KR20130113035A - 배추 내염성에 관여하는 설트 오버를리 센시티브 3 단백질 및 그의 코딩 유전자 - Google Patents

배추 내염성에 관여하는 설트 오버를리 센시티브 3 단백질 및 그의 코딩 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis) 유래의 칼슘 결합 단백질인 SOS3 (Salt overly sensitive 3) 유전자에 관한 것으로, 이를 이용하여 내염성(salt tolerance) 배추를 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

배추 내염성에 관여하는 설트 오버를리 센시티브 3 단백질 및 그의 코딩 유전자{Salt Overly Sensitive 3 involved in salt tolerance of Brassica rapa ssp. pekinensis and a gene encoding the same}
본 발명은 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)로부터 분리된 설트 오버를리 센시티브 3(Salt Overly Sensitive 3) 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
인류의 식량 부족 문제는 늘어나는 인구에 의하여 야기되어지고 있으며 이를 극복하기 위하여 황무지의 개간과 간척지 사업을 통한 경작이 가능한 농경지를 늘리는 노력이 중요하게 되었다. 황무지와 간척지는 일반농지와 비교하여 비생물적 스트레스(abiotic stress)가 많이 존재하는데, 특히 토양 내 염류축적(salinization)이 심각하여 작물 생육에 악영향을 미친다. 높은 농도의 염류(salts)는 이온 스트레스(ion stress)와 삼투압 스트레스(osmotic stress)를 유발시키며, 이를 통하여 산화적인 스트레스(oxidative stress)와 영양장애 같은 2차 스트레스(secondary stress)를 초래한다고 알려져 있다.
효모(Yeast)의 내염성 기작은 식물과 유사한데, 효모의 한 종류인 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 칼시네우린(calcineurin)은 세포질 내에서 낮은 소듐이온(Na+) 농도와 높은 포타슘이온(K+) 농도를 유지시켜 높은 염류(salts) 농도에 저항할 수 있게 한다고 보고되고 있다.
배추과(Brassicaceae)의 내염성에 관련된 설트 오버를리 센시티브 3(Salt Overly Sensitive 3, SOS3) 유전자는 1997년 Zhu와 Liu로부터 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 sos3 mutant에 관한 연구에 의해 시작되었는데, 이 돌연변이체(mutant)는 소듐이온(Na+)과 리튬이온(Li+)에 과민하게(Hypersensitive) 반응하며 높은 소듐이온(Na+)과 낮은 포타슘이온(K+) 농도의 환경하에서 인위적인 외부의 칼슘이온(Ca2 +) 첨가로 소듐이온(Na+)에 의한 과민성이 회복된다고 보고되었다.
칼슘 결합 단백질(calcium binding protein)인 SOS3 유전자는 효모의 칼시네우린(calcineurin)의 조절부분(regulatory subunit)과 염기서열이 유사하며, 이에프-핸드(EF-hand)와 엔-미리스토일레이션(N-myristoylation)을 위한 염기서열을 갖고 있다. 식물이 외부에 의한 스트레스를 받았을 때 세포 외부에 있던 칼슘이온(Ca2 +)은 세포 내부로 이동하게 되는데, 높은 염류(Salts) 농도는 세포에 스트레스를 유발시켜 세포내에 칼슘이온(Ca2 +)이 증가하게 되며 SOS3는 이를 인지하여 칼슘이온(Ca2 +)을 결합(binding)하는 역할을 담당한다.
SOS3는 자체적으로는 아무런 활성이 없는데, EF-hand에 칼슘이온(Ca2 +)이 결합하면 입체형태의 변화(conformational changes)로 myristoyl group이 노출되어 엔-미리스토일레이션(N-myristoylation)되면서 활성을 갖게 된다. 엔-미리스토일레이션(N-myristoylation)된 칼슘 결합 단백질은 특정 세린/트레오닌 프로테인 키나아제(serine/threonine protein kinase)의 활성과 연관되어있으며, 이 특정 단백질의 활성화는 세포막에 존재하는 소듐이온(Na+)/수소이온(H+)과 포타슘이온(K+)/수소이온(H+) 역수송체(antiporter)의 활성화에 영향을 주는데, 이들의 역수송체(antiporter)는 소듐이온(Na+)을 세포 밖으로 배출시켜 내염성을 달성하는 것으로 보고되었다.
