CN114621976B

CN114621976B - 稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用

Info

Publication number: CN114621976B
Application number: CN202011444015.9A
Authority: CN
Inventors: 王加峰; 谢华斌; 陈淳; 郭涛; 王慧; 刘永柱; 肖武名; 黄明; 黄翠红
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN114621976A

Abstract

本发明公开了稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用，属于植物基因工程技术领域。稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。本发明发明人鉴定并证实了证实OsMYB1R参与了水稻对稻瘟病菌的防御反应，是一种重要的参与水稻抗病性的负调控基因。本发明有助于更好地了解OsMYB1R的作用机制，OsMYB1R的克隆为进一步了解水稻‑病原菌互作，抗病信号传导通路奠定基础，在育种中有较大的应用价值。

Description

稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种水稻抗病相关基因的应用，具体涉及一种稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用。

背景技术

水稻是我国及大多数发展中国家的主要粮食作物，全球超过50％的人以水稻为主食。然而，许多病原微生物会引起水稻产生严重的病害，最终导致严重的减产，损失严重。稻瘟病是由丝状真菌稻瘟菌(Magnaportheoryzae)引起的，是水稻中最具毁灭性的真菌性病害(Pennisi，2010)。探索病原菌的病害系统是近几十年来研究的重点，稻瘟病菌目前已经成为研究水稻与病原菌互作的模式菌。

当植物受到病原菌侵染时，会触发植物的先天免疫系统产生抗病反应。植物先天免疫系统包括两个层次：其一是病原相关分子模式激发的免疫反应(Pattern-triggeredImmunity，PTI)，其二是效应蛋白激发的免疫反(Effector-triggeredImmunity，ETI)。一般而言，PTI免疫反应发生在病原菌与水稻接触的早期阶段，具有广谱、非特异性的特点，在田间生产中能够抵御各类病原菌的侵害，但其抗性往往较弱。而ETI是水稻抗病基因所介导的特异性识别，进而引发快速、精准的防卫反应，其抗性反应通常比较强烈(张杰等，2017)。

研究表明，转录因子能够参与大多数植物胁迫应答过程。如在拟南芥和水稻中，发现了数十种WRKY转录因子参与免疫调控反应。MYB转录因子也在多种植物病原体防御中起着非常重要的作用(Stracke et al.，2001；Dubos et al.，2010)。许多MYB转录因子的过表达激活了病程相关基因的表达，并触发了系统获得性抗性(systemic acquiredresistance，SAR)，这种反应保护植物免受细菌、真菌和病毒的影响，并受植物激素(如JA和SA)的调节(Durrant et al.，2004；Bostock，2005)。

MYB转录因子是植物中功能各异、数量繁多的转录因子家族之一，通常会参与到植物的生长发育、代谢以及非生物和生物胁迫等众多生理过程中。根据保守R序列的个数可将MYB家族转录因子分为四个亚类(Dubos et al.，2010)：第一类含有一个R序列或含有两个但间隔很远的亚类为1R-MYB或MYB-related，该亚类可以位于肽链的中间或者两端，是重要的端粒结合蛋白，在调节基因转录过程也有一定的作用(Nemie-Feyissa et al.，2014)；第二类含有2个R结构域，称为R2R3-MYB，是植物中数目最多的一类，广泛参与环境胁迫、激素应答、病虫害防御等过程中；第三类含有3个R结构域称为R1R2R3-MYB，植物中的3R-MYB蛋白与真菌中的高度同源，主要参与细胞周期和细胞分化，在抗逆胁迫过程中也发挥作用(Hagaet al.，2007)；第四类含有4个R结构域称为4R-MYB，即为R1/R2结构的重复，只在极少数植物中编码，目前仅在拟南芥、葡萄、杨树等植物中发现，对该亚类蛋白功能研究较少(牛义岭等，2016)。

鉴定抗病相关基因有助于深入揭示水稻的抗病机理及水稻与病原菌的具体互作机制，进一步培育相关的抗病品种，可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害，增强植物的抗病性。这些研究对水稻基因功能研究及抗病水稻育种都具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用。OsMYB1R属于MYB家族转录因子，本发明发明人首次发现受稻瘟病菌诱导后，OsMYB1R基因会被稻瘟病菌的侵染所抑制，但参与到抗病反应后期的信号调节通路中，OsMYB1R过表达植株更易感病。可以利用本发明基因构建水稻OsMYB1RCas9基因编辑载体，应用于提高水稻的稻瘟病抗性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

