CN116284292A - 一种提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因及其应用 - Google Patents
一种提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因及其应用。本发明从谷子中分离和克隆到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因SiTAF10，荧光定量表达分析表明其参与了多种非生物胁迫。将该基因在谷子中超量表达后，在干旱和盐胁迫实验中，超表达SiTAF10基因的株系与野生型株系相比，存活率和叶绿素含量提高2倍多，活性氧(ROS)积累显著降低。说明本发明提供的SiTAF10基因与其编码的蛋白能够显著提高植物的抗旱和耐盐能力。因此，SiTAF10基因为谷子抗旱耐盐新基因资源，将在谷子抗旱耐盐品种改良中发挥积极作用，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高谷子抗旱和耐盐性的SiTAF10基因及其应用。
背景技术
谷子是我国北方干旱半干旱和盐碱瘠薄地的区域重要作物。近年来，谷子的消费需求、农户种植收益和意愿均呈明显增长趋势。然而谷子抗旱耐盐分子机理不清、可用种质少等问题是限制其生产的主要因素。因此，鉴定谷子抗旱耐盐基因，阐明其作用机理可为谷子逆境分子育种提供新基因资源和种质，具有重要的生产意义。
TAFs是一个具备转录起始识别和调控的独立的蛋白家族，且家族各成员均有其功能独特性。都含有HFD组蛋白折叠结构域。拟南芥中有18个编码TAF的基因。目前已经鉴定功能的TAFs多参与植物光及激素信号转导、形态建成及生殖生长。TAF1参与光信号转导；TAF1、TAF5和TAF6均能调节花粉管萌发；TAF4b控制着减数分裂过程中染色体的交换及生殖细胞系中的基因转录；TAF12b参与乙烯信号转导及细胞分裂素途径；TAF13通过调控植物种胚和胚乳的发育来参与调节植物种子发育；TAF15b参与植物自身免疫。因此TAFs是植株生长发育和抗逆性所必需的。然而谷子中TAFs家族成员未见报道。
发明内容
本发明提供了一种提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因及其应用。本发明从谷子中分离和克隆到SiTAF10基因，将其全长cDNA连接到35S启动子启动的表达载体上，利用农杆菌侵染转化谷子，实验证实SiTAF10基因能显著提高谷子的抗旱性和耐盐能力。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因，所述SiTAF10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述SiTAF10基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码产生的SiTAF10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了所述的SiTAF10基因在用于提高谷子抗旱性和耐盐性育种中的应用。
进一步的，所述含有SiTAF10基因的超表达载体是通过提取谷子RNA、RNA反转录成cDNA、基因克隆，再与35S启动的pCAMBIA 1305.1表达载体连接获得的。
进一步的，所述基因克隆的引物序列为：
P1：5’-ATGATGGGCAGCAACAGCA-3’；
P2：5’-CTCCTCCCTTGTCGAAGGAGC-3’。
进一步的，SiTAF10基因受到干旱和盐胁迫诱导表达上调。
进一步的，在干旱胁迫条件下，超表达SiTAF10基因的谷子株系光合速率、鲜重和存活率显著高于野生植株，失水速度显著低于野生植株，从而提高谷子的干旱胁迫耐受性。
进一步的，在盐胁迫条件下，超表达SiTAF10基因的谷子株系存活率和叶绿素含量显著高于野生植株，从而提高谷子的盐胁迫耐受性。
进一步的，在盐胁迫条件下，超表达SiTAF10基因的谷子株系中积累的活性氧ROS显著低于野生型。
进一步的，在干旱胁迫下，超表达SiTAF10基因的谷子株系中积累的ROS显著低于野生型。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明将SiTAF10基因全长cDNA连接到35S启动的1305.1表达载体上，利用农杆菌侵染转化谷子，经实验验证SiTAF10基因过表达可以使C4模式植物谷子转基因株系干旱和盐胁迫的耐受性增强。鉴于SiTAF10基因在植物中的保守性以及在转基因谷子呈现的表型，能够认为该基因具有应用价值。SiTAF10基因为谷子抗旱耐盐分子育种提供新基因资源，将在作物抗旱耐盐品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1A是荧光定量RT-qPCR分析SiTAF10在谷子不同组织中的表达量检测，根(root)、茎(stem)、叶(leaf)、成苗叶鞘(leaf sheath)、旗叶(flag leaf)、幼穗(youngpanicle)、发育穗(immature panicle)和成熟种子(mature seed)。图1B是荧光定量RT-qPCR分析在200mM NaCl、100μM ABA(脱落酸)、100μM IAA(生长素)、20％ PEG6000和100μMMeJA(茉莉酸甲酯)处理不同时间SiTAF10基因的表达特征。
图2A为SiTAF10基因连到1305.1表达载体；图2B为荧光定量RT-qPCR分析超表达SiTAF10株系中目的基因的表达量。
图3A为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在正常条件、干旱胁迫处理和干旱后复水的表型；图3B、C、D和E分别为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在干旱胁迫处理之后的光合速率、失水速率、鲜重、和存活率的分析比较。