배추는 김치의 주재료로서 국이나 쌈 등에도 이용되는 한국의 4대 채소 가운데 하나이며 유채속(Brassica)에 포함되어 있다. 유채속(Brassica)에는 유채, 겨자등 산업적 경제성이 우수한 작물이 포함되어 있어 외국에서도 중요한 작물이다. 유채속(Brassica) 작물은 토양 내 염류축적(salinization)에 의한 피해를 받으면 생육장애에 의한 수확량이 감소되어 농가와 소비자에게 막대한 피해를 줄 수 있다.
이상에서 살펴본 바 유채속(Brassica) 및 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)의 내염성 향상에 관련 있는 SOS3 유전자에 관해서는 보고된 바 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)로부터 내염성(salt tolerance)과 관련된 SOS3 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SOS3 유전자를 클로닝 할 수 있는 프라이머 및 이를 이용하여 배추로부터 SOS3 유전자를 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배추로부터 분리한 SOS3 유전자를 이용한 발현 억제된 형질전환 벡터를 제공하고 이를 이용하여 신규 제작한 돌연변이 배추를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적은 기존에 발표되어 있는 채소작물의 SOS3 유전자 염기서열들의 상동성을 기초로하여 배추의 SOS3 유전자를 클로닝 할 수 있는 프라이머를 작성하는 단계와; 상기 프라이머를 이용한 RT-PCR 방법으로 배추로부터 SOS3의 전체 유전자를 얻는 단계와; 개발된 돌연변이 배추를 형질전환 벡터 내부의 염기서열로 작성된 프라이머를 이용하여 형질전환 여부를 확인하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 배추 유래의 내염성에 관여하는 SOS3 유전자를 분리하여 제공하는 효과가 있고, 이를 이용하여 과발현(over-expression) 벡터를 만들어 식물 형질전환시 배추의 내염성을 증가시켜 내염성 배추를 육성할 수 있으며, 이는 열악한 환경에서 정상적으로 생육할 수 있는 유용한 배추를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 각 SOS3-F와 SOS3-R을 사용한 RT-PCR에 의해 배추로부터 증폭된 SOS3를 코딩하는 유전자의 단편을 전기영동한 사진이다.
도 2는 각 SOS3-F와 SOS3-R을 사용한 RT-PCR에 의해 배추로부터 증폭된 SOS3를 코딩하는 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣은 후 정확한 삽입을 확인하기 위해 EcoRI을 처리하여 확인한 사진이다.
도 3은 RT-PCR에 의해 분리된 배추의 SOS3를 코딩하는 유전자의 시퀀스를 GenBank BlastX program을 사용하여 애기장대(Arabidopsis thaliana) 시퀀스와 상동성을 비교한 결과이다.
도 4는 RT-PCR에 의해 분리된 배추의 SOS3를 코딩하는 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 결과이다.
도 5는 RT-PCR에 의해 분리된 배추의 SOS3를 코딩하는 유전자를 NCBI Conserved Domain program을 이용하여 분석한 결과이다.
도 6은 RT-PCR에 의해 분리된 배추의 SOS3 유전자를 억제하는 RNAi 단편의 증폭 결과이다.
도 7은 pCR®8/GW/TOPO® 벡터에 도입된 SOS3 유전자를 억제하는 RNAi 단편을 제한효소 EcoRI을 이용하여 확인한 결과이다.
도 8은 SOS3 유전자의 발현 억제 RNAi 벡터(pSI3)를 나타낸 그림이다.
