CN109295074A

CN109295074A - 一种棉花抗枯萎病基因及其应用

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Publication number: CN109295074A
Application number: CN201811411360.5A
Authority: CN
Inventors: 朱龙付; 张献龙; 柳仕明
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-11-24
Filing date: 2018-11-24
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-11-24
Also published as: CN109295074B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花抗枯萎病基因及其应用。从棉花群体抗枯萎病鉴定和全基因组关联分析将陆地棉抗枯萎病基因定位在17号染色体1.7‑2.1Mb的400kb的基因组区间内。利用病毒介导的基因沉默技术对这一基因组区间所有基因的表达进行抑制并接种鉴定后筛选得到棉花抗枯萎病主效基因GhFov1。该基因编码一种谷氨酸受体蛋白激酶，抗病的陆地棉中被沉默后极显著地降低了对枯萎病的抗性。转化烟草发现GhFov1蛋白可识别棉花枯萎病菌并激活免疫反应产生过敏性坏死。开发了一对能检测陆地棉中GhFov1基因型的引物，利用该引物和优化的PCR反应体系可对棉花种质资源和品种的枯萎病抗性进行评价。

Description

一种棉花抗枯萎病基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及棉花枯萎病抗病基因的鉴定和一种棉花抗枯萎病分子标记的开发与应用。

背景技术

枯萎病是棉花生产中一种世界性的土传病害，发病严重时可导致处于苗期和蕾铃期棉株枯死从而造成棉花绝产，发病较轻时也会导致棉株发育迟缓，结铃少，吐絮不畅从而导致纤维品质和产量下降(万英；2005)。枯萎病的发生给棉花的生产带来了不可估量的损失，严重影响了棉花生产的稳定性和可持续性发展。在我国最大的棉花产区新疆，棉花枯萎病仍时有发生。防治棉花枯萎病最有效的方法是选育和推广抗病品种。从上世纪50年代开始，育种工作者开展了陆地棉抗枯萎病的育种工作，筛选到抗枯萎病的种质资源并获得了广泛应用(吕学莲；2008)。虽然从遗传学上证明陆地棉抗枯萎病基因为主效抗病基因，但目前还未有陆地棉抗枯萎病基因被鉴定和克隆的报道，陆地棉抗枯萎病的分子机制也不清楚。近年有少数关于棉花抗枯萎病基因的定位研究。2009年Wang等开展了棉花抗枯萎病菌7号生理小种的QTL定位。该研究以高抗枯萎病的陆地棉栽培种‘中棉所35’和感病陆地棉栽培种‘军棉一号’为亲本，构建了F2:3分离群体；运用SSR标记构建连锁图谱，用复合区间作图法对F2:3家系的病情指数进行基因组QTL扫描，一共检测到了4个与棉花枯萎病相关的QTL位点，分别位于A07、D01、D03、D09染色体上(Wang et al；2009)。因此目前人们依然采用传统的枯萎病病圃筛选以评价棉花对枯萎病的抗性。克隆鉴定棉花抗枯萎病基因有助于我们了解棉花抗枯萎病的分子机制，同时为棉花抗枯萎病分子育种提供可靠分子标记。

谷氨酸是动物中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，可与其特定的受体谷氨酸受体蛋白特异性的结合(Orrego and Villanueva 1993)。谷氨酸受体蛋白根据其作用的不同可划分为两种不同的类型：一种是借由G蛋白偶联受体激活第二信使的代谢型受体mGLR；一种是调控离子通道促进离子内流的离子型受体iGLR(Ozawa et al 1998；Rodríguez and López 1997)。1998年Lam等首次在拟南芥中鉴定到了20个谷氨酸受体蛋白基因，并与动物中离子型受体较为同源。同动物中离子型谷氨酸受体一样，拟南芥中的谷氨酸受体也含有6个功能结构域，包括4个跨膜结构域(M1-M4)和2个配体结合域(S1和S2)(Lam etal；1998)。进化分析表明，植物GLRs与动物的iGLRs有着共同的起源，由原始的谷氨酸受体蛋白进化形成，而原始的谷氨酸受体蛋白则由细菌周质结合蛋白进化形成(Chiu et al；1999)。此外原始的谷氨酸受体蛋白进化形成了原始G蛋白偶联受体亚家族C，其后原始G蛋白偶联受体亚家族C进一步进化为动物的代谢型谷氨酸受体蛋白和γ氨基丁酸受体蛋白(Turano et al；2001)。γ氨基丁酸受体蛋白可特异性地结合γ氨基丁酸，γ氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸产生。de Sain等通过Pull-down实验证实番茄枯萎病的无毒蛋白SIX4可与谷氨酸脱羧酶互作(de Sain and Rep 2015)，这也反映了谷氨酸受体蛋白可能参与了番茄对枯萎病抗性的调节过程。

基于动物中离子型谷氨酸受体蛋白的作用机理，研究者推测植物中谷氨酸受体蛋白存在与动物中类似的机制，即存在激活与脱敏的过程。激活状态的GLR会识别并且结合配体，从而激活Ca²⁺等阳离子实现跨膜转运流向细胞内。此后GLR会处于脱敏状态，不再产生Ca²⁺内流以防止Ca²⁺持续性的转运。此时GLR依然保持着与配体结合的状态，使命完成后配体会被释放出来或者被转运到细胞内降解(Meyerhoff et al 2005；Stephens et al2008)。不过与动物中不同的是，在动物中谷氨酸受体仅特异性的结合谷氨酸，其配体具有很强的特异性；而植物的谷氨酸受体则具有更加广泛的配体。目前已发现20种蛋白质氨基酸中的12种氨基酸和谷胱甘肽均可作为谷氨酸受体的配体(Qi et al；2006；Stephens etal；2008；Tapken et al；2013；Vincill et al；2012)。

