄野生大豆幼苗的根(根尖3cm)和叶(未完全展开的第3个三出复叶)，提取总RNA。
3、以总RNA为模板，以CDS-3Madapter和PlugOligo-3Madapter为引物，反转录合成第一链cDNA。
4、采用EasyClonePolymeraseMix进行LD-PCR获得dsDNA，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察到0.3～6Kb的弥散状条带。SfiI酶切dsDNA，纯化，去除小于300bp的DNA片段。
5、将纯化后的dsDNA与pPR3-N载体连接，电转化大肠杆菌感受态细胞DH10B，共获得约1.2×106个单克隆，文库复杂度符合要求。
6、随机挑选20个阳性克隆进行PCR检测，发现扩增条带大小在200-2000bp之间，文库覆盖度较大。
7、收集所有单克隆，提取质粒备用。
二、耐盐碱蛋白激酶基因GsCBRLK酵母双杂交诱饵表达载体的构建
1、设计GsCBRLK基因PCR扩增的引物，并在引物两端添加SfiI酶切位点(下划线所示序列为酶切识别位点)。引物序列如下：
5’-ATTAACAAGGCCATTACGGCCATGAAGAAAACACCAG-3’，
5’-AACTGATTGGCCGAGGCGGCCCCAGCAGATACAAATT-3’。
2、以pET32b-GsCBRLK质粒为模板，PCR扩增GsCBRLK基因全长CDS区。
3、与pBT3-STE载体连接，构建pBT3-STE-GsCBRLK诱饵表达载体，使GsCBRLK蛋白与LexA-VP16-Cub融合表达。
三、GsCBRLK蛋白表达及拓扑结构分析
为了检测GsCBRLK诱饵蛋白是否表达，采用LiAc法制备酵母NMY51感受态细胞，通过LiAc/PEG法将pBT3-STE-GsCBRLK诱饵表达载体转化酵母感受态细胞，再用液体SD/-Leu培养基活化重组酵母菌，采用TCA法提取酵母总蛋白，进行Westernblot检测。结果显示在含pBT3-STE-GsCBRLK质粒的酵母总蛋白中能够检测到目的条带，说明GsCBRLK蛋白在酵母细胞NMY51中能够正常表达(图1)。
为了统计重组酵母菌在不同选择培养基上的生长情况，将pBT3-STE-GsCBRLK/pOst1-NubI、pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N、pTSU2-APP/pNubG-Fe65、pTSU2-APP/pPR3-N共转化酵母NMY51感受态细胞，并涂板至SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade筛选培养基，30℃倒置培养3-7d后发现：含pBT3-STE-GsCBRLK/pOst1-NubI的重组酵母菌在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基上均能正常生长，说明GsCBRLK蛋白拓扑结构符合该酵母双杂交系统；含pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N的酵母菌在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，但在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上则不生长(表1)。因此，在进行大规模酵母双杂交筛选时，我们采用SD/-Trp-Leu-His作为筛选培养基。
表3-1GsCBRLK蛋白拓扑结构分析
Table3-1AnalysisofthetopologicalstructureofGsCBRLKprotein
四、利用酵母双杂交技术从野生大豆cDNA文库中筛选GsMSRB2基因
采用PEG/LiAc法，将文库质粒转化含pBT3-STE-GsCBRLK的酵母NMY51感受态细胞，并涂板至SD/-Trp-Leu-His培养基，共筛选获得了131个阳性克隆。将阳性克隆划线至含10mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上进行复筛，共获得66个阳性克隆(图2A)。提取重组酵母质粒，转化大肠杆菌使Prey质粒大量复制，与pBT3-STE-GsCBRLK共转化酵母NMY51感受态。经过2mM3-AT、10mM3-AT、40mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上的复筛，共获得24个阳性克隆(图2B)。将阳性克隆送交测序，发现其中5个克隆均编码全长或部分GsMSRB2基因。根据栽培大豆同源基因序列设计PCR扩增引物(5’-ATGGCTGCACCAACACCGATTC-3’和5’-TCATATTGAAGAACTAGCATTTCC-3’)，同源克隆GsMSRB2基因。
实施例2、GsMSRB2与GsCBRLK蛋白相互作用验证
为了证明GsMSRB2与GsCBRLK蛋白能否相互作用，本发明采用酵母双杂交技术和BiFc技术进行验证。
一、采用酵母双杂交技术在酵母体内验证GsMSRB2与GsCBRLK蛋白相互作用
1、以3周龄野生大豆幼苗的cDNA为模板，采用特异引物PCR扩增GsMSRB2基因全长CDS区(下划线所示序列为酶切识别位点)。
引物序列如下：5’-AAAGAATTCAATGGCTGCACCAA-3’，
5’-TTTGTCGACTCATATTGAAGAACTAGCA-3’。
2、扩增产物经EcoRI和SalI双酶切后与pPR3-N载体(图9)(DUAL，CatNo.P03234)连接，构建酵母双杂交表达载体，使GsMSRB2蛋白与NubG融合表达，将得到的重组载体记作pPR3-N-GsMSRB2。将载体进行测序验证，结果表明连入载体的GsMSRB2基因序列是SEQIDNo.1中自5’末端起第1-417位核苷酸。