도 9는 SOS3 유전자 단편이 도입된 pSI3 벡터를 제한효소 BglⅡ을 이용하여 확인한 결과이다.
도 10은 SOS3 유전자가 억제된 돌연변이 배추 작성을 위한 형질전환 과정을 나타낸 사진이다.
도 11은 SOS3 RNAi 벡터(pSI3)가 도입된 배추의 사진이다.
도 12는 pSI3 벡터가 배추로 도입되었는지 확인하기 위해 벡터 내부 염기서열로 작성된 프라이머 P35S-F와 P35S-R을 사용하여 PCR을 통해 도입된 벡터의 내부 단편을 전기영동한 사진이다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 바람직한 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명한다.
본 발명에 사용된 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)는 기내의 무균상태에서 키운 것에서 샘플을 채취하여 RNA 분리에 사용하였다. 이하에서, 본 발명의 SOS3 유전자 분리과정을 설명한다.
실시예 1 : SOS3 (Salt overly sensitive 3) 유전자 조사
설트 오버를리 센시티브 3(Salt overly sensitive 3) 유전자의 공통된 부분을 찾기 위하여 기존에 발표되어 있는 작물별 설트 오버를리 센시티브 3(Salt overly sensitive 3)의 유전자를 "National Center for Biotechnology Information(NCBI) Genbank"에서 검색하였다. 유전자의 전체 염기서열을 수집하기 위해 Entrez program을 사용하였다. 검색방법으로는 유전자명을 설트 오버를리 센시티브 3(Salt overly sensitive 3)를 검색어로 선정하였다.
수집된 설트 오버를리 센시티브 3(Salt overly sensitive 3) 유전자 가운데, 같은 배추과 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 염기서열을 선발하여 염기서열의 상동성을 많이 보이는 부분을 BLAST program으로 찾은 뒤 그 부분을 중심으로 프라이머를 제작하여 SOS3-F(서열번호 1) 및 SOS3-R(서열번호 2) 프라이머로 하기 [표 1] 에 나타내었다.
프라이머 염기서열
SOS3-F (서열번호 1) 5'-ATG GGC TGC TCT CTG TCG A-3'
SOS3-R (서열번호 2) 5'-TTA GAA ATA TAG GTT TTG CAA CT-3'
실시예 2 : 배추로부터 RNA 분리
배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)의 잎을 액체 질소를 이용하여 파쇄한 후 1 ㎖ 트리졸(Trizol, Gibco BRL) 용액을 첨가하여 잘 섞은 다음 5분 동안 상온에서 방치하였다. 200 ㎕의 클로로포름(chloroform)을 넣고 섞은 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 뒤 그 혼합액의 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 이소프로페놀(isopropanol) 500 ㎕를 넣고 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 침전시킨 뒤 이소프로페놀을 제거하고 침전물을 75% 에탄올로 세척한 다음, 에탄올이 없도록 잘 건조시킨 후 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 멸균 증류수에 녹여 사용하였다.
실시예 3 : SOS3 유전자의 분리
SOS3 유전자의 분리는 상기 확보된 RNA를 주형으로 oligo dT 프라이머(primer)와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성한 뒤 [표 1]에 작성된 프라이머로 PCR하여 분리하였다.
cDNA 합성 프로그램 조건은 1 ㎍의 RNA를 oligo dT primer와 70℃에 두어 RNA 이차구조를 제거한 뒤 45℃에서 30분간 역전사시키고 그 사용된 역전사효소를 불활성화 시키기 위해 94℃에서 5분간 두었다. 그 후 합성된 cDNA 1 ㎍을 사용하여 상기 작성한 프라이머와 태그 중합효소(Tag polymerase)로 PCR하였는데 그 프로그램은 94℃에서 2분간 초기 변성 시간을 둔 뒤 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 40 반복(cycle) 실행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 최종 연장시킨 후 4℃를 유지하여 전체 반응을 종료하였다.