所述的应用优选为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。

所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的cDNA全长序列如SEQ ID NO:22所示。

所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的全长基因组序列如SEQ ID NO:23所示。

所述的应用，是下调或敲除所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在水稻中的表达。

所述的稻瘟病病菌为稻瘟病菌(M.oryzae)GDYJ7。

一种针对上述稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的编辑载体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，所述的编辑载体用于敲除OsMYB1R基因。

一种包含上述编辑载体的宿主菌在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

所述的应用包括水稻抗稻瘟病育种和培育转基因水稻。

一种培育转基因水稻的方法，具体操作为：用CRISPR载体构建针对上述稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的敲除靶点的敲除载体；再用所述敲除载体转化水稻组织；将转化的水稻组织培育成水稻植株。

所述的转化的方式为农杆菌转化法。

所述的农杆菌转化法中所用的农杆菌为农杆菌EHA105。

本发明是前期通过免疫共沉淀(Co-IP)技术鉴定到了稻瘟病菌效应蛋白Avr-Pik互作的转录因子OsMYB1R。OsMYB1R属于MYB家族下CCA1亚族，其MYB结构域具有转录激活特性。

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个降低水稻稻瘟病抗性的转录因子OsMYB1R。OsMYB1R(LOC_Os02g46030)基因组序列全长为3,035bp，CDS全长为1,476bp，包含有6个外显子和5个内含子，编码491aa。OsMYB1R蛋白结构中含有保守的MYB保守结构域，OsMYB1R蛋白含有1个位于N端的R1保守序列，其后含有一个有保守的SHAQKFY序列，属于MYB-Related类型下的CCA1-like(Circadian Clock Associated1)亚类蛋白。

本发明还提供了本发明基因的编辑载体和含有所述编辑载体的宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用。OsMYB1R的表达模式分析发现，OsMYB1R受稻瘟病菌诱导。过表达OsMYB1R会降低水稻的稻瘟病抗性，OsMYB1R负向调控稻瘟病抗性。在感病品种ZE中，OsMYB1R的表达量相对较低，直到在第36h时才上升达到峰值，这一结果表明OsMYB1R基因可能被稻瘟病菌的侵染所抑制，OsMYB1R可能参与到抗病反应后期的信号调节通路中。

OsMYB1R负向调控稻瘟病抗性。通过构建相应的载体转化水稻，对其所参与的抗病通路进行研究，将其整合进入复杂的抗病调控网络，为水稻抗稻瘟病育种提供一定的理论指导。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个MYB家族蛋白的基因OsMYB1R，证实OsMYB1R参与了水稻对稻瘟病菌的防御反应，是一种重要的参与水稻抗病性的负调控基因。本发明有助于更好地了解OsMYB1R的作用机制，OsMYB1R的克隆为进一步了解水稻-病原菌互作，抗病信号传导通路奠定基础，在育种中有较大的应用价值。

附图说明

图1是OsMYB1R全长基因结构示意图；其中，黑色区域为外显子，空白长方格区域为5'非翻译区与3'非翻译区。

图2是OsMYB1R与其它MYB家族蛋白氨基酸序列相似性比较结果图。

图3是OsMYB1R在抗病材料中的表达受到稻瘟病菌的诱导的结果图。

图4是OsMYB1R转录激活特性检测结果图。

图5是接种稻瘟病菌8d后转基因植株的病情调查结果图；其中，OX-OsMYB1R为OsMYB1R过表达转化株，Cas9-osmyb1r为基因编辑植株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所使用的各种原料及各项设备，如无特别说明，均为常规市售产品，能够通过市场购买直接获得。

本发明实施例所用引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司和上海生工生物工程股份有限公司合成。

所述的水稻高抗稻瘟病株系H4和感病品种中二软占(ZE)已在文献“水稻抗稻瘟病蛋白Pik₂-H4基因的克隆及互作蛋白的筛选[J].广东农业科学,2014,(04):156-160.”中公开。

