CN109706132B

CN109706132B - 棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109706132B
Application number: CN201910144860.5A
Authority: CN
Inventors: 周京龙; 朱荷琴; 冯鸿杰; 冯自力; 魏锋; 师勇强; 赵丽红; 袁媛
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109706132A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用。棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明基因GhMAPK13的表达与棉花抗黄萎病呈正相关，可通过基因工程用于选育棉花抗病品种。

Description

棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物、重要的纺织原材料，对民生和国家发展具有重要意义，然而棉花黄萎病对我国棉花产业的健康发展造成了巨大危害。棉花黄萎病作为一种土传病害，尚无理想的防治措施，通过基因技术手段提高棉花自身抗病能力，成为重要的研究任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13。

本发明的再一目的在于提供编码上述棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13的基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13的应用。

本发明的再一目的在于提供上述编码基因的应用。

本发明的棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：

本发明的蛋白GhMAPK13属于丝裂原活蛋白激酶。

本发明提供的棉花抗黄萎病相关基因GhMAPK13，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

ATGGAGAATGAAGGAACGGCGATTGATCTCAGAGGGACCCCAACCTACGATGGCAGATATGTACGTTACAACATCTTAGGTAACATCTTCGAAGTCTCTTCCAAATATGTTCCTCCTATTCAGCCTGTTGGTCGTGGCGCTTACGGCATCGTCTGCTGTGCCACAAATTCCGAGACAAAGGAAGAGGTTGCAATAAAAAAGATTGCGAATGCATTCGACAACAGGATTGATGCTAAAAGAACACTCCGTGAGATCAAGCTCCTCTGTCACATGGATCATGATAATATTATCAAAATCAAGGACATAATAATCCCGCCAGAGAAGGAAAAGTTCAATGATGTTTACATTGCATATGAGCTAATGGACACTGATCTGCATCAGATAATACGGTCTAGCCAGGCTCTCACTGATGATCACTGTCAGTATTTCTTATATCAACTGTTGCGGGGTCTTAAGTACATACACTCGGCAAATGTTCTGCATCGCGACCTAAAACCTAGCAACCTGCTTCTCAATGCAAACTGTGATCTCAAAATTTGTGACTTTGGTCTTGCAAGAACCACCTCAGAGACAGACTTCATGACCGAGTATGTTGTAACCAGATGGTATCGAGCCCCTGAATTGCTTCTCAATTGTTCAGAGTATACTGCTGCTATCGATATCTGGTCAGTTGGTTGTATTCTAATGGAGATAATTAGAAGGGAGCCATTTTTCTCTGGTAAAGATTATGTTCAGCAGTTGGGGCTTATTACTCAGCTACTAGGGTCGCCAGAAGATTCGGATCTCGGATTCCTTAGGAGCGACAATGCTCGAAAGTATGTTAAGCAGCTTCCTCATTTCCCTAAGCAACCTTTTGCTGAAAAGTTTCCAGACGTATCTCCTGTGGCAATTGACCTTGCAGAAAAAATGCTGGTTTTTGATCCAAGCAAGCGTATCACTGAAACATCTGTTTTGTATGATGCATGTAAAGTTGAGGAAGCGCTGAATCACCCATATTTGTCAAGTCTTCATGAAATCAATGAAGAGCCCACTTGTCCATCTCCTTTCGTCTTCGATTTTGAGCAGATGACCTTGAACGAAGAAGACATAAAAGAGCTAATATGGAGGGAGTCTTTGAATTTCAATCAAGATAAGATGCCGGAATGA

本发明提供了包含上述基因的重组表达载体和重组菌株。

本发明还提供了棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码蛋白的应用。

棉花接种病原菌后，本发明蛋白GhMAPK13在棉花体内表达上调，表明病原菌胁迫激活了GhMAPK13的表达；激素(茉莉酸、乙烯、水杨酸和过氧化氢)处理棉花后，GhMAPK13的表达发生了改变，表明GhMAPK13受激素的调控。