随着植物中谷氨酸受体蛋白的发现，越来越多的研究证实谷氨酸受体蛋白在植物防御反应中扮演着重要的角色。Kang等发现当将小萝卜中的RsGLR外源导入到拟南芥中，可以激活与防御相关的基因的表达并且增强了对死体营养性病原菌灰霉的抗性(Kang etal；2006)。通过对拟南芥glr突变体的研究，发现atglr3.3对丁香假单孢杆菌的感病性增强，受丁香假单孢杆菌诱导表达的与防御相关标记基因的表达极大削弱，且在突变体中当外源添加GSH时钙离子向胞内的流入受到抑制(Li et al；2013)。此外，在突变体中寡聚半乳糖醛酸所诱导的活性氧和一氧化氮的积累减弱，寡聚半乳糖醛酸所诱导的防御相关基因的表达也受到抑制，对活体营养性病原菌白粉病的抗性减弱，不过该突变体对死体营养型病原菌灰霉的抗性不受影响(Manzoor et al；2013)。同时Mousavi等发现AtGLR还参与了伤诱导后茉莉酸信号在远距离的传递，其可以促进植物受伤刺激后JAZ的表达(Mousavi etal；2013)。根据以上这些关于GLR在植物防御反应中的研究，Forde等推断了GLR在植物防御反应中可能的一个作用模型，认为GLR的配体可能作为一种DAMP(damage-asscociatedmolecular pattern)。当植物受到病原菌侵染时，植物自我损伤的细胞会释放出一些小分子物质，其中释放出的氨基酸可以被位于膜上的GLR识别进而激活Ca²⁺内流，Ca²⁺作为第二信使将信号传递下去从而激活依赖于JA或者SA的防御反应(Forde and Roberts 2014)。

在本发明提出之前，并未见到关于陆地棉抗枯萎病主效基因的克隆和鉴定的报道，在本发明中，申请人利用棉花自然群体进行抗病鉴定并通过全基因组关联分析，将棉花抗枯萎病遗传位点定位在D03染色体上1.7-2.1Mb这一大约400Kb的区域。该基因组区域内共有24个候选基因，利用VIGS抑制候选基因表达并进行接种枯萎病菌处理以检测候选基因对棉花抗枯萎病的作用。最终申请人鉴定到棉花主效抗枯萎病基因GhFov1。抑制该基因的表达后使得棉花对枯萎病的抗性完全丧失。目前植物中已鉴定到的抗病主效基因主要分为三大类：RLP、RLK和NBS-LRR类。GhFov1基因编码一种谷氨酸受体蛋白，为一种新类型的抗病基因。根据抗枯萎病和感枯萎病陆地棉品种中该等位基因序列差异，申请人利用SNP差异设计了一对能检测抗病基因型和感病基因型的引物对。利用该引物对和优化的PCR反应体系能特异地只在具有抗病基因型棉花品种中扩增获得特异性的分子标记。这为棉花品种抗枯萎病检测提供了一种简单便捷的鉴定方法，本发明的分子标记可应用于棉花抗枯萎病分子标记辅助选择育种上。

发明内容

本发明的目的是在于提供一个棉花主效抗枯萎病基因GhFov1。通过棉花自然群体的全基因组关联分析确定了棉花抗枯萎病基因位点，利用VIGS抑制候选基因表达并接种枯萎病菌快速鉴定候选基因的功能，并最终鉴定到棉花主效抗枯萎病基因GhFov1。该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或至少50％同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

本发明的另一个目的在于提供一个基于抗枯萎病基因GhFov1及其感病等位基因的序列差异开发出可利用PCR扩增特异检测抗枯萎病基因型的分子标记。具体地说，是利用抗枯萎病基因GhFov1与感枯萎病棉花中对应的等位基因编码区域中序列的差别设计PCR引物对，由该引物对在优化的PCR反应体系下能在抗枯萎病棉花材料上获得特异的分子标记，但感枯萎病棉花材料不能获得。因此本发明的标记可用于精准评价棉花品系对枯萎病的抗性，也可用于分子标记辅助选择抗枯萎病品种，并显著提高鉴定棉花抗枯萎病鉴定和培育抗枯萎病新品种的效率。