所述的稻瘟病菌(M.oryzae)GDYJ7已在文献“吴澎志，响应稻瘟病菌侵染的水稻MicroRNA鉴定及初步功能研究(D)，2019”中公开。

所述的过量表达载体pOX在文献“水稻SDG711和SDG723的克隆与功能分析[D].华南农业大学,2012”中公开。

所述的pGTR质粒和pRGEB32载体及农杆菌EHA105已在文献“Xie,K,MinkenbergB.,YangY.,Boosting CRISPR/Cas9 mμltiplex editing capability with theendogenous tRNA-processing system.Proceedings of the National Academy ofSciences 2015,112(11),”中公开。

实施例1 OsMYB1R的序列分析及克隆

1)水稻叶片总RNA的提取与OsMYB1R的克隆

取中二软占/H4四叶期水稻幼苗，在研钵中用液氮研磨成粉状，转入1.5mL离心管，并按照每100mg材料加入1mL的比例加入Trizol试剂(Invitrogen公司)，混合均匀；按照每100mg材料加入200μL的比例加入氯仿，混合均匀，10,000g，4℃离心15min，弃去下层有机相，收集水相转移至的离心管内；加入600μL异丙醇，混合均匀，室温静置20min，10,000g，4℃离心15min，收集沉淀，待异丙醇挥发后溶于无RNA酶的超纯水中。取出-80℃保存的水稻叶片总RNA，加入2μL的Oligo(dT)₁₆(10mM)，混匀后置于70℃中水浴5min；水浴5min后，在冰上向EP管中先后加入dNTP Mixture(10mM)2μL、5×RT Buffer 4μL、RNase抑制剂1μL(10U/μL)、RNase-free ddH₂O 8μL、ReverTraAce1μL；将EP管置于PCR仪中，按30℃10min，42℃60min，99℃5min，40℃5min反应后，得到第一链的单链cDNA，利用引物：OsMYB1R-F：5'-ATGGAGATGGCCTGTTTGCC-3'(SEQ ID NO:1)、OsMYB1R-R：5'-TCACAAGCACAGCCTTGTCAGC-3'(SEQ ID NO:2)进行PCR。PCR反应体系为：cDNA模板2μL、上下游引物(10μM)各1.5μL、dNTP(2mM)5μL、10×KOD PCR buffer 5μL、MgSO₄(25mM)2μL、KOD Plus 1μL，补ddH₂O至50μL。扩增条件为：94℃变性3min、55℃30s、68℃2min 32个循环、72℃延伸10min，得到全长的OsMYB1RcDNA，然后将其送往上海英俊公司进行测序分析。

2)OsMYB1R序列分析与同源比对分析

OsMYB1R基因组序列全长3,033bp，CDS全长为1,476bp，包含6个外显子和5个内含子，编码491aa(图1)。利用NCBI Blast Protein功能检测OsMYB1R蛋白结构中含有保守的MYB保守结构域，通过CLC sequence将OsMYB1R基因序列与同源家族基因序列比对发现，OsMYB1R蛋白含有1个位于N端的1R保守序列，其后含有一个保守的SHAQKFY序列，属于MYB-Related类型下的CCA1-like(Circadian Clock Associated1)亚类蛋白(图2)。

实施例2 OsMYB1R的表达模式分析

将抗病品种H4以及感病品种ZE分别接种稻瘟病菌GDYJ7(ddH₂O为对照)，并且在接种后不同时间点取样，利用实时荧光定量分别检测OsMYB1R的表达变化情况。所用的引物序列如下：

Actin-F：5'-GAAGATCACTGCCTTGCTCC-3'(SEQ ID NO:3)

Actin-R：5'-CGATAACAGCTCCTCTTGGC-3'(SEQ ID NO:4)

OsMYB1R-qPCR-F：5'-GAGCAGCATGCAACAGTTTCTC-3'(SEQ ID NO:5)

OsMYB1R-qPCR-R：5'-GGCTCCCGTTGTAGCTCAAC-3'(SEQ ID NO:6)