通过蛋白质修饰组检测，蛋白GhMAPK13的第195位的苏氨酸(Thr，T)和第197位的酪氨酸(Tyr，Y)在接种病原菌后发生了磷酸化修饰。

本发明构建了基因GhMAPK13的沉默载体，利用病毒介导的基因沉默技术，抑制了GhMAPK13在棉花中的表达。对基因沉默植株接种棉花黄萎病病原菌Vd080孢子悬浮液后，沉默植物表现更感病，通过机理研究发现，沉默植株中木质部和胼胝质的合成下降，ROS减少，部分防御基因的下调。因此，本发明基因GhMAPK13与棉花抗黄萎病呈正相关，基因GhMAPK13可应用于棉花抗病育种中。

附图说明

图1显示病原菌胁迫下基因GhMAPK13在抗病品种、感病品种中的表达情况；

图2显示激素处理后GhMAPK13在抗病品种中的表达情况；

图3显示激素处理后GhMAPK13在感病品种中的表达情况；

图4显示基因沉默后的棉花叶片的白化现象及发病情况；

图5显示基因沉默后植株木质部的积累情况；

图6显示基因沉默后植株叶片胼胝质的积累情况；

图7显示基因沉默后植株叶片活性氧爆发情况；

图8显示病菌处理后植株中相关防御基因的相对表达量的变化情况。

具体实施方式

实施例1获取棉花基因GhMAPK13

以抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号为植物材料，接种棉花黄萎病病原菌Vd080后，提取棉花全蛋白，以不接种病原菌的棉花为空白对照。利用胰蛋白酶对提取的全蛋白质进行酶解，利用金属氧化物TiO₂对磷酸基团的亲和能力实现对含有丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)的磷酸化肽段进行富集，进行液质连用/质谱(LC-MS/MS)蛋白质定量方法，实现大规模蛋白质磷酸化修饰的定量分析，根据定量分析结果进行生物信息学分析。

结果显示在抗病和感病品种中同时发生磷酸化修饰的蛋白共有243个，筛选得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白GhMAPK13。

实施例2病原菌和激素处理后棉花中GhMAPK13的表达

在蛭石沙土纸钵中种植棉花抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号，伤根后接种Vd080孢子悬浮液，不同时间段提取根部RNA。

用0.5mM的过氧化氢(H₂O₂)、0.1mM的水杨酸(SA)，0.15mM的茉莉酸甲酯(JA)和1mM的乙烯(ET)喷施到叶面滴水为止，不同时间段提取根部RNA。

根据GhMAPK13的基因序列和CDS序列设计其荧光定量的引物为：GhMAPK-F:ATGAAGGAACGGCGATTGAT，GhMAPK-R:CCAACAGGCTGAATAGGAGGA。检测在病原菌和激素处理后，GhMAPK13的表达情况。

如图1所示，在抗病品种中，接种病原菌后GhMAPK13的表达量在所有时间段均上调表达，然而除第24h外，其他时间段处理与对照的差异并不显著。在感病品种中，接种病原菌初期，GhMAPK13的表达受到极显著抑制，在抗病的关键时间段，其表达极显著高于对照，但在72h时表达又受到抑制。因此，GhMAPK13在植物抗病中具有作用，尤其在感病品种中，由于植物与病原物的互作，其表达呈抑制-增长-抑制的趋势。

如图2、3所示，在激素处理后，抗病品种和感病品种中的GhMAPK13均对ET、H₂O₂和JA敏感，表明GhMAPK13的表达受这三种激素的调控。

实施例3利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)研究GhMAPK13的功能

1.棉花中GhMAPK13的沉默

根据VIGS引物设计原则设计GhMAPK13沉默载体的引物：

MAPK-VIGS-F:GGAATTCTTAAGTACATACACTCGGCAA，

MAPK-VIGS-R:GGGGTACCGAATCTTCTGGCGACCCT。

以抗病品种中植棉2号的cDNA为模板扩增沉默片段并转化pYL-156载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序验证正确后，提取pYL-156-GhMAPK13质粒，并转化农杆菌GV3101感受态，菌落PCR验证正确后，扩大培养，以pYL-156空载为对照，以pYL-156-PDS为正对照(PDS基因被沉默后，叶片表现出白化现象)，与辅助质粒pYL-192为混合静置后，用无针头注射器注射中植棉2号棉花叶片。注射处理后暗培养24h，置于正常光照下22℃培养。待正对照出现白化表型时，利用荧光定量PCR检测沉默植株中GhMAPK13的表达量，选取沉默效果较好的植株进行进一步试验。