图4A为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在正常条件和高盐胁迫处理之后的表型；图4B和4C分别为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在高盐胁迫处理之后的存活率及叶绿素含量分析比较。
图5A和5B为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在正常条件和盐胁迫条件下氯化硝基四氮唑蓝(NBT)以及二氨基联苯胺(DAB)染色分别检测过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2 。-)含量；图5C和5D为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在正常条件和盐胁迫条件下H2O2和O2 。-含量测定。
图6A和6B为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在正常条件和干旱胁迫条件下H2O2和O2 。-含量测定；图6C为超表达SiTAF10和野生型Ci846谷子在正常条件和干旱胁迫条件下ROS荧光染料H2DCFDA染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1：谷子SiTAF10基因的序列分析、克隆与载体构建：
本发明利用谷子基因组数据库网站phytozome找到基因SiTAF10，将该基因编码的氨基酸序列在ClustalW网站进行进行比对，发现SiTAF10蛋白在不同物种中高度同源。SiTAF10基因组序列全长为3862bp(序列如SEQ ID NO.1所示)，CDS序列为474bp(序列如SEQID NO.2所示)，其编码产生的SiTAF10蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。
根据SiTAF10基因的CDS序列设计引物，进行克隆，克隆方法如下：
(1)RNA的提取：使用百泰克通用植物总RNA提取试剂盒提取谷子的总RNA。
(2)反转录cDNA第一链的合成：将提取的RNA溶解后测定RNA浓度，然后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行反转录。
取5μg总RNA，加入2×反应缓冲液10μL，引物oligo dT(0.5μg/μL)1μL，反转录酶1μL，去基因组酶1μL，补水到20μL，在42℃孵育30分钟，85℃酶失活5分钟。
(3)SiTAF10基因的克隆：
上游引物：5’-ATGATGGGCAGCAACAGCA-3’；
下游引物：5’-CTCCTCCCTTGTCGAAGGAGC-3’；
使用诺唯赞高保真酶(Vazyme#P505)进行扩增，反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)0.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，高保真酶0.5μL，cDNA模板1μL，水补齐到25μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃后延伸5分钟；16℃保温。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，切胶并进行胶回收，胶回收方法根据BioTeke公司的快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Cat#DP1722)进行。
(4)取上述3.5μL胶回收产物与35S启动的pCAMBIA 1305.1表达载体进行连接，操作步骤按照新赛美公司的产品EasyFusion Assembly Master Mix说明书进行。连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有卡那霉素的LB平板上生长过夜，得到阳性克隆。挑取白色单个菌落进行菌落PCR，反应体系同上，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜。
(5)质粒DNA的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒(CW0500A)提取质粒DNA。
(6)序列测定：将提取的质粒DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。
实施例2：SiTAF10基因的组织以及诱导表达特征
为了证实SiTAF10基因是否参与植物耐逆反应的调控，本发明采用实时荧光定量RT-PCR技术分析了SiTAF10基因在谷子不同组织以及不同胁迫和激素处理下的表达模式。
一、正常生长条件下，SiTAF10基因组织表达分析
采集正常生长条件下谷子根、茎、叶、成苗叶鞘、旗叶、幼穗、发育穗和成熟种子，速冻于液氮，在液氮中研成粉末，使用百泰克通用植物RNA提取试剂盒提取RNA。分别以各部位提取的RNA为模板，用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix反转录试剂盒进行反转录。采用实时荧光定量RT-PCR分析SiTAF10基因的表达量。以谷子SiACTIN基因作为内参基因，SiACTIN基因扩增引物为Actin_F和Actin_R；SiTAF10基因扩增引物为SiTAF10_F和SiTAF10_R。
实时荧光定量RT-PCR反应体系为：
扩增程序如下：
(1)95.0℃60s；
(2)95.0℃10s；
(3)60.0℃10s；
(4)72.0℃15s；
(5)Plate Read；
(6)Incubate at 65℃for 20s；
(7)Melting curve from 65℃to 95℃，read every 0.5℃，hold 1s；
(8)End.