3、采用PEG/LiAc法，将pBT3-STE-GsCBRLK与pPR3-N(阴性对照)、pOst1-NubI(阳性对照)、pPR3-N-GsMSRB2载体共转化酵母NMY51感受态细胞，PCR鉴定获得阳性克隆。
4、用液体SD/-Trp-Leu培养基，将重组酵母菌活化至OD600＝0.6，按1:10、1:100、1:1000稀释菌液。取1μL菌液分别点于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade固体培养基，30℃培养4d。
结果发现含pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N的重组酵母菌能在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，而不能在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上生长。而含pBT3-STE-GsCBRLK/pOst1-NubI和pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N-GsMSRB2的重组酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上均能正常生长(图3)。该结果表明GsMSRB2能够在酵母体内与GsCBRLK蛋白相互作用。
二、采用BiFc技术在植物体内验证GsMSRB2与GsCBRLK蛋白相互作用
1、采用含酶切位点的基因特异引物，以pBT3-STE-GsCBRLK和pPR3-N-GsMSRB2质粒为模板，PCR扩增GsCBRLK和GsMSRB2基因。引物序列如下：
GsCBRLK的扩增引物：5’-TAACTCGAGATGAAGAAAACACCAGCCC-3’，
5’-GGGACTAGTAGCAGATACAAATTTATAG-3’；
GsMSRB2的扩增引物：5’-TTACTCGAGATGGCTGCACCAA-3’，
5’-CGGACTAGTTATTGAAGAACTAGCA-3’。
2、PCR产物双酶切后分别与pA7-NYFP和pA7-CYFP载体(Ahighlyefficienttransientprotoplastsystemforanalyzingdefencegeneexpressionandprotein-proteininteractionsinrice)连接，构建植物瞬时表达载体，使GsCBRLK与NYFP融合表达(GsCBRLK-NYFP)，GsMSRB2与CYFP融合表达(GsMSRB2-CYFP)，将两种载体分别记作pGsCBRLK-NYFP和pGsMSRB2-CYFP。将载体进行测序验证，结果表明连入载体的GsMSRB2基因序列是SEQIDNo.1中自5’末端起第1-417位核苷酸。
3、采用PEG法将pGsCBRLK-NYFP和pGsMSRB2-CYFP共转化拟南芥原生质体，用激光共聚焦观察YFP荧光信号。
图4激光共聚焦结果显示NYFP/CYFP(阴性对照)共表达时未观察到YFP荧光信号，而共表达AtbZIP63-NYFP/AtbZIP63-CYFP(阳性对照)、GsCBRLK-NYFP/GsMSRB2-CYFP的原生质体中能观察到荧光信号。该结果表明GsMSRB2能够在植物体内与GsCBRLK蛋白相互作用。
实施例3、GsMSRB2蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析
为了定位GsMSRB2蛋白在植物细胞内位置，对GsMSRB2蛋白进行了亚细胞定位分析。具体步骤如下：
1、采用基因特异引物PCR扩增GsMSRB2基因全长CDS区(下划线所示序列为酶切识别位点)。
引物序列如下：5’-TACTCGAGATGGCTGCACCAAC-3’，
5’-CGGACTAGTTATTGAAGAACTAGCATT-3’。
2、将扩增产物与pBSK-eGFP载体连接，构建GsMSRB2-eGFP融合表达载体。
3、通过PEG法转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。
如图5所示，该结果表明GFP阳性对照在原生质体细胞中遍在表达，而GsMSRB2蛋白主要定位在细胞膜和细胞质中。
实施例4、GsMSRB2基因在盐碱胁迫条件下的表达模式分析
为了研究GsMSRB2基因在盐碱胁迫条件下的表达情况，采用荧光定量技术对野生大豆幼苗的GsMSRB2基因在盐碱胁迫条件下的表达量情况进行了分析，步骤如下：
1、选取3周龄的野生大豆幼苗并对其进行50mMNaHCO3(pH8.5)碱胁迫处理。
2、分别在0、1、3、6、12h取幼嫩叶片和根尖组织，提取总RNA，反转录获得cDNA。
3、以所获得的cDNA为模板，通过Real-timePCR对GsMSRB2基因进行表达量检测。
定量分析方法采用比较CT法(△△CT)，以GAPDH基因(Genbank登录号：DQ355800)为内参，未经处理的样品作为参照因子。经GAPDH基因均一化处理后，通过2-△△CT法计算GsMSRB2基因表达量变化差异，以处理样本相对于未处理样本的倍数表示。
GsMSRB2基因特异引物序列为：5’-CTGTGCTGGCTGTGGGACT-3’，
5’-GCGTTCATCAGTTGGGGTCT-3’；
GAPDH基因特异引物序列为：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’，