2.沉默植株的抗病性研究

选取沉默效果较好的植株，待一片真叶初现时，接种10mL大丽轮枝菌孢子液(浓度为2×10⁷CFU/mL)，置于25℃温室中正常光照生长。接菌后不同时间段取样提取沉默植株RNA用于表1中检测防御相关基因的表达。

在接菌3d时，检测棉花茎秆木质部和叶片胼胝质的积累，检测棉花叶片活性氧的爆发。15d时检测叶片细胞坏死情况。20d时，调查植株发病情况。

表1棉花防御相关基因的RT-qPCR引物

如图4所示，统计病情后计算得沉默植株的病情指数为75.86±0.75，病株率为100％，而对照的病情指数为21.92±2.68，病株率为83.74±2.56％，沉默植株与对照之间的病情指数和病株率均存在极显著差异。

如图5所示，将棉花幼苗茎秆用间苯三酚染色，浓硫酸孵育后，在正视显微镜下观察到沉默植株的木质部的积累显著低于非沉默植株。如图6所示，利用苯胺蓝染色棉花叶片，紫外激发光下可见沉默植株的胼胝质的积累量低于对照。如图7所示，活性氧爆发的研究同样显示在沉默植物的叶片中褐色沉淀更少，说明活性氧爆发更弱。利用苯胺蓝染色棉花叶片，在沉默植株中可以观察到的更多的细胞坏死。

如图8所示，接种病菌后的不同时间段沉默植株中的防御酶基因或防御酶代谢基因，如苯丙氨酸解氨酶(GhPAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(GhC4H1)、过氧化物酶(GhPOD)和多酚氧化酶(GhPPO)在沉默植株中的表达量，在接种病原菌初期具有不同程度的降低。棉花中过敏反应的标识基因GhHSR203J和GhHIN1，GhHSR203J在整个检测时期的表达水平均低于对照，GhHIN1除第9和24h高于对照外，其他时间段显著低于对照。GhPR3是乙烯(ET)信号通路的标识基因，在检测初期，沉默植株中的表达量高于对照，表明ET在GhMAPK13抗病中起负调控作用。GhNOA1是一氧化氮通路基因，在沉默植株中，除第9h外，其他时间段的表达量均显著低于对照，表明GhMAPK13与一氧化氮通路相关。

因此，本发明揭示了GhMAPK13在棉花抗黄萎病中具有重要的正调控作用，其可应用于棉花抗黄萎病育种工作中。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 381

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 1

Met Glu Asn Glu Gly Thr Ala Ile Asp Leu Arg Gly Thr Pro Thr Tyr

1 5 10 15

Asp Gly Arg Tyr Val Arg Tyr Asn Ile Leu Gly Asn Ile Phe Glu Val

20 25 30

Ser Ser Lys Tyr Val Pro Pro Ile Gln Pro Val Gly Arg Gly Ala Tyr

35 40 45

Gly Ile Val Cys Cys Ala Thr Asn Ser Glu Thr Lys Glu Glu Val Ala

50 55 60

Ile Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp Asn Arg Ile Asp Ala Lys Arg

65 70 75 80

Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Cys His Met Asp His Asp Asn Ile

85 90 95

Ile Lys Ile Lys Asp Ile Ile Ile Pro Pro Glu Lys Glu Lys Phe Asn

100 105 110

Asp Val Tyr Ile Ala Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile

115 120 125

Ile Arg Ser Ser Gln Ala Leu Thr Asp Asp His Cys Gln Tyr Phe Leu

130 135 140

Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu

145 150 155 160

His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp

165 170 175

Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Thr Ser Glu Thr Asp

180 185 190

Phe Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu

195 200 205

Leu Leu Asn Cys Ser Glu Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Ile Trp Ser Val