结果显示(图3)，稻瘟病菌侵染后，OsMYB1R的表达量在抗病品种H4中表现为先下降后上升再下降的变化趋势，在第24h上升到较高水平，但是在感病品种ZE中OsMYB1R的表达量相对较低，直到在第36h时才上升达到峰值，这一结果表明OsMYB1R基因可能会被稻瘟病菌的侵染所抑制，参与到抗病反应后期的信号调节通路中。

实施例3 OsMYB1R的转录激活活性分析

将OsMYB1R蛋白分成两段，MYB(1-135aa)与C端(136-491aa)。将这些分段与全长序列分别与pGBKT7质粒(Clontech公司)连接构建获得重组质粒，将它们分别转入酵母菌株Y2HGold(Clontech公司)中，在酵母表达系统中检测转录因子OsMYB1R的具体转录激活区域。所用的引物序列如下：

BD-OsMYB1R-F：

5'-atggccatggaggccgaattcATGGAGATGGCCTGTTTGCC-3'(SEQ ID NO:7)

BD-OsMYB1R-R：

5'-ccgctgcaggtcgacggatccTCACAAGCACAGCCTTGTCAGC-3'(SEQ ID NO:8)

BD-OsMYB1R-MYB-F：

5'-atggccatggaggccgaattcATGGAGATGGCCTGTTTGCC-3'(SEQ ID NO:9)

BD-OsMYB1R-MYB-R：

5'-ccgctgcaggtcgacggatccAGGGATCTGGATGGCCGC-3'(SEQ ID NO:10)

BD-OsMYB1R-C-F：

5'-atggccatggaggccgaattcCCGCCGCGGCCGAAGAGG-3'(SEQ ID NO:11)

BD-OsMYB1R-C-R：

5'-ccgctgcaggtcgacggatccCAAGCACAGCCTTGTCAGCTC-3'(SEQ ID NO:12)

结果表明(图4)，只有全长的OsMYB1R蛋白及分段后OsMYB1R-MYB具有转录激活特性。表明OsMYB1R蛋白的MYB保守结构域只负责转录因子自身的激活特性。

实施例4 OsMYB1R的转基因植株稻瘟病抗性鉴定

1)OsMYB1R过表达的转基因水稻的构建

利用OsMYB1R-pOX-F与OsMYB1R-pOX-R扩增OsMYB1RcDNA片段，利用同源重组的方法将此cDNA连接到双元载体pOX载体上。得到OX-OsMYB1R重组载体，转化大肠杆菌DH5α后通过测序鉴定阳性转化子用于后续农杆菌转化实验，所用农杆菌为EHA105，转化材料为H4。所用引物序列如下：

OsMYB1R-pOX-F：

5'-gggtaccggcgcgccaagcttATGGAGATGGCCTGTTTGCC-3'(SEQ ID NO:13)

OsMYB1R-pOX-R：

5'-caattcacacttgtaggatccTCACAAGCACAGCCTTGTCAGC-3'(SEQ ID NO:14)

2)OsMYB1R敲除的转基因水稻的构建

OsMYB1R敲除载体构建参考谢卡斌教授2015年发表文章中的方法(Xieet al.，2015)。利用OsMYB1R的CDS序列在CRISPR/Cas9在线靶点设计网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)寻找两个合适的靶点，根据靶点设计引物，以pGTR质粒为模板扩增构建gRNA-靶点序列-tRNA-gRNA-靶点序列-tRNA片段。将Cas9蛋白表达载体pRGEB32用BsaI进行单酶切，将得到的带有靶点的片段与载体进行重组连接，将重组载体转化大肠杆菌DH5α后进行测序鉴定，阳性转化子将用于后续农杆菌转化实验，所用农杆菌为EHA105，转化材料为H4。所用引物序列如下：

OsMYB1R-bd1-F：

5'-taGGTCTCCTGAGATGATCCAgttttagagctagaa-3'(SEQ ID NO:15)

OsMYB1R-bd1-R：

5'-cgGGTCTCACTCAGGAGCCATtgcaccagccgggaa-3'(SEQ ID NO:16)

OsMYB1R-bd2-F：

5'-taGGTCTCCAACTTCTGCGCGgttttagagctagaa-3'(SEQ ID NO:17)