本发明的技术方案如下所述：

以申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室已完成基因组测序的293份陆地棉栽培品种作为关联分析的自然群体(Wang et al 2017)，采用混合线性模型(P+G+Q+K)，以2016年新疆棉花病地中该自然群体各材料枯萎病发生的病情指数为表型进行全基因组关联分析，将棉花抗枯萎病基因位点定位在D03染色体上(见图1、图2和图3)。通过LD衰减的计算发现该基因位点在D03染色体上1.7-2.1Mb这一大约400Kb的区间(图4)，在此区间内一共有24个候选基因(表1)。分别构建了这24个候选基因的病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)载体并通过VIGS抑制候选基因的表达。在用Real-time PCR确认候选基因表达水平显著降低后(图5)，利用枯萎病菌株对植株进行接种，试验结果发现抑制抗枯萎病棉花品种‘新陆早46号’以及‘YZ1’中Gh_D03G0209，即本发明中的GhFov1基因表达后，棉花对枯萎病的抗性丧失；而其它候选基因的表达被抑制后并不影响棉花对枯萎病的抗性(图6)。本发明分别构建了棉花抗病品种GhFov1基因及感病品种中等位基因的瞬时表达载体，并利用农杆菌在烟草中瞬时表达。结果发现只有来自抗病棉花品种的GhFov1基因和枯萎病菌上清液共同注射烟草时有过敏反应发生(图7)，这表明GhFov1能识别病原并激活植物免疫反应。序列比对分析表明，GhFov1与感枯萎病品种中等位基因存在的SNP差别具有在抗病和感病品种中的共分离。根据GhFov1和感枯萎病品种中等位基因核酸序列的SNP变异，设计了一对引物组合：M-Fov1-F(TCCCAGGCTTCAACCATAT)/M-Fov1-R(TGTAACACAGCCTCAGATGC)，并通过试验发现褪火温度设置在61-64℃时的PCR条件能特异性地在抗枯萎病陆地棉品种中扩增出464bp的产物，而感枯萎病的陆地棉品种则无法扩增出该产物(图8)。上述扩增所得的产物可作为鉴别棉花抗枯萎病品种的特异分子标记。以抗枯萎病品种‘新陆早46号’为母本，以感枯萎病品种‘新陆早7号’为父本的杂交组合获得F2群体。对F2群体进行枯萎病接种并利用M-Fov1-F/M-Fov1-R引物组合对F2不同单株基因组DNA进行PCR扩增。试验结果发现能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的棉花单株均表现为抗枯萎病，而未能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的单株均表现为感枯萎病，分子标记与枯萎病抗性呈完全共分离，且符合3：1分离比(56R:18S,²＝0.018)(图9)。申请人进一步利用上述引物组合对2017年棉花国家区试品种基因组DNA进行PCR扩增，其中区试报告中表明抗枯萎病品种能扩增出464bp分子标记，而感枯萎病的棉花品种未能扩增出该分子标记(图10)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明通过全基因组关联分析，将陆地棉抗枯萎病位点定位在D03染色体大约400kb的区间内，进一步通过病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)以及烟草瞬时表达产生过敏性反应首次鉴定出了陆地棉中的抗枯萎病基因GhFov1。通过棉花F2分离群体的检测确定了GhFov1就是陆地棉抗枯萎病的主效抗病基因，这为以后深入研究陆地棉与枯萎病菌的互作奠定了基础。

2.目前国内外主要是通过在病圃地和室内人工接种的方法鉴定棉花对枯萎病的抗性，耗费周期长，成本高，且容易受到环境和不同年份间气候条件变化的影响。而本发明提供的引物组合M-Fov1-F/M-Fov1-R以及优化的PCR反应条件可以快速准确地鉴定棉花品种对枯萎病的抗性。因而基于该分子标记建立的抗枯萎病棉花品种鉴定方法具有准确性高、耗时短、效率高等优点，在棉花分子标记辅助选育抗枯萎病品种中具有重要的应用价值。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是GhFov1基因的CDS序列。

序列表SEQ ID NO:2是GhFov1基因编码的蛋白质序列。

图1：293份陆地棉栽培品种群体结构示意图。

附图标记说明：图1中的A图为基于Stucture的群体结构；图1中的B图为不同亚群的ΔK值；图1中的C图为群体的主成分分析；图1中的D图为群体的NJ聚类树，结果表明该群体可划分为两个亚群。

图2：2016年中国新疆病圃地中调查的棉花自然群体枯萎病发生病情指数分布图。

图3：陆地棉自然群体材料对枯萎病抗性的Manhattan图。

附图标记说明：一共有13个显著性位点，其中1个位于A01染色体上，另外12个位于D03染色体上且呈连续排列，显著性最高的位点为D03_2176763，-log10(P)＝10.75。

图4：陆地棉自然群体D03染色体的LD衰退距离示意图。

在D03染色体上当LD衰减到最大值的一半时对应的物理距离大约为200Kb。

图5：利用RT-PCR检测抗枯萎病候选基因VIGS后其基因表达水平的柱形图。

附图标记说明：抗病候选基因按其在D03染色体上的排列顺序依次用数字1-23表示，结果表明与对照相比，所有抗病候选基因的表达在经过VIGS处理后均明显降低。

图6：利用VIGS沉默GhFov1及其它候选基因后接种棉花枯萎病菌的示意图。

附图标记说明：图中为接种枯萎病菌后20天左右的发病状况，结果表明当GhFov1的表达水平降低后极大地削弱了棉花对枯萎病的抗性。而其它抗病基因位点内抗病候选基因的表达水平降低后后不影响棉花对枯萎病的抗性。

图7：GhFov1与枯萎病菌上清液共注射烟草后抗病反应检测结果。

附图标记说明：p35s-GhFov1-R上连接的是从抗枯萎病品种‘银山4号’中扩增出的GhFov1，p35s-GhFov1-R上连接的是从感病枯萎病品种‘新陆早8号’中扩增出的GhFov1，结果表明p35s-GhFov1-R与枯萎病菌上清液共注射烟草后烟草叶片有细胞死亡，产生HR反应，而p35s-GhFov1-S与枯萎病菌上清液共注射烟草后烟草叶片细胞无明显坏死，没有HR反应产生。HR反应通过台盼蓝染色示意。图7左图数字表示：1为p35s-GhFov1-R+枯萎病菌上清液p35s-GhFov1-R；2为p35s-GhFov1-S+枯萎病菌上清液；3为p35s-GhFov1-S；4为p35s-GhFov1-S；5为枯萎病菌上清液。