실험결과 증폭된 SOS3 유전자의 단편은 전기영동을 통해 확인하였다(도 1). 각각의 프라이머들로 증폭된 단편들은 그 각각의 염기서열을 분석하기 위해 PCR 산물용 벡터 pGEM-T easy vector에 클로닝하여 재조합 벡터를 구축하였다.
실험예 1 : 재조합 벡터를 이용한 E.Coli DH10β의 형질전환
대장균 DH10β를 LB 50 ㎖에 접종시켜 37℃에서 OD570= 0.375 ∼ 0.400이 되도록 배양한 후 균주배양액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 얻어진 침전물은 0.1M CaCl2 용액으로 풀어준 뒤 30분간 얼음에 두었다. 그 후 3,000 rpm에서 7분간 원심분리한 뒤 0.1M CaCl2에 침전물을 녹인 다음 상기에서 구축한 재조합 벡터를 함께 섞어 얼음에 30분간 두었다가 42℃에서 90초간 열 충격을 주었다. 10분간 얼음에 방치한 후 LB 배지 700 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕배양 하였다. 배양액을 12000 rpm으로 수초간 원심분리한 후 100 ㎕만 남기고 상등액을 제거하였으며 남은 상등액으로 침전물을 녹였다. 이후 앰피실린(Ampicillin) (50 mg/ℓ), X-gal (200 mg/ℓ in N-N dimethylformamide) 및 IPTG (200 mg/ℓ)가 첨가된 고체 LB 배지에 녹인 침전물을 전개하여 37℃에서 12시간 배양한 후 고체 배지에서 저항성을 보이며 흰색의 콜로니를 형성하는 형질전환된 것을 선발하였다.
실험예 2 : 재조합 DNA 분리 및 유전자 삽입 여부 조사
항생제가 첨가된 LB 배지 3 ㎖에 상기에서 선발한 형질전환 콜로니를 접종한 후 37℃에서 12시간 배양한 뒤 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 침전된 균 덩어리에 Solution I (200 ㎕/㎖)을 첨가하여 보텍스(vortex)를 수초간 수행하여 충분히 풀어준 뒤 Solution Ⅱ (200 ㎕/㎖)를 첨가하여 조심스럽게 섞어 세포막이 완전히 깨어지도록 실온에서 5분간 방치하였다. 이후 Solution Ⅲ (200 ㎕/㎖)를 첨가하여 잘 섞은 다음 얼음에서 10분간 방치한 뒤 12,000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 획득하였다. 획득한 상등액의 1/10 양의 NaOAc와 2.5배의 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 2시간 동안 재조합 DNA를 침전시킨 후 원심분리하여 침전물을 얻었다. 70% 에탄올로 침전물을 세척한 다음 멸균 증류수에 녹여 사용하였다.
배추로부터 증폭된 SOS3 유전자의 pGEM-T easy vector 내로의 삽입 여부를 확인하기 위해서 제한효소 EcoRⅠ을 상기 분리한 재조합 DNA에 처리하여 확인하였다(도 2). 삽입된 자리에 근접한 T7 및 SP6 프라이머를 이용하여 염기서열을 조사하였다.