OsMYB1R-bd2-R：

5'-cgGGTCTCAAGTTCTTCTCTAtgcaccagccgggaa-3'(SEQ ID NO:18)

Recom-F：

5'-GTGCAGATGATCCGTGGCAACAAAGCACCAGTGGT-3'(SEQ ID NO:19)

Recom-R：

5'-CTATTTCTAGCTCTAAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG-3'(SEQ ID NO:20)

3)转基因植株稻瘟病抗性鉴定

上述转基因植株经潮霉素筛选鉴定及荧光定量PCR鉴定后，我们选取了过表达和功能完全缺失的基因编辑的纯合系植株(各3株)用于下一步实验。对过表达及基因编辑植株接种稻瘟病菌GDYJ7(ddH₂O作为对照)，8d后调查病情。

结果表明(图5)：在抗病材料(WT)的背景下OsMYB1R过表达植株更易感病，而OsMYB1R基因编辑植株(Cas9-osmyb1r)未有显著的抗性变化，推测OsMYB1R作用途径被病原菌无毒基因(AVR-Pik)利用，OsMYB1R过表达后会促进病原菌的侵染，因此可以通过在水稻中敲除该基因来增强稻瘟病抗性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-F

<400> 1

atggagatgg cctgtttgcc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-R

<400> 2

tcacaagcac agccttgtca gc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-F

<400> 3

gaagatcact gccttgctcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-R

<400> 4

cgataacagc tcctcttggc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-qPCR-F

<400> 5

gagcagcatg caacagtttc tc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-qPCR-R

<400> 6

ggctcccgtt gtagctcaac 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BD-OsMYB1R-F

<400> 7

atggccatgg aggccgaatt catggagatg gcctgtttgc c 41

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BD-OsMYB1R-R

<400> 8

ccgctgcagg tcgacggatc ctcacaagca cagccttgtc agc 43

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BD-OsMYB1R-MYB-F

<400> 9

atggccatgg aggccgaatt catggagatg gcctgtttgc c 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BD-OsMYB1R-MYB-R

<400> 10

ccgctgcagg tcgacggatc cagggatctg gatggccgc 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BD-OsMYB1R-C-F

<400> 11

atggccatgg aggccgaatt cccgccgcgg ccgaagagg 39

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BD-OsMYB1R-C-R

<400> 12

ccgctgcagg tcgacggatc ccaagcacag ccttgtcagc tc 42

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-pOX-F

<400> 13

gggtaccggc gcgccaagct tatggagatg gcctgtttgc c 41

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-pOX-R

<400> 14

caattcacac ttgtaggatc ctcacaagca cagccttgtc agc 43

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-bd1-F

<400> 15

taggtctcct gagatgatcc agttttagag ctagaa 36

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-bd1-R

<400> 16

cgggtctcac tcaggagcca ttgcaccagc cgggaa 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-bd2-F

<400> 17

taggtctcca acttctgcgc ggttttagag ctagaa 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R-bd2-R

<400> 18

cgggtctcaa gttcttctct atgcaccagc cgggaa 36

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Recom-F

<400> 19

gtgcagatga tccgtggcaa caaagcacca gtggt 35

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Recom-R

<400> 20

ctatttctag ctctaaaaca aaaaaaaaag caccgactcg gtg 43

<210> 21

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R的氨基酸序列

<400> 21

Met Glu Met Ala Cys Leu Pro Gly Asn Ala Met Ala Thr Asp Glu Asn

1 5 10 15

Gly Ala Asp Asp Arg Ala Gly Gly Glu Ser Thr Val Asp His Leu Arg

20 25 30

Ser His Met Asn Tyr Gly Asp Met Asp Leu Ser Gly Glu Glu His Val

35 40 45

Pro Lys Ala Arg Lys Pro Tyr Thr Ile Thr Lys Gln Arg Glu Lys Trp

50 55 60

Thr Asp Glu Glu His Arg Leu Phe Leu Glu Ala Leu Gln Leu His Gly

65 70 75 80

Arg Ala Trp Arg Arg Ile Gln Glu His Ile Gly Thr Lys Thr Ala Val

85 90 95

Gln Ile Arg Ser His Ala Gln Lys Phe Phe Ser Lys Val Val Arg Glu

100 105 110

Ser Ser Gly Ser Asn Thr Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Ile Gln Ile Pro Pro Pro Arg Pro Lys Arg Lys Pro Ala