图8：利用引物组合M-Fov1-F/M-Fov1-R从53℃～68℃不同退火温度下通过抗枯萎病棉花品种和感枯萎病棉花品种检测优化PCR反应体系的电泳示意图。

附图标记说明：图中S1-4为4个感枯萎病的陆地棉栽培种，分别为‘鄂荆1号’、‘冀棉8号’、‘新陆早8号’和‘鄂棉11号’。R1-4为4个抗枯萎病的陆地棉栽培种，分别为‘银山4号’、‘中棉所12’、‘晋棉28号’和‘豫棉11号’。在53℃～68℃不同的退火温度下进行PCR扩增。利用该引物组合在PCR反应体系的退火温度为61℃～63.7℃时，仅能从抗枯萎病棉花品种中扩增出464bp的条带，而以感枯萎病棉花品种DNA为模板的反应体系无法扩增出464bp的条带。

图9：利用引物组合M-Fov1-F/M-Fov1-R来检测棉花F2群体中抗枯萎病分子标记的电泳示意图以及F2群体接种枯萎病菌后的抗性鉴定结果。

附图标记说明：以‘新陆早46号’为抗病亲本，‘新陆早7号’为感病亲本，两者杂交后再经一代自交获得F2分离群体。图9中的A图为父母本抗枯萎病特异性分子标记检测、接种枯萎病菌后发病状况。图9中的B图中1-74为F2分离群体不同单株编号，利用该引物组合对单株中抗枯萎病特异性分子标记进行PCR扩增然后电泳检测。一共74个单株，其中56个单株中能扩增出抗枯萎病特异性分子标记，18个单株中未能扩增出抗枯萎病特异性分子标记。图9中的C图为74个单株接种枯萎病后发病状况、剖杆观察及茎秆中菌量检测。通过qRT-PCR检测接种后单株茎秆中枯萎病菌含量，病菌含量以枯萎病菌ITS的DNA含量为标准，棉花UB7作内参。不同单株茎秆上方数值为通过该种方式计算而来，其中数值0表示未检测到。结果表明，18个未能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的单株均表现出感枯萎病，维管束变褐，茎秆中病菌含量较高；而56个能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的单株均表现出抗枯萎病，维管束正常，无菌丝积累，茎秆中病菌含量极低甚至为零。这表明在F2群体中，能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的单株抗枯萎病，而未能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的单株感枯萎病，呈现出完全共分离，且符合3：1分离比(56R:18S,²＝0.018)。

图10：利用引物组合M-Fov1-F/M-Fov1-R来检测区试品种中抗枯萎病特异性分子标记的电泳示意图。

附图标记说明：《2017年棉花国家区试品种报告》中A组感枯萎病品种为A5，A8，其余为抗枯萎病品种，B组全部为抗枯萎病品种。利用该引物组合对这些品种中抗枯萎病特异性分子标记进行PCR扩增然后电泳检测，结果发现感枯萎病品种A5和A8无法扩增出抗枯萎病特异性分子标记，而抗枯萎病品种可以扩增出抗枯萎病特异性分子标记。其中A1为‘晶华棉134’，A3为‘国欣17号’，A4为‘华惠20’，A5为‘中棉所9706’，A6为‘国欣棉31’，A7为‘湘K27’，A8为‘冈86’，A9为‘GK39’。B1为‘ZHM19’，B2为‘国欣棉18号’，B3为‘冈0996’，B4为‘中生棉11号’，B5为‘徐D818’，B6为‘华田10号’。(说明：本发明中涉及的试验品种为报道的棉花品种)

具体实施方式

实施例1：棉花抗枯萎病基因的全基因组关联分析

以申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室已完成基因组测序的293份陆地棉栽培品种作为关联分析群体，对最小等位基因频率小于0.05的SNP变异进行了过滤，过滤后的SNP用来计算群体结构、主成分分析以及系统进化分析，利用Structure软件对该群体进行了群体结构分析，计算K值从1到10，并且运行五个重复，Evanno’sΔK值在K＝2时取得最大值(图1A、图1B)，利用Tassel5进行主成分分析(图1C)，利用Phylip进行系统进化分析，然后用Figtree作图(图1D)，根据以上这些分析可鉴定出该群体分为两个亚群(图1)。