실험예 3: SOS3 유전자 전체의 확인
염기서열 분석용 pGEM-T easy vector 내부에 클로닝 된 PCR 단편의 염기서열 분석은 GenBank BLAST program을 사용하여 이루어졌다. SOS3-F(서열번호 1)와 SOS3-R(서열번호 2) 프라이머로 증폭된 666 bp 산물의 염기서열과 아미노산 서열을 분석한 결과 (도 4), 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 SOS3 유전자와 87%의 높은 상동성을 보였다(도 3). 즉, RNA를 대상으로 SOS3-F와 SOS3-R 프라이머를 이용해 RT-PCR을 수행한 결과 배추의 SOS3 유전자의 전체 유전자가 증폭된다는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 또한 NCBI Conserved Domain program을 이용하여 분리한 유전자에 이에프-핸드, 칼슘 결합 모티프 도메인(EF-hand, calcium binding motif domain)이 있는 것을 확인하였으며 E-value가 1.01e-14로 그 정확도가 높음을 확인하였다(도 5). 확인된 염기서열을 바탕으로 시작 코돈(codon)과 종료 코돈을 결정한 후, 그것이 배추로부터 분리된 전체 배추의 SOS3 (Salt overly sensitive 3) 유전자로 결정하여 서열번호 7에 그 염기서열을 제시하고 서열번호 8에 아미노산 서열을 제시한다.
실시예 4 : SOS3 유전자의 발현 억제 RNA i 벡터 제작
식물발현용 RNAi 벡터 제작을 위해 Gateway® system(invitrogen, USA)을 포함하고 있는 pB7GWIWG2(Ⅱ) 벡터 (VIB-Ghent University, USA)를 이용하였다. SOS3 유전자의 효과적인 발현 억제 RNAi 벡터 구축을 위하여, NCBI Conserved Domain 프로그램을 이용한 분석 결과를 바탕으로 SOS3 유전자를 특징지을 수 있는 EF―hand를 가진 calcium binding motif 부위를 억제하기 위한 SOS3i-2F(서열번호 3)와 SOS3i-2R(서열번호 4) 프라이머로 작성하였으며, 프라이머는 하기 [표 2] 에 나타내었다.
프라이머 염기서열
SOS3i-2F
(서열번호 3)		 5'-GAC CTT CTT GCA TCC GTT ACG C-3'
SOS3i-2R
(서열번호 4)		 5'-GCG ACG GAT TCA TGG ACA CAA GA-3'
실시예 3에서 염기서열 분석용 pGEM-T easy vector 내부에 클로닝 된 SOS3 유전자 1 ㎍과 상기 작성한 프라이머를 이용하여 태그 중합효소와 함께 PCR 하였다. PCR 프로그램은 94℃에서 2분간 초기 변성 시간을 둔 뒤 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 40 반복(cycle) 실행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 최종 연장시킨 후 4℃를 유지하여 전체 반응을 종료하였다.
실험결과 증폭된 493 bp의 SOS3 유전자 발현 억제 RNAi 벡터 단편을 전기영동을 통해 확인하였다(도 6). 이후, 각각의 프라이머들로 증폭된 단편들은 그 각각에 Gateway® system(invitrogen, USA)을 적용하기 위하여, pCR®8/GW/TOPO® 벡터에 클로닝하였다. 올바른 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위하여 제한효소 EcoRI을 상기 재조합 RNAi 벡터에 처리하여 확인하였다(도 7). 상기 유전자가 삽입된 자리에 근접한 T7 및 T3 프라이머를 이용하여 염기서열을 조사하였다.
상기에서 제작한 SOS3 발현 억제 RNAi 벡터 단편을 Gateway® LR ClonaseTM Ⅱ enzyme mix (invitrogen, USA)를 이용하여, pB7GWIWG2(Ⅱ) 벡터에 sense 및 anti-sense 방향으로 삽입되도록 하였다(도 8). 이후, 제한효소 BglⅡ로 정확한 도입을 확인하였으며 그 실험결과는 도 9에 나타내었다.
실험예 4: SOS3 유전자가 억제된 형질전환 돌연변이 배추 제작
배추의 SOS3 유전자가 억제된 돌연변이 배추를 제작하기 위하여 본 발명자가 개발한 아그로박테리움에 의한 효율적인 배추의 형질전환방법(특허등록 제0523758호, 2005.10.31.)에 의거 실시하였으며, 그 결과는 도 10에 사진으로 나타내었다. 구체적인 형질전환 방법은 하기와 같다.