130 135 140

His Pro Tyr Pro Arg Lys Val Asp Gly Ala Ala Lys Lys His Val Pro

145 150 155 160

Ala Leu Arg Gln Leu Glu Lys Pro Pro Leu Trp Met Gln Ser Leu Ser

165 170 175

Glu Gln Glu Glu Gly Ser Pro Thr Ser Val Leu Thr Ala Ala Gln Ile

180 185 190

Gly Thr Glu Ala Leu Gly Gly Gly Phe Ser Asn Asn Ser Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Leu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Thr Asp Glu His Val Asp Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Pro Ala Ser Ser Val Asp Arg Glu Asp Gly Cys Leu Ser

225 230 235 240

Pro Ser Ile Pro Thr Ala Glu Leu Ala Met Gln Ala Pro Asn Thr Lys

245 250 255

Met Ser Ile Ala Thr Thr Asp Ala Lys Glu Ala Ser Ser Glu Ala Ser

260 265 270

Val Phe Arg Leu Phe Gly Lys Ser Val Val Val Lys Asp Ser Asp Gln

275 280 285

Leu His Leu Leu Asn Gly Ser Asn Ile Ala Thr Ser Gly Ser Val Glu

290 295 300

Arg Ala Thr Arg Asn Ile Leu Val Pro Ser Phe Ala Ala Ala Pro Glu

305 310 315 320

Gly Ser Ser Ser Asn Pro Trp Pro Ser Ser Met Gln Gln Phe Leu Tyr

325 330 335

Phe Leu Pro Arg Ser Asp Gly Phe Ala Ala Gln Pro Val Met Pro Trp

340 345 350

Leu Ser Tyr Asn Gly Ser Leu Pro Cys Ala Leu Phe Tyr Pro Ala Ala

355 360 365

Ala Ala Ala Ala Asn Gln Gln Cys His Arg Asp Ser Glu Gly Val Glu

370 375 380

Phe Arg Val Ser Gln Arg Glu Gly Ser Leu Thr Gly Ser Asn Thr Ala

385 390 395 400

Ser Ser Val Val Leu Gly Ser Ser Ala Ala Val Pro Ala Ala Ala Ala

405 410 415

Ala Ala Gln Asn Ser Asp Val Ala Glu Ser Arg Gly Gln Gly Asn Ser

420 425 430

Arg Glu Ala Ala Ala Ser Pro Arg Leu Thr Lys Cys Glu Ser Ser Ala

435 440 445

Ser Val Thr Leu Leu Gln Arg Gly Phe Met Pro Tyr Lys Arg Cys Ala

450 455 460

Ala Glu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Glu Ala Ala Gly Gly Glu Glu Ala