利用Tassel5中的混合线性模型(P+G+Q+K)，以2016年新疆病地中各材料枯萎病发生的病情指数(图2)为表型进行全基因组关联分析，该软件的运行参数为Run_pipeline.pl-fork1-h G-filterAlign-filterAlignMinFreq 0.05-fork2-r P-fork3-qQ-excludeLastTrait-fork4-k K-combine5-input1-input2-input3-intersect-combine6-input5-input4-mlm-export mlm_output-runfork1-runfork2-runfork3-runfork4。其中亲缘关系(K)利用SPAGeDi软件计算。Tassel5计算的结果整理后，利用R包qqman作出Manhattan图，以Bonferroni校正1/N(N为SNP标记数目)为显著位点。可看出在D03染色体上有呈连续排列的显著位点(图3)，最显著位点D03_2176763的–log(P)值为10.75，该位点位于Gh_D03G0209基因的编码区域且为非同义突变。通过Plink软件计算群体的连锁不平衡，该软件的运行参数为-ld–window-r2 0-ld-window 99999-ld-window-kb1000。连锁不平衡的计算使用最小等位频率大于0.05的SNP。连锁不平衡衰减的计算是分析两个SNP之间的r²,然后计算最大1Mb区间内每一个1kb之间SNP的r²的平均值。LD衰减区间取r²衰减到其最大值的一半所对应的距离，据此计算D03染色体上LD衰减区间大约为200kb(图4)，根据最显著位点在D03染色体上的物理距离和LD衰减区间初步将棉花抗枯萎病基因位点定位在D03染色体上1.97-2.37Mb这一400Kb的区间，该区间一共有24个基因(见表1)。

表1 24个候选基因棉花抗枯萎病基因位点定位

实施例2：VIGS验证候选基因对棉花枯萎病抗性的影响

1、VIGS载体构建和沉默效果检测

根据24个候选基因的编码序列设计引物用于构建VIGS载体，在正向引物5’端加上KpnI酶切位点(GCGTGAGCTCGGTACC)，反向引物5’端加上BamHI酶切位点(GCCTCCATGGGGATCC)，具体引物的核苷酸序列见表2。VIGS载体的构建参照高巍(Gao et al2013)的报道。载体构建好后经电击转入到农杆菌GV3101菌株中。

表2对23个候选基因设计的引物对

基因名称	正向引物	反向引物
			Gh_D03G0203	CCGTTCTGGATTTTATTGCTGG	TGGAAAAGTTGTTGTGCTTGAAATA
Gh_D03G0204	ATGGCGGAAACTCTAGCAAAG	TTCAACAACAGACTTCCCCATT
			Gh_D03G0205	GCATTACCATCGTTGACCTCC	ACACCTCTACCTTCATTGCTTCG
Gh_D03G0206	CACCACAGGGTTACGGCTCT	GTTTCAACCCAAATCGCAAGTA
			Gh_D03G0207	CCGATGATGCCGCCTTTAT	AACCACTTGTGCCCATTGCT
Gh_D03G0208	CCATAAAAAATCTAACATCACACAG	ACTGGAGCAGAAATGCCTAAC
			Gh_D03G0210	GAAACCAAACAAAGCCGAGATT	GTTCCCGAATAAAATCAAGTAGAGC
Gh_D03G0211	TGTAAAATAAGGTTCCAAAAAGTCC	GGACCATAAAGTGTTACGGGC
			Gh_D03G0212	ACCACTGTGTTGCCTATTTACCC	CACTTATCCTTTCCCTTCTATGCC
Gh_D03G0213	TTTCAAAAACACAAAGTTGGAGTC	CATCCCCATTACCAAACAAGAG
			Gh_D03G0214	TACTTCTTTCACCGATTTAGCCC	TGACCAAACACATTCAGTATCTCG
Gh_D03G0215	ATTGCTTACCAGTGGAAGTACATATT	AAAAGAACCCGATAGCGAATT
			Gh_D03G0216	TTCACCTAACCACTCCTTACAACA	TCTCTTCGCACTCGGCTAAC
Gh_D03G0217	TGCGGTGCGGAAACCTTAC	TGAACCGCTACCGTTGATGC
			Gh_D03G0218	CCATTGGACAACGGAACAGAC	TGCTTCTTTTTTCTCTCCTCTTTTT
Gh_D03G0219	GGCGACGGACTGAGAATGA	TTCAATGATAAAGCCTCTCAAGTCT
			Gh_D03G0220	TAGTTTTATAGTTCTTCGTGCCCAA	ATCCGATTTTCTCTCCCGTCA
Gh_D03G0221	CTGATGGAACAGTACGGGGC	AACGACCTTGTGTCACTTCTCTATG
			Gh_D03G0222	GGACAAACCGGAAAACTCTGG	TGTTTACACTCGGTGGTCGGA
Gh_D03G0223	CCAAAAAAAATGCCAAAAACA	TTGTTTCGTAAGCTAAGGACCC
			Gh_D03G0224	ATCACTTGGGGAGATTTTGGA	TTGTTTGTAAGGCATTGTTGTTTC
Gh_D03G0225	AAGCCGATCTTGTCGTTCAGTAC	GGAAACAACAATGCCTTACAAACA
			Gh_D03G0226	GCAGTAGCGTAAGAGGATGTCC	ACAAAAGGTGGCATTGGAAAC

将除了Gh_D03G0209外的23个候选基因(其中Gh_D03G0223表达量在棉花各个组织中表达量极低，因而未构建其作为VIGS载体)分为三组，每组7-8个基因等量混合进行VIGS注射，选择的材料为抗枯萎病品种‘新陆早46号’(实施本发明，并不限于该品种)。其中Gh_D03G0209单独进行农杆菌注射，选择的材料为两个抗枯萎病品种‘新陆早46号’和‘YZ1’(实施本发明，并不限于该品种)。将棉苗种于纯蛭石中，方便后续的接种操作。农杆菌注射完棉花子叶大约两周后取幼嫩叶片提取RNA，然后利用反转录酶将其反转录合成CDNA，以该CDNA为模板通过Real-time PCR检测候选基因沉默效果，检测沉默效果的qRT引物序列见表3。结果表明通过VIGS候选基因的转录受到了显著的抑制(图5)，表明将多个基因进行混合干涉这一方法是可行的，在确定候选基因沉默效果后利用枯萎病菌对候选基因转录水平被抑制的植株进行接种。

