CN108103042A - 与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因及其应用 - Google Patents

与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物抗病领域，具体涉及与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。试验表明GhPR5K的沉默降低了棉花对黄萎病的抗性，GhPR5K与棉花的抗黄萎病性成正相关，可以作为棉花抗病育种的靶基因。

Description

与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因及其 应用
技术领域
本发明涉及植物抗病领域，具体涉及与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因及其应用。
背景技术
棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的棉花黄萎病，是影响世界各大产棉区棉花优质高产的首要病害。棉花抗黄萎病机制是抗病育种和病害防治的关键及核心问题，通过基因工程手段提高棉花品种的抗病性是最具发展前景的抗病育种新途径。
在植物抵御病原菌侵染的过程中，植物体内发生一系列的信号传递，并激发植物的防御体系，使植物产生抗病性反应。植物类受体蛋白激酶(Receptor-Like Kinases,RLK)可识别来自病原菌的相关分子模式(Pathogen-Associated Molecular Pattern,PAMP)激活免疫信号通路，从而抵御病原菌的侵害，维持正常的生长发育。植物类受体蛋白激酶的胞内激酶区通过磷酸化或去磷酸化，开启或关闭下游靶蛋白，将胞外信号转换为胞质信号，进而诱导植物表现出相应的防卫反应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了来源于棉花的、与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因GhPR5K，通过鉴定该基因为利用基因工程手段改良棉花的黄萎病抗性提供了靶标。
根据本发明的与棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶GhPR5K，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
根据本发明的的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶基因GhPR5K，其来自棉花，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明同时提供了包含上述基因的重组表达载体。
本发明还提供了包含上述基因重组细胞。
本发明还提供了上述与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因在提高棉花黄萎病抗性方面的应用。
本发明利用VIGS技术沉默棉花中的GhPR5K并接种棉花黄萎病菌Vd080，结果表明TRV:GhPR5K(GhPR5K沉默植株)比TRV:00植株(对照)的茎部定殖有更多的棉花黄萎病菌，木质化程度程度减弱；叶片的活性氧爆发更显著，PR基因表达量均显著下降；TRV:GhPR5K植株黄萎病的严重度远高于TRV:00植株。表明GhPR5K的沉默降低了棉花对黄萎病的抗性，GhPR5K与棉花的抗黄萎病性成正相关，可以作为棉花抗病育种的靶基因。
附图说明
图1：棉花接种棉花黄萎病菌Vd080后，中植棉2号不同组织中GhPR5K的表达情况；
图2：利用VIGS沉默抗病品种中植棉2号中的GhPR5K。A:正对照，将棉花中的八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)沉默后出现明显的白化现象(左PDS沉默植株，右空白对照)；B：GhPR5K沉默植株与对照植株中GhPR5K的表达量；C：GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后的发病情况；D：GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌Vd080后20d和25d的病情指数；
图3：GhPR5K沉默植株与对照植株中棉花黄萎病菌的定殖量及维管束变色情况。A:GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后第25d茎段中黄萎病菌定殖情况；B:GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后第25d根部维管束变色情况；C:GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后第25d茎部维管束变色情况。
图4：GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后第25d对叶片中坏死细胞染色；
图5：GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌前后茎部木质化情况；
图6：GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后24h活性氧染色；