210 215 220

Gly Cys Ile Leu Met Glu Ile Ile Arg Arg Glu Pro Phe Phe Ser Gly

225 230 235 240

Lys Asp Tyr Val Gln Gln Leu Gly Leu Ile Thr Gln Leu Leu Gly Ser

245 250 255

Pro Glu Asp Ser Asp Leu Gly Phe Leu Arg Ser Asp Asn Ala Arg Lys

260 265 270

Tyr Val Lys Gln Leu Pro His Phe Pro Lys Gln Pro Phe Ala Glu Lys

275 280 285

Phe Pro Asp Val Ser Pro Val Ala Ile Asp Leu Ala Glu Lys Met Leu

290 295 300

Val Phe Asp Pro Ser Lys Arg Ile Thr Glu Thr Ser Val Leu Tyr Asp

305 310 315 320

Ala Cys Lys Val Glu Glu Ala Leu Asn His Pro Tyr Leu Ser Ser Leu

325 330 335

His Glu Ile Asn Glu Glu Pro Thr Cys Pro Ser Pro Phe Val Phe Asp

340 345 350

Phe Glu Gln Met Thr Leu Asn Glu Glu Asp Ile Lys Glu Leu Ile Trp

355 360 365

Arg Glu Ser Leu Asn Phe Asn Gln Asp Lys Met Pro Glu

370 375 380

<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 2

atggagaatg aaggaacggc gattgatctc agagggaccc caacctacga tggcagatat 60

gtacgttaca acatcttagg taacatcttc gaagtctctt ccaaatatgt tcctcctatt 120

cagcctgttg gtcgtggcgc ttacggcatc gtctgctgtg ccacaaattc cgagacaaag 180

gaagaggttg caataaaaaa gattgcgaat gcattcgaca acaggattga tgctaaaaga 240

acactccgtg agatcaagct cctctgtcac atggatcatg ataatattat caaaatcaag 300

gacataataa tcccgccaga gaaggaaaag ttcaatgatg tttacattgc atatgagcta 360

atggacactg atctgcatca gataatacgg tctagccagg ctctcactga tgatcactgt 420

cagtatttct tatatcaact gttgcggggt cttaagtaca tacactcggc aaatgttctg 480

catcgcgacc taaaacctag caacctgctt ctcaatgcaa actgtgatct caaaatttgt 540

gactttggtc ttgcaagaac cacctcagag acagacttca tgaccgagta tgttgtaacc 600

agatggtatc gagcccctga attgcttctc aattgttcag agtatactgc tgctatcgat 660

atctggtcag ttggttgtat tctaatggag ataattagaa gggagccatt tttctctggt 720

aaagattatg ttcagcagtt ggggcttatt actcagctac tagggtcgcc agaagattcg 780

gatctcggat tccttaggag cgacaatgct cgaaagtatg ttaagcagct tcctcatttc 840

cctaagcaac cttttgctga aaagtttcca gacgtatctc ctgtggcaat tgaccttgca 900

gaaaaaatgc tggtttttga tccaagcaag cgtatcactg aaacatctgt tttgtatgat 960

gcatgtaaag ttgaggaagc gctgaatcac ccatatttgt caagtcttca tgaaatcaat 1020

gaagagccca cttgtccatc tcctttcgtc ttcgattttg agcagatgac cttgaacgaa 1080

gaagacataa aagagctaat atggagggag tctttgaatt tcaatcaaga taagatgccg 1140

gaatga 1146

Claims

1.提高棉花黄萎病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括向棉花中导入棉花抗黄萎病相关基因GhMAPK13的步骤，所述棉花抗黄萎病相关基因GhMAPK13编码氨基酸序列如SEQID No.1所示的蛋白。

2.根据权利要求1所述的提高棉花黄萎病抗性的方法，其特征在于，所述棉花抗黄萎病相关基因GhMAPK13的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的提高棉花黄萎病抗性的方法，其特征在于，构建保护所述棉花抗黄萎病相关基因GhMAPK13的表达载体，然后将其转入棉花中。