表3对23个候选基因设计的引物对

2、VIGS沉默候选基因后枯萎病的接种鉴定

接种采用的为7号小种中的强致病力菌株，将-80℃保存的菌株均匀涂布在PDA平板上培养3-4天后，用灭菌的枪头挑取一小块菌落块于查氏培养液中，置于25℃，200rpm摇床中振荡培养3-4天，培养液用两层纱布过滤收集其孢子,将孢子浓度调至每毫升含lxl0⁷个孢子。将实施例2中已检测完其沉默效果的棉苗从蛭石中轻柔拔出，然后将其放入已经调好浓度的孢子悬浮液中，使根部完全浸没，孢子侵染根部40min后取出棉苗种于营养土中。接种大约10d后，棉苗开始发病，从此时起开始对其发病情况进行统计，然后计算其病指。结果表明除了Gh_D030209，即本发明中的GhFov1，被沉默后其对枯萎病的抗性显著下降(图6A)，其余22个基因被沉默后对枯萎病的抗性没有发生变化(图6B)。因而推测GhFov1可能为棉花抗枯萎病的一个主效抗病基因。

实施例4：农杆菌介导的烟草瞬时表达及台盼蓝染色

根据GhFov1的DNA序列设计引物，引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，引物命名为正向引物：OE-GhFov1-F(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGTCTGCTAAGATTTTTGCT)和反向引物：OE-GhFov1-R(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGGAGCTGGTAAGTTGTGTTT)。然后以抗枯萎病品种‘银山4号’和感枯萎病品种‘新陆早8号’的DNA为模板进行PCR扩增，通过BP、LR反应将GhFov1连接到4X MYC载体pGWB417上，从而获得瞬时表达载体p35s-GhFov1-R和p35s-GhFov1-S。将构建好的瞬时表达载体用常规电击方法转入到农杆菌GV3101菌株中，然后将农杆菌菌液注射烟草进行瞬时表达，在注射36-48小时后再注射受棉花根部诱导后收集的枯萎菌的上清液。其中枯萎病菌上清液为用常规液体土豆培养基培养枯萎病菌时添加感病材料‘新陆早7号’的根系进行诱导，用两层纱布过滤后离心收集所得，通过此处理该上清液中含有枯萎病菌的分泌蛋白。在注射后60小时左右观察HR反应的产生，并且取烟草叶片进行台盼蓝染色，台盼蓝染色参考Bolton和Thomma所述(Boltonand Thomma 2012)。

台盼蓝染液配制：10ml乳酸；10ml水饱和酚；10ml甘油；10ml蒸馏水；10mg台盼蓝染料。

脱色液配置：250g水合氯醛溶于100ml蒸馏水中。

取50ml上述台盼蓝染液与50ml，96％的乙醇于广口玻璃瓶中进行等体积混匀，盖上盖子后将玻璃瓶置于100℃沸水中煮沸，然后放入待测的烟草叶片，沸水浴5min后将烟草叶片转移到玻璃皿中，加入10ml的脱色液，然后置于常温下直至叶片完全透明为止。

结果表明只有p35s-GhFov1-R与枯萎病菌上清液共同注射烟草时有HR反应产生，烟草叶片出现明显的坏死斑，而p35s-GhFov1-S与枯萎病菌上清液共同注射烟草时没有HR反应产生(图7)。进一步验证了GhFov1作为棉花抗枯萎病的一个主效抗病基因。

实施例5：棉花抗枯萎病基因的分子标记开发

抗枯萎病和感枯萎病棉花中GhFov1等位基因的编码区域存在SNP差异，其中抗病品种中为‘T’，感病品种中为‘G’，基于此设计了一对引物组合：M-Fov1-F(TCCCAGGCTTCAACCATAT)/M-Fov1-R(TGTAACACAGCCTCAGATGC)，将变异位点置于正向引物3’末端，在不同的退火温度下对提取的棉花DNA进行PCR扩增，反应条件为94℃5min，94℃30sec，53.0/53.5/54.3/55.7/57.3/58.6/59.5/60/61.0/61.5/62.4/63.7/65.3/66.6/67.5/68℃30sec，72℃30sec，30个循环，72℃延伸7min，结果发现抗枯萎病的陆地棉品种在退火温度为61-63.7℃之间时可以扩增出464bp明亮的条带，而感枯萎病的陆地棉品种在退火温度为61-63.7℃之间时无法扩增出条带(图8)。这种只能在抗枯萎病品种中扩增出的464bp的产物可以作为一种特异的分子标记。