465 470 475 480

Val Ala Asp Gly Glu Leu Thr Arg Leu Cys Leu

485 490

<210> 22

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R的cDNA全长序列

<400> 22

atggagatgg cctgtttgcc gggaaacgcc atggcaaccg acgaaaacgg tgccgacgat 60

cgcgccggcg gcgagagcac cgtggatcat ctcaggagcc atatgaacta cggcgacatg 120

gatttgtcag gggaagagca cgtgccaaag gcgcgaaagc cgtacacgat cacgaagcag 180

cgcgagaagt ggacggacga ggagcacagg ctgttcttgg aagccctgca gctgcacggc 240

cgcgcatggc gccgtataca agagcacata ggtaccaaga ctgccgtgca aatccgtagc 300

cacgcgcaga agttcttctc taaggtcgtc agagaatctt cggggagtaa caccggctcg 360

ggcggcgcgt ccgccgcggc ggcggcggcg gccatccaga tccctccgcc gcggccgaag 420

aggaagccgg cgcacccgta cccgcgcaag gtggacggcg cggccaagaa gcacgtcccg 480

gcgctcaggc agctggagaa gccgccgttg tggatgcagt ccctgtccga gcaggaggag 540

ggctcgccga cgtcggtgct gacggcggcg cagataggca ccgaggccct gggcggtggg 600

ttctcgaata actcgagcgg cagcgggtcg ctggctccgt cagccgccgg tacggatgag 660

catgtcgacg gtggcggctc gccggcgtcg tcggtggaca gagaggacgg gtgcctctca 720

ccgagcatcc cgactgctga gttggctatg caggcgccaa atactaagat gtcaattgca 780

accacggatg ccaaagaagc atcctcagaa gcatcagtct tcaggctatt cggaaagagc 840

gtagtggtta aggattcaga ccagctgcac ctgcttaatg gcagtaacat tgcaacgagt 900

ggttcagttg agagagcaac cagaaacata ctagtacctt cttttgctgc tgccccagaa 960

gggagctcgt cgaatccatg gccgagcagc atgcaacagt ttctctactt ccttcctcga 1020

tcggatggtt tcgccgcgca acctgtcatg ccatggttga gctacaacgg gagccttcca 1080

tgcgcgctgt tctacccggc ggcggcggcg gctgcgaacc agcagtgcca ccgtgattca 1140

gagggcgtag agttcagagt ctcgcagagg gaaggatcgc tgacgggctc gaacacggcc 1200

tccagcgtcg tgcttggatc gtcggcggcg gtaccggcgg cggcggcggc ggctcagaat 1260

tcggacgtcg cggagtcccg tggccaaggg aacagcaggg aggcggcggc ctcgccacgg 1320

ctgaccaagt gcgagagctc ggcgtccgtc accctgctgc agaggggctt catgccgtac 1380

aagaggtgcg cggcggagag cgagctgctg cgatcggagg ccgccggagg agaggaggcc 1440

gtcgccgacg gtgagctgac aaggctgtgc ttgtga 1476

<210> 23

<211> 3035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsMYB1R的全长基因组序列

<400> 23

agtgcgacgg ggcctacgta acgctcgctt ctttgcctcc tcgttccctt ctcctcctca 60

tctcccccca tctcgtcgtc ctcatcaaca acatcgagga gaaaactcgc aaagattgcg 120

gggtttggga ggcgctgatt ttttggcttt ggtgtggcga tcctgtggag tgtggtttgg 180

tttgggagga gttcggtttt ttcagaatgg agatggcctg tttgccggta aattgagttt 240

gatctttccg tttcttttct tggcgagatc gtttttgaat gaactttgtt tttcggatta 300

aatgatgtta ctgggaactg accgtgtgct gttttttccc ctctttttgt ggccgttctg 360

tgctattcag ggaaacgcca tggcaaccga cgaaaacggt gccgacgatc gcgccggcgg 420

cgagagcacc gtggatcatc tcaggagcca tatgaactac ggcgacatgg atttgtcagg 480

ggaagagcac gtgccaaagg taaattactc ctccccccga atcgcggctt ctccgctgca 540

aaatcccgtg cggttcttgt gtgcttgagt tcgttggctg ctcgattccc tcttaaaaga 600

ttgtgttcct tccttgcacg cttgcccccg accaggcgcg aaagccgtac acgatcacga 660

agcagcgcga gaagtggacg gacgaggagc acaggctgtt cttggaagcc ctgcagctgc 720

acggccgcgc atggcgccgt atacaaggta tgtctcatcg aacagatcga attttcatgg 780

cgatcgatcg caattgtccg tattcgcctg tgtgccgtaa cgtttgtgtt cgtctgtgtg 840

tggatgcaga gcacataggt accaagactg ccgtgcaaat ccgtagccac gcgcagaagt 900

tcttctctaa ggtcgtacag cctttcgttc tcatgtaaac aacaacaaaa aatctctgat 960

ctctgccatg aaaaaacaaa caaacgaaaa aaaaaaaacc attggttgtg ttacttgatt 1020