图7：GhPR5K沉默植株与对照植株接种棉花黄萎病菌后PR基因的表达量。
具体实施方式
实施例1：GhPR5K的分离和克隆
利用抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号为材料，根部接种棉花黄萎病菌Vd080后(对照未接种病原菌)，进行磷酸化蛋白质组学分析，检测到差异磷酸化蛋白质共863个蛋白，其中抗病品种中植棉2号中检测到646个磷酸化蛋白，感病品种冀棉11号中检测到460个磷酸化蛋白(抗、感病品种中共有的蛋白为243个)。
以中植棉2号根部cDNA为模板，设计引物，克隆GhPR5K，并连接T载体，测序，DNA序列见SEQ ID NO:2。
实施例2：GhPR5K的功能分析
2.1棉花黄萎病菌侵染后GhPR5K在棉花不同组织中的表达分析
利用棉花黄萎病菌Vd080菌液(孢子浓度为1×107)，通过蘸根法侵染两周龄中植棉2号棉苗的根部，并在侵染后的1、3、6、12、24、48h对其根、茎、叶中GhPR5K的表达量进行检测。
结果显示该基因均显著上调。在根中，从接菌后的1h到48h，接种处理中GhPR5K的表达量均高于对照处理，从1.05倍到3.68倍，最高的是36小时，达到3.68倍；在茎中，从接菌后的1h到48h，接种处理中GhPR5K的表达量均高于对照处理，从1.33倍到2.07倍，最高的是1小时，达到2.07倍；在叶中，从接菌后的1h到48h，接种处理中GhPR5K的表达量均高于对照处理，从1.09倍到4.86倍，最高的是48小时，达到4.86倍。初步证明棉花中的GhPR5K与棉花的抗病性相关(图1)。
2.2利用VIGS(病毒诱导基因沉默)沉默抗病品种中植棉2号中的GhPR5K
本发明使用的载体是pYL-156，使用的是Xbal和SacI双酶切的方法构建VIGS载体。其中构建载体的引物为：308V-F/308V-R,5'-TCTAGAATAATCTTAGAAATGGCTTGT-3'/5'-GAGCTCTTCACGCTCACGCAGGT-3'。
载体构建方法如下：
利用陆地棉中植棉2号为材料，提取RNA，反转录出cDNA，通过PCR，扩增出基因的编码区的序列。
将经过扩增的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，用2％的琼脂糖胶，电压140V，15min，在凝胶成像系统下先观察目的条带是否正确，正确的话继续在紫外灯的照射下切下目的条带所在的胶块，并使用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收。
将胶回收产物与pYL-156载体连接后，转化E.coli DH5α感受态细胞，并涂板，做菌落PCR，挑取阳性菌斑，摇菌后送金唯智公司测序，使用测序正确的菌斑作为模板进行农杆菌转化。
利用蛭石沙土营养钵法培育中植棉2号棉苗，每钵3-4株，每处理3次重复，除取样外，确保病害调查时每重复最少10株棉苗；置于28℃，光照/黑暗为16/8h下培养，培养8d；待棉花子叶完全展开，但真叶还未长出时，准备VIGS注射接种菌液。接种阳性菌落pYL-156-GhR5K，空载体pYL-156，辅助质粒pYL-192，棉花正对照PDS基因(沉默PDS基因后，叶片及茎秆会出现白化症状)。在子叶背面的伤口位置，注射菌液，使含有菌体的悬浮液完全注射进入叶片，注射面积要达到98％以上，另一片子叶相同。pYL-156-GhPRK，空载体pYL-156，正对照基因PDS均采用同样的方法。注射完毕后，用黑色塑料袋套住棉花，避光过夜培养24h，温度，第二天转到正常光照条件下22℃继续培养。
VIGS注射两周后正对照出现明显的白化现象(图2中的A左)，证明GhPR5K被成功沉默。
2.3沉默植株及对照植株中GhPR5K的表达量
VIGS注射两周后正对照出现明显的白化现象时，对TRV:00和TRV:GhPR5K植株叶片进行取样，分别随机采取5片真叶，清水冲洗后用滤纸擦干，液氮速冻后于-80℃保存。荧光定量检测GhPR5K的表达量情况，将TRV:00和TRV:GhPR5K植株叶片研磨提取RNA，反转录cDNA后进行荧光定量测定，将测得目的基因的相对表达量用2–△CT法来计算。其中2–△CT法的计算方法简介如下：假设检测在某因子干预下Y基因的表达，得到一组数据：干预前：目的基因Ct值为A，内参基因的Ct值为B；干预后：目的基因的Ct值为C，内参基因的Ct值为D；则计算Y基因在待测样品中与在校准样品中表达量的比值的公式为：2–△CT＝2–[(C–D)–(A–B)]。
结果显示沉默植株中，TRV:GhPR5K植株基因相对表达量为，TRV:00植株基因相对表达量为3.8×10-3，与TRV:GhPR5K植株的3.4×10-4相比，是其基因相对表达量的11.28倍，达到差异显著水平。因此，在VIGS注射后，TRV:GhPR5K植株中的GhPR5K被成功沉默(图2中的C)。
2.3GhPR5K沉默后棉花对黄萎病的抗性
对VIGS注射3周后的棉苗蘸根接种棉花黄萎病菌Vd080孢子悬浮液(浓度为1×107孢子/ml，每钵接种10ml)，接菌后20d和25d进行病情分级调查(0＝无症状；1＝25％叶片褪绿；2＝50％叶片褪绿；3＝75％叶片褪绿；4＝100％叶片褪绿)，计算病株率和病情株数。病株率＝(病株数/总株数)×100％，病情指数(DI)＝(∑发病等级×发病株数)/(总株数×4)。