实施例6：棉花抗枯萎病基因的分子标记应用

首先是构建棉花F2群体，该群体以抗枯萎病品种‘新陆早46号’为母本，以感枯萎病品种‘新陆早7号’为父本两者杂交再自交一代后获得。对F2群体进行枯萎病接种，接种浓度为每毫升lxl0⁷个孢子。大约15天后取茎秆作剖杆处理，并在体式显微镜下观察病菌在子叶节处维管组织的积累，另外提取F2群体各单株茎秆基因组DNA，以其为模板，通过qRT-PCR检测接种后单株茎秆中枯萎病菌含量，病菌含量以枯萎病菌ITS的DNA含量为标准，棉花UB7作内参。在接种前取一小片子叶提取各单株子叶基因组DNA，利用上述引物组合M-Fov1-F/M-Fov1-R对各单株基因组DNA进行PCR扩增，其中18个单株能扩增出抗枯萎病特异性分子标记，且剖杆结果显示病菌在子叶节处有明显积累，qRT-PCR结果也表明病菌含量较高。56个单株未能扩增出抗枯萎病特异性分子标记，剖杆结果显示病菌在子叶节处几乎无积累，qRT-PCR结果也表明病菌含量较低甚至没有(图9)。这表明能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的棉花单株均表现为抗枯萎病，而未能扩增出抗枯萎病特异性分子标记的单株均表现为感枯萎病，分子标记与枯萎病抗性呈完全共分离，且符合3：1分离比(56R:18S,²＝0.018)。此外，选取《2017年棉花国家区试品种报告》中A组和B组材料，取幼嫩叶片提取DNA，利用上述引物组合M-Fov1-F/M-Fov1-R对A组和B组材料基因组DNA进行PCR扩增，其中区试报告中为抗枯萎病的棉花品种能扩增出464bp分子标记，而感枯萎病的棉花品种未能扩增出该分子标记(图10)。结果表明可以应用该分子标记准确而便捷地对棉花枯萎病的抗性进行检测。

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种棉花抗枯萎病基因及其应用

<141> 2018-11-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1926

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1926)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1926)

<400> 1

atg tct gct aag att ttt gct ttt gtt ttg ctg ttg ata ctg tca tca 48

Met Ser Ala Lys Ile Phe Ala Phe Val Leu Leu Leu Ile Leu Ser Ser

1 5 10 15

aag tgt agt ggg ata aga gat gga gat gat cag aaa gat aca gag gat 96

Lys Cys Ser Gly Ile Arg Asp Gly Asp Asp Gln Lys Asp Thr Glu Asp

20 25 30

gat tca tgt ttg atg agt tgt aac aca gcc tca gat gca cac cat atc 144

Asp Ser Cys Leu Met Ser Cys Asn Thr Ala Ser Asp Ala His His Ile

35 40 45

cag tta aaa ttc aac cat tcg cct ggg aat gtt aca ccc ata gat cta 192

Gln Leu Lys Phe Asn His Ser Pro Gly Asn Val Thr Pro Ile Asp Leu

50 55 60

tat gat cat tat caa aat tat gtt gcc ata aaa aat ttg act tca cac 240

Tyr Asp His Tyr Gln Asn Tyr Val Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser His