gcccaaagta agtcgccaat ttttcaattt tttttcatgg gagagaagaa cagatgatgt 1080

catgttttta ctgcgggttg tttcacagag tttcctgacg ctgtgattgc gcggtgctct 1140

gcaggtcgtc agagaatctt cggggagtaa caccggctcg ggcggcgcgt ccgccgcggc 1200

ggcggcggcg gccatccaga tccctccgcc gcggccgaag aggaagccgg cgcacccgta 1260

cccgcgcaag gtggacggcg cggccaagaa gcacgtcccg gcgctcaggc agctggagaa 1320

gccgccgttg tggatgcagt ccctgtccga gcaggaggag ggctcgccga cgtcggtgct 1380

gacggcggcg cagataggca ccgaggccct gggcggtggg ttctcgaata actcgagcgg 1440

cagcgggtcg ctggctccgt cagccgccgg tacggatgag catgtcgacg gtggcggctc 1500

gccggcgtcg tcggtggaca gagaggacgg gtgcctctca ccgagcatcc cgactgctga 1560

gttggctatg caggcgccaa atactaaggt atattctttc gtgggcagca catgttggac 1620

aactttgtaa ggcattagtt cttccaattt tgcaagaata caagatattc cccatcagaa 1680

aagcaatatt taggaccaat aatttcagtc gagaatttct gacatcactt tcagagaaac 1740

acaggttttt ttagcctttt aggtaggagt atctctgaat caaattgtga tatgcaatct 1800

gatcatctgc agttttacat ggtattaatt tgatctattg tcgccaatgg aaaaataacc 1860

ataccctttt agtgttattg gcacccttaa taaattctgt ttttgttttt cgaatgtgaa 1920

tttcagatgt caattgcaac cacggatgcc aaagaagcat cctcagaagc atcagtcttc 1980

aggctattcg gaaagagcgt agtggttaag gattcagacc agctgcacct gcttaatggc 2040

agtaacattg caacgagtgg ttcagttgag agagcaacca gaaacatact agtaccttct 2100

tttgctgctg ccccagaagg gagctcgtcg aatccatggc cgagcagcat gcaacagttt 2160

ctctacttcc ttcctcgatc ggatggtttc gccgcgcaac ctgtcatgcc atggttgagc 2220

tacaacggga gccttccatg cgcgctgttc tacccggcgg cggcggcggc tgcgaaccag 2280

cagtgccacc gtgattcaga gggcgtagag ttcagagtct cgcagaggga aggatcgctg 2340

acgggctcga acacggcctc cagcgtcgtg cttggatcgt cggcggcggt accggcggcg 2400

gcggcggcgg ctcagaattc ggacgtcgcg gagtcccgtg gccaagggaa cagcagggag 2460

gcggcggcct cgccacggct gaccaagtgc gagagctcgg cgtccgtcac cctgctgcag 2520

aggggcttca tgccgtacaa gaggtgcgcg gcggagagcg agctgctgcg atcggaggcc 2580

gccggaggag aggaggccgt cgccgacggt gagctgacaa ggctgtgctt gtgacaactg 2640

actcgtcgca cggacacgtc acgccacagt actactattc gtaggtgaca aataacaaat 2700

ctgacatgag attaaggcgg gaagaagagg catgtcctgc tgttaggatg ttgctcgaga 2760

ccactttagt tttccagaaa atggaagagc aattctggtt tttactcgtc gatatagtat 2820

tgtataatct gtaagataac aacttttgta cttttttttt tactttgcct gtaattttat 2880

ccccaactcg aatacgttca gagttgagtg gctgtcaatg ttgcctttta tcaacctgaa 2940

tctcggacag gggttgccat aggctaacta catgtaatct aggcttgtat ctctccacaa 3000

aatgcaatgg aaagacgagg aaatgttgga tgcaa 3035

Claims

1.稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。

3.稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟病抗性相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示。

4.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。

5.根据权利要求1-4任一项所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

下调或敲除所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在水稻中的表达。

6.根据权利要求1-4任一项所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟病病菌为稻瘟病菌（M.oryzae）GDYJ7。

7.针对权利要求1-4任一项中所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的编辑载体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：

所述的编辑载体用于敲除OsMYB1R基因。

8.一种含有权利要求7中所述的编辑载体的宿主菌在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述的应用为水稻抗稻瘟病育种或培育转基因水稻。

10.一种培育转基因水稻的方法，其特征在于：

用CRISPR载体构建针对权利要求1-4任一项中所述的稻瘟病抗性相关基因OsMYB1R的敲除靶点的敲除载体；再用所述敲除载体转化水稻组织；将转化的水稻组织培育成水稻植株。