5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。
结果显示在碱胁迫处理后，GsMSRB2基因表达量呈上升趋势，并在胁迫处理3h(叶)和6h(根)后达到顶峰(图6)，表明GsMSRB2基因的表达受碱胁迫诱导。
实施例5、GsMSRB2转基因拟南芥植株的获得及耐碱性分析
一、GsMSRB2基因植物表达载体构建
1、以pPR3-N-GsMSRB2质粒为模板，采用如下引物PCR扩增GsMSRB2基因全长CDS区。
引物序列如下：5’-GGCTTAAUATGGCTGCACCAAC-3’，
5’-GGTTTAAUTCATATTGAAGAACTAGCATT-3’。
2、采用pCAMBIA330035Su载体(该载体在文献“Advancinguracil-excisionbasedcloningtowardsanidealtechniqueforcloningPCRfragments，HussamH.Nour-Eldin,BjarneG.Hansen,MortenH.H.JacobK.JensenandBarbaraA.Halkier，NucleicAcidsResearch,2006,3(18):e122)”中公开过，公众可从东北农业大学获得)作为植物超量表达载体，将扩增产物与pCAMBIA330035Su载体连接，构建GsMSRB2植物超量表达载体pCAMBIA330035Su-GsMSRB2。测序验证，表明该重组载体中连入的GsMSRB2基因序列是SEQIDNo.1中自5’末端起第1-417位核苷酸。
3、采用冻融法，将GsMSRB2植物超量表达载体转化根癌农杆菌GV3101，经PCR鉴定获得重组农杆菌。
二、GsMSRB2转基因拟南芥的获得及鉴定
1、将上述重组农杆菌通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。
2、将T0代种子表面消毒后，播种于含25mg/L的1/2MS培养基上进行筛选。
3、将T1代抗性苗移栽至营养钵中培养，提取基因组DNA，进行PCR鉴定。
4、提取总RNA，采用半定量RT-PCR，以拟南芥ACTIN2基因为内参，分析GsMSRB2基因在转基因植株中的表达量。
5、将RT-PCR阳性的T1代转基因拟南芥单株收种子，并分别播种于含25mg/L的1/2MS培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到T3代转基因拟南芥纯合体株系。
三、GsMSRB2转基因拟南芥耐碱性分析
1、为了比较GsMSRB2转基因拟南芥与野生型拟南芥在碱胁迫下的种子萌发情况。选取饱满的野生型和转基因拟南芥纯合体种子，用5％NaClO处理6-8min，灭菌ddH2O冲洗5-7次，4℃春化3d，播种于正常、8mMNaHCO3的1/2MS培养基、10mMNaHCO3的1/2MS培养基，22℃培养8d，观察拟南芥种子萌发及幼苗生长状态。各株系采用30棵植株，实验重复三次。
结果如图7所示，碱胁迫严重抑制了野生型与转基因拟南芥种子的萌发(图7A)，但GsMSRB2转基因株系的种子萌发率显著高于野生型(图7B)。
2、为了比较碱胁迫处理后GsMSRB2转基因拟南芥与野生型拟南芥植株长势，统计存活率、电导率等情况。选取饱满的野生型和转基因拟南芥纯合体种子，春化后播种于营养钵中(营养土：君子兰土：蛭石1：1：1)，置于人工气候培养箱中培养。选取长势一致的4周龄拟南芥植株，每3d浇灌1次50mMNaHCO3(pH8.5)溶液进行碱胁迫处理，观察胁迫处理后植株长势，统计存活率、电导率等指标。
结果发现，碱胁迫处理后，转基因拟南芥的长势优于野生型(图8A)，存活率显著高于野生型(图8B)，而相对离子渗透则低于野生型(图8C)。上述结果表明GsMSRB2基因超量表达显著提高了植物的碱胁迫耐性。
构建转空载体pCAMBIA330035Su的拟南芥，结果转空载体拟南芥的表型与野生型一致。

Claims (5)

1.如下1)或2)在提高植物抗逆性中的应用；
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)与1)所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组原生质体、或含有B2)所述重组载体的重组原生质体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组酵母菌、含有B2)所述重组载体的重组酵母菌；
所述抗逆性为抗碱胁迫；
所述植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列是序列表中序列1。
3.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在与GsCBRLK蛋白相互作用中的应用。
4.一种构建耐逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：使由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在出发植物中过表达，进而使植物的抗逆性提高；所述抗逆性为抗碱胁迫；
所述受体植物为拟南芥。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述使所述蛋白质在受体植物中过表达的方法为：向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与受体植物相比，抗逆性提高。
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