试验结果表明：接菌后7d左右棉苗开始发病，15d左右普遍发病，与对照相比，TRV:GhPR5K植株表现发病严重，叶片大量脱落，发病严重的植株出现枯死现象。接种后20d时，TRV:00和TRV:GhPR5K的病株率和病病情指数分别为19.45％和76.39％、10.33和44.93；25d时，分别为54.17％和89.53％、25.17和52.53，TRV:GhPR5K植株的病情指数均极显著高于对照植株，表明GhPR5K沉默后，棉株对棉花黄萎病的抗性显著下降(图2中的B和D)。
取接菌后25d的棉苗根部和茎部分别进行纵剖和横剖，与TRV:00相比，TRV:GhPR5K植株维管束褐变程度显著加深(图3中的B和C)。
接种棉花黄萎病菌后25d，随机取TRV:00和TRV:GhPR5K植将各5株，将茎段去除表皮，在超净工作台上进行表面消毒后切小段，放置在PDA平板上，25℃，培养7d，观察发现与TRV:00相比，TRV:GhPR5K植株的茎部定殖有更多的棉花黄萎病菌(图3中的A)。
2.4与黄萎病抗性相关指标的观察
2.4.1叶片中死亡细胞台盼蓝染色
接种棉花黄萎病菌后25d，分别随机取TRV:00和TRV:GhPR5K各5株取其第1片真叶，将叶片浸泡在台盼蓝染色液中(10ml乳酸，10ml甘油，10g苯酚，10mg台盼蓝，10ml蒸馏水)，沸水浴染色2min，自然冷却后台盼蓝染色液中室温过夜，后于水合氯醛(2.5g/ml)脱色3d，每天换一次脱色液。体视显微镜观察并拍照。
结果表明，与TRV:00相比，TRV:GhPR5K植株叶片染色较深，表明其死细胞较多(图4)。
2.4.2棉苗茎部木质化检测(间苯三酚染色法)
在接种棉花黄萎病菌前及接种后48h分别随机取棉苗5株，采用间苯三酚染色法观察不同处理木质部变色情况。
结果表明，接菌前TRV:00和TRV:GhPR5K植株木质部增厚情况无明显差别，接菌后TRV:00木质化程度明显增厚，而沉默植株的木质部只有略微增厚，其增厚程度远低于TRV:00植株(图5)。
2.4.3叶片活性氧爆发检测
活性氧DAB染色法：①用蒸馏水冲洗叶片，并用无菌滤纸吸干水分；②将处理的叶片置于2ml或5ml离心管中，取适量3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色(1mg/ml,pH＝7.5)，室温避光8h；③去除各管中染液，加入95％乙醇去除叶绿素，沸水浴2min，用移液枪吸除管内液体，再加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为止，再次吸除管内液体；④将叶片浸泡在70％甘油中，用小镊子小心赶走细胞间气泡，小心转移至载玻片上，显微镜观察并拍照。
接种棉花黄萎病菌后24h，随机取TRV:00和TRV:GhPR5K植株5株，取其第一片真叶进行DAB染色，结果表明，与TRV:00植株相比，TRV:GhPR5K植株叶片活性氧爆发减少，活性氧为植物抵御病原菌侵害过程中的重要信号分子，同时具有杀死病原菌的功能，该结果表明TRV:GhPR5K植株对棉花黄萎病的防御反应减弱(图6)。
2.4.GhPR5K调控抗病相关基因(PR)的表达
将注射VIGS三周后的棉苗蘸根接种棉花黄萎病菌分生孢子悬浮液，分别于0、6、12、24、48、72h，取TRV:00和TRV:GhPR5K棉苗根部，用荧光定量的方法检测其中PR基因表达量，将TRV:00和TRV:GhPR5K植株叶片研磨提取RNA，反转录cDNA后进行荧光定量测定，将测得目的基因的相对表达量用2–△CT法来计算。
表1防御相关基因的特异引物
结果显示PR基因在TRV:GhPR5K植株均显著下降。整体趋势程先升高后下降的趋势(图7)。在4CL中的下降区间为16.50％-70.95％，其中在12h时下降程度最高为70.95％；在β-CHI中的下降区间为28.89％-43.57％，其中在48h时下降程度最高为43.57％；在PAL中的下降区间为39.71％-55.33％，其中在6h时下降程度最高为55.33％；在POD中的下降区间为11.12％-43.47％，其中在6h时下降程度最高为43.47％；在Cadinene synthase中的下降区间为23.32％-78.09％，其中在48h时下降程度最高为78.09％；在C4H1中的下降区间为3.38％-71.89％，其中在24h时下降程度最高为71.89％。这表明在GhPR5K沉默植株中PR基因的表达量均有下降，因此，GhPR5K在棉花对黄萎病的防御反应中扮演重要角色。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 与抗黄萎病相关的类受体蛋白激酶GhPR5K及其编码基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 628
<212> PRT
<213> 棉花(cotton)
<400> 1
Met Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Val Phe Leu Leu Leu Phe Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asn Glu Thr Glu Ser Arg Lys Asp Pro Pro Pro Ile Cys Ser Ser
20 25 30
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Ile Ser Tyr Asp Asp His Thr Ile Gln Leu Val Asp Val Asn Phe Phe
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Asp Asp Gly Lys Cys Ser Leu Pro Asn Arg Ser Leu Ser Thr Asp Glu