Actin_F序列为：5’-TTGCTGACAGGATGAATGGC-3’；
Actin_R序列为：5’-CACATCTGCTGGAATGTGCT-3’；
SiTAF10_F序列为:5'-CCAGAAGTTCCTTTCAGA-3’；
SiTAF10_R序列为：5'-CATCCATAGTCAGTACAAGA-3'。
结果如图1A所示，可以看出SiTAF10在幼苗期主要在根中表达，虽然在茎和叶片中也有表达，但表达量相对较低；在成苗期主要在穗和种子中表达，其次在旗叶中也有较高的表达。
二、胁迫和激素处理条件下，SiTAF10基因的表达分析
以野生型Ci846谷子为材料，生长1周，分别采用200mM NaCl、100μM ABA、100μMIAA、20％ PEG6000和100μM MeJA培养液进行胁迫处理。每种处理时间达到0、3、24h收集新鲜材料，于液氮中速冻保存。利用百泰克通用植物RNA提取试剂盒提取谷子材料的总RNA，用反转录试剂盒合成SiTAF10基因的第一链cDNA(操作步骤同本实施例标题一)，然后利用荧光定量RT-PCR分析SiTAF10基因的表达。其中，荧光定量RT-PCR实验，按SYBRPremix Ex TaqⅡ试剂盒配置PCR体系，于CFX96 Touch型荧光定量PCR仪进行实时定量荧光PCR检测。
结果如图1B所示，盐胁迫处理24h和PEG6000处理3h诱导了SiTAF10基因在谷子中表达明显上调；此外，MeJA诱导24h该基因表达也明显上调。
实施例2说明，SiTAF10基因在谷子根、穗和种子中表达，该基因是盐胁迫和干旱胁迫响应基因，参与谷子对高盐和干旱胁迫的应答。
实施例3：转SiTAF10基因培育抗旱、耐盐谷子
一、谷子SiTAF10的遗传转化和纯合转基因株系的筛选
取实施例1中已经构建好的2μL载体质粒(图2A)转化至农杆EHA105，侵染谷子胚性愈伤组织细胞。谷子胚性愈伤组织细胞来自谷子的野生型品种Ci846。通过潮霉素筛选，得到35S::SiTAF10的过表达材料。通过RT-qPCR检测，获得五个稳定过表达的转基因株系，结果如图2B所示。
二、转SiTAF10基因株系的抗旱性鉴定
将蛭石和营养土按1:1的比例混匀，称取相同重量后装于小盆中，通过底部的小孔吸水使土壤完全润湿，将吸胀过夜的转基因和野生型谷子的种子点种于小盆中，每个小盆9粒，种好后覆上一层土，轻轻压实，在温室中正常生长30天，选取生长一致的谷子幼苗进行干旱胁迫处理，并且需要时常变换小盆的位置，从而减少位置对谷子幼苗胁迫下生长造成的影响。直至植株在胁迫中生长7d，浇水恢复(图3A)，干旱处理5天时测定光合速率和失水率；干旱处理10天时测定鲜重，复水3天时统计存活率。
结果表明，干旱处理5天时转SiTAF10谷子的光合速率显著高于野生型(图3B)，失水速度显著低于野生型(图3C)，鲜重和存活率明显高于野生植株(图3D,E)，说明转SiTAF10谷子的抗旱性显著高于野生植株。
三、转SiTAF10基因谷子株系的耐盐性鉴定
将蛭石和营养土按1:1的比例混匀，称取相同重量后装于小盆中，通过底部的小孔吸水使土壤完全润湿，将吸胀过夜的转基因和野生型谷子的种子点种于小盆中，每个小盆9粒，种好后覆上一层土，轻轻压实，在温室中正常生长14天，选取生长一致的谷子幼苗进行盐胁迫处理，并且需要时常变换小盆的位置，从而减少位置对谷子幼苗胁迫下生长造成的影响。至植株在300mM NaCl中生长7d后，测定植株叶绿素含量；21d后测定存活率。
结果表明，300mM NaCl处理转SiTAF10基因植株的存活率(图4B)和叶绿素含量(图4C)明显高于野生植株；试验结果说明，转SiTAF10基因谷子的耐盐性明显高于野生植株(图4A)。
四、转SiTAF10基因谷子株系的活性氧(ROS)含量检测