65 70 75 80

agg tta ccg att cta tgt acc gtc aca agt tat gaa acc gct ttc tct 288

Arg Leu Pro Ile Leu Cys Thr Val Thr Ser Tyr Glu Thr Ala Phe Ser

85 90 95

gcg gaa atc aat gcg ttt acc agg aga gcc aag gca aac gta ctt tgt 336

Ala Glu Ile Asn Ala Phe Thr Arg Arg Ala Lys Ala Asn Val Leu Cys

100 105 110

gcg ctg cct gca ata gat aaa gca aca atg gga aac gaa tct tcg acg 384

Ala Leu Pro Ala Ile Asp Lys Ala Thr Met Gly Asn Glu Ser Ser Thr

115 120 125

agt tac atg tct cgt cat atg tac gaa att gct cgc gag att gcc agt 432

Ser Tyr Met Ser Arg His Met Tyr Glu Ile Ala Arg Glu Ile Ala Ser

130 135 140

cta atc ggc gac tac ata tgg ttg aag cct ggg acg act gtt tac aag 480

Leu Ile Gly Asp Tyr Ile Trp Leu Lys Pro Gly Thr Thr Val Tyr Lys

145 150 155 160

gaa tct gat aga att agt gat tta gac ata gtc act ttc aac ttg aac 528

Glu Ser Asp Arg Ile Ser Asp Leu Asp Ile Val Thr Phe Asn Leu Asn

165 170 175

agc cgt aat cca acg ccg aat aca ggt ggg atc att caa atg gct gca 576

Ser Arg Asn Pro Thr Pro Asn Thr Gly Gly Ile Ile Gln Met Ala Ala

180 185 190

act tta tca ttt tcg aca tcc aag cca gtt cac tat tat aca gag ata 624

Thr Leu Ser Phe Ser Thr Ser Lys Pro Val His Tyr Tyr Thr Glu Ile

195 200 205

agc att gcc gta cca gta aga tcg att ccc atg cag ttt ctt aac ata 672

Ser Ile Ala Val Pro Val Arg Ser Ile Pro Met Gln Phe Leu Asn Ile

210 215 220

agc cag gac gag aag aac cat aat gaa gca caa ata aca ggg ttt tgg 720

Ser Gln Asp Glu Lys Asn His Asn Glu Ala Gln Ile Thr Gly Phe Trp

225 230 235 240

act gat ctt ttt aaa gaa gct gtt gca gtg atg cca atc aat acc act 768

Thr Asp Leu Phe Lys Glu Ala Val Ala Val Met Pro Ile Asn Thr Thr

245 250 255

tat aaa ttg gtt cct ttc tac ggt tct gat gat caa ttg ttt aag gca 816

Tyr Lys Leu Val Pro Phe Tyr Gly Ser Asp Asp Gln Leu Phe Lys Ala

260 265 270

ctt gtt cgc agg act ttt gat gca gcc att ggc tta aca gta atg acc 864

Leu Val Arg Arg Thr Phe Asp Ala Ala Ile Gly Leu Thr Val Met Thr

275 280 285

aga aaa ggg tcc gag ctc tta gaa ttc tca tat cca tat ttc gaa gta 912

Arg Lys Gly Ser Glu Leu Leu Glu Phe Ser Tyr Pro Tyr Phe Glu Val

290 295 300

ggc ccg atg cta gtg atg aag gaa aag cct gaa ccg aac caa gtt ttt 960

Gly Pro Met Leu Val Met Lys Glu Lys Pro Glu Pro Asn Gln Val Phe

305 310 315 320

tca ttc atg atg cct ttc acc aac gag atg tgg tgt act ttg gca gct 1008

Ser Phe Met Met Pro Phe Thr Asn Glu Met Trp Cys Thr Leu Ala Ala

325 330 335

atg acg atg ttc aat gct ttt gtt att tgg tta gtt gag tct aga act 1056

Met Thr Met Phe Asn Ala Phe Val Ile Trp Leu Val Glu Ser Arg Thr

340 345 350

ggt cat gaa tct gtt gga gct atc ttc tgg ttc cct ttg gca acc ctc 1104

Gly His Glu Ser Val Gly Ala Ile Phe Trp Phe Pro Leu Ala Thr Leu

355 360 365

ttc tat gga ggg cat agg gaa tca ccg agg agc aat tta aca tat ttt 1152

Phe Tyr Gly Gly His Arg Glu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Thr Tyr Phe

370 375 380

gtg ttg gcc cca tgg ttg gtc ctg atc ctg gtt gtt tct tca acc tat 1200

Val Leu Ala Pro Trp Leu Val Leu Ile Leu Val Val Ser Ser Thr Tyr

385 390 395 400

aca caa agc ttt act tcc atg ata aca agc tca gac acc gag tca tca 1248

Thr Gln Ser Phe Thr Ser Met Ile Thr Ser Ser Asp Thr Glu Ser Ser

405 410 415

tct tgc tta gat ata gaa gat ctc aag aaa aca aat gct att gtg ggt 1296

Ser Cys Leu Asp Ile Glu Asp Leu Lys Lys Thr Asn Ala Ile Val Gly

420 425 430

tgt gat atg gaa gat tca att atg ttg cag cat tta gtg gag tac att 1344

Cys Asp Met Glu Asp Ser Ile Met Leu Gln His Leu Val Glu Tyr Ile

435 440 445

ggg ttc caa aga aag aac atc aag cac att gct caa tct tca atc gat 1392

Gly Phe Gln Arg Lys Asn Ile Lys His Ile Ala Gln Ser Ser Ile Asp

450 455 460

gat tat gct aaa gct cta tca act gga aaa ata aag gct gca ttc ttc 1440

Asp Tyr Ala Lys Ala Leu Ser Thr Gly Lys Ile Lys Ala Ala Phe Phe

465 470 475 480

tgg gcg cct tat tcg ggt ctt ttc ctt gca aaa tac tgc aaa ggt ttc 1488

Trp Ala Pro Tyr Ser Gly Leu Phe Leu Ala Lys Tyr Cys Lys Gly Phe

485 490 495

aga tct tgg gga ccc aac cat aat cta cgt ggt tct tca gtt att ttt 1536

Arg Ser Trp Gly Pro Asn His Asn Leu Arg Gly Ser Ser Val Ile Phe

500 505 510

cca agg gat tct cct ttt gct cca tac atg tca gag gcc atg gtg cga 1584

Pro Arg Asp Ser Pro Phe Ala Pro Tyr Met Ser Glu Ala Met Val Arg

515 520 525

tta tgt ggg agt gga aaa ttc aag cga atg aag gat gat tta cta tca 1632

Leu Cys Gly Ser Gly Lys Phe Lys Arg Met Lys Asp Asp Leu Leu Ser

530 535 540

ttt cct gag tgt tcg agt tca aca att gat gtc acc atg aaa cgg gga 1680

Phe Pro Glu Cys Ser Ser Ser Thr Ile Asp Val Thr Met Lys Arg Gly

545 550 555 560

ata gga cct ggg ccc ttc tca ggc tta ttt att tta tca ggc acg gca 1728

Ile Gly Pro Gly Pro Phe Ser Gly Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala

565 570 575

tct gca gtt gca ata ttg atc acg gtt att cga ccg atg aga aga cgc 1776

Ser Ala Val Ala Ile Leu Ile Thr Val Ile Arg Pro Met Arg Arg Arg

580 585 590

tgg gaa agg ttg gtt caa gga atg ttg atg ggt aga gga ctt tgg gta 1824

Trp Glu Arg Leu Val Gln Gly Met Leu Met Gly Arg Gly Leu Trp Val

595 600 605

tgg ctg act act ctg ttt tct cga gac caa agg gga aat cag ctc caa 1872

Trp Leu Thr Thr Leu Phe Ser Arg Asp Gln Arg Gly Asn Gln Leu Gln

610 615 620

gtt caa cta gca agg att agt ttc acg tcc caa aca caa ctt acc agc 1920

Val Gln Leu Ala Arg Ile Ser Phe Thr Ser Gln Thr Gln Leu Thr Ser

625 630 635 640

tcc tag 1926

Ser

<210> 2

<211> 641

<212> PRT