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Ile Leu Met Glu Asp Arg Tyr Pro Gly Leu Val Asn Phe Thr Tyr Ser
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<211> 1887
<212> DNA
<213> 棉花(cotton)
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cagcagccat taacaccaga aaggtataat tacacagata tactttcaat gtcaaacaat 960
ttcaaagaca aaatagggga aggctgtttt ggtacagttt acaaaggaca acttcatgat 1020
gattactccg ttgttgttaa aaagcttgaa agcttcaaag taagtgaaga acatttcatc 1080
aatggtgttt caagaatcag tgggattcaa catccaaatt tggtaccgat actagggttt 1140
tgttctgagg gatcgaaaca tgttcttgtt aaccaataca tgcctaatgg atctctcgac 1200
aagtttgttg gaaattcgga ttcgtttagt tgggagaaag tctgggaaat tgtgctcgaa 1260
actgggcaag ggatcaagtt tttacatgga cgatctggag gtggtattat tcatttagat 1320
attaagcctc ggaatatact gttggatggg aatttcagac caaggatttc agatttcggg 1380
atagcaaaat tgtgccggaa gaagcatgat ctcgtatcat tatatggaag aagtgaaaca 1440
atgggatatg tggcacctga attgatggtt tcaagggatt ttgaggcagt ttcatgcaaa 1500
tccgatgtct atagtttcgg aatgataatc ttagaaatgg cttgtggaag aaggcatgtc 1560
gatgttgatg caatcaattc gagcaaagtg cattttccta cttgggtcta tgaactaaat 1620
gagaggggag atttagagtt tgagaacctg acgaaaagtg acaccatgat agccagaaag 1680
ctgttcgtaa tcgggttatg gtgcactcaa actcggccat cagatcgtcc ctccatgacc 1740
agagtcctgg aaatgttaga aacggacctt gatgatcttg aaatgccccc gaagccagtc 1800
ttcatttcgg ctcaacacct gcgtgagcgt gaattggatt ctccaaaaga gatgctatta 1860
gctgagacaa tggagagaag ctcatag 1887

Claims (7)

1.棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶GhPR5K，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶GhPR5K。
3.根据权利要求2所述的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.包含权利要求2所述的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶基因的重组细胞。
6.权利要求1所述的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶GhPR5K在提高植物棉花黄萎病抗性方面的应用。
7.权利要求2所述的棉花黄萎病的抗病相关类受体蛋白激酶基因在提高植物棉花黄萎病抗性方面的应用。
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CN109705201A (zh) * 2018-12-10 2019-05-03 中国农业科学院棉花研究所 棉花抗黄萎病相关基因GhABC及其编码蛋白和应用
CN109706132A (zh) * 2018-12-10 2019-05-03 中国农业科学院棉花研究所 棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用

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CN109705201B (zh) * 2018-12-10 2022-04-08 中国农业科学院棉花研究所 棉花抗黄萎病相关基因GhABC及其编码蛋白和应用
CN109706132B (zh) * 2018-12-10 2022-07-05 中国农业科学院棉花研究所 棉花抗黄萎病相关蛋白GhMAPK13及其编码基因和应用

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