将蛭石和营养土按1:1的比例混匀，称取相同重量后装于小盆中，通过底部的小孔吸水使土壤完全润湿，将吸胀过夜的转基因和野生型谷子的种子点种于小盆中，每个小盆9粒，种好后覆上一层土，轻轻压实，在温室中正常生长14天，选取生长一致的谷子幼苗进行盐胁迫处理，并且需要时常变换小盆的位置，从而减少位置对谷子幼苗胁迫下生长造成的影响。至植株在300mM NaCl中生长3d后，通过NBT以及DAB对转基因株系及野生型进行染色，并且对O2·-和H2O2的含量进行检测。
将蛭石和营养土按1:1的比例混匀，称取相同重量后装于小盆中，通过底部的小孔吸水使土壤完全润湿，将吸胀过夜的转基因和野生型谷子的种子点种于小盆中，每个小盆9粒，种好后覆上一层土，轻轻压实，在温室中正常生长30天，选取生长一致的谷子幼苗进行干旱胁迫处理，并且需要时常变换小盆的位置，从而减少位置对谷子幼苗胁迫下生长造成的影响。直至植株在胁迫中生长5d时，对转基因株系及野生型进行原生质体提取，加入H2DCFDA，之后在荧光电子显微镜下观察荧光，荧光强弱与ROS含量成正比；同时检测O2·-和H2O2的含量。
结果表明，盐处理7天时转SiTAF10谷子中积累的ROS显著低于野生型(图5A，B，C，D)，干旱处理5天时转SiTAF10谷子中积累的ROS显著低于野生型(图6A，B，C)。试验结果说明，转SiTAF10基因谷子在盐和干旱胁迫下积累较少的活性氧。
实施例3说明了与野生植株相比，转SiTAF10基因谷子对干旱和高盐胁迫的耐受性显著提高，在抗旱、耐盐育种中应用前景非常好。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因，其特征在于，所述SiTAF10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的提高谷子抗旱性和耐盐性的SiTAF10基因，其特征在于，所述SiTAF10基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码产生的SiTAF10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的SiTAF10基因在用于提高谷子的抗旱性和耐盐性育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含有SiTAF10基因的超表达载体是通过提取谷子RNA、RNA反转录成cDNA、基因克隆，再与35S启动的pCAMBIA 1305.1表达载体连接获得的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因克隆的引物序列为：
P1：5′-ATGATGGGCAGCAACAGCA-3′；
P2：5′-CTCCTCCCTTGTCGAAGGAGC-3′。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在干旱胁迫条件下，超表达SiTAF10基因的谷子株系光合速率、鲜重和存活率显著高于野生植株，失水速度显著低于野生植株，从而提高谷子的干旱胁迫耐受性。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在盐胁迫条件下，超表达SiTAF10基因的谷子株系存活率和叶绿素含量显著高于野生植株，从而提高谷子的盐胁迫耐受性。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在盐胁迫条件下，超表达SiTAF10基因的谷子株系中积累的ROS显著低于野生型。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在干旱胁迫下，超表达SiTAF10基因的谷子株系中积累的ROS显著低于野生型。
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