＜형질전환용 운반체(pSI3)를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔의 배양＞
배추에 접종하는 형질전환 매개체로는 상기 실시예 4의 식물형질전환용 벡터 pSI3를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404/pSI3을 사용하였다. 이하에서 아그로박테리움 투마파시엔이라 함은 상기 아그로박테리움 투마파시엔 LBA4404/pSI3를 말한다.
배추의 배축을 아그로박테리움 투마파시엔으로 접종시킬 때 형질전환의 효율을 높이기 위해, 먼저 형질전환용 운반체(pSI3)를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pSI3)을 스펙티노마이신(spectinomycin) 50 mg/L가 함유된 고체 YEP 배지에 평판배양하여 28℃에서 48시간 배양하였고, 배양된 아그로박테리움 투마파시엔 세포 중 몇몇 콜로니(colony)를 찍어 스펙티노마이신 50 mg/L가 함유된 5 mL 액체 YEP 배지에 접종하여 28℃에서 48시간 현탁배양 하였다. 배양된 현탁에서 700 ㎕를 추출한 다음, 0.02 mM Acetosyringone이 첨가되고 pH가 5.6으로 조정된 50 ㎖ 액체 YEP 배지에 첨가하여 28℃에서 OD600이 1.0이 될 때까지 현탁배양 하였다. 마지막으로 배양된 현탁액은 원심분리기에서 4000 rpm으로 15분간 원심분리시켜 25 ㎖ 액체 YEP 배지로 재현탁 되어 배추 배축의 접종에 사용되었다.
＜배추 형질전환 및 캘러스 유도＞
배추[CT001, 시원씨드]를 무균상태에서 발아시킨 뒤 배축을 5 ∼ 10 ㎜로 자르고, 상기 제작된 아그로박테리움 투마파시엔 현탁액에 10분간 침지시켜 접종하였다. 접종된 절편은 공동배양배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, 4 ㎎/L BA, 1 ㎎/L NAA, 4 ㎎/L AgNO3, 5 ㎎/L acetosyringone, pH 5.6)에서 3일간 공동배양 하였다. 이후 배추 배축을 액체 공동배양배지로 세척하여 아그로박테리움 투마파시엔을 씻어낸 후 캘러스 유도배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, 4 ㎎/L BA, 1 ㎎/L NAA, 4 ㎎/L AgNO3, 5 ㎎/L acetosyringone, 10 ㎎/L hygromycin, 200 ㎎/L cefotaxime, pH 5.6)에 형질전환된 배추 배축절편을 배양하여 형질전환된 조직에서만 캘러스가 유도되도록 하였다.
＜슈트 및 뿌리 유도＞
유도된 형질전환 캘러스를 절단하여 슈트 유도배지(캘러스 유도배지와 동일)에 옮겨 배양하여 슈트를 유도하였고 유도된 형질전환 슈트는 뿌리 유도배지(1/2 MS기본배지, 3% sucrose, 0.7% plant agar, 200 ㎎/L cefotaxime, pH 5.8)로 옮겨 뿌리 발생을 유도하였다. 뿌리가 생성된 형질전환체는 멸균된 질석에 이식하여 순화시켰고 이후 화분에 이식하여 온실에서 재배하였다.
실험예 5: SOS3 유전자가 억제된 돌연변이 배추의 형질전환 여부 확인
배추의 SOS3 유전자가 억제된 돌연변이 배추의 형질전환 여부를 확인하기 위하여 pB7GWIWG2(Ⅱ) 벡터 내부의 염기서열로 프라이머를 제작하여 각각 P35S-F(서열번호 5)와 P35S-R(서열번호 6) 프라이머로 하기 [표 3]에 나타내었다.
프라이머 염기서열
P35S-F (서열번호 5) 5'-TGC AGT CCT CTC CAA ATG AA-3'
P35S-R (서열번호 6) 5'-GTT CTG TTA GAT CCT CGA TC-3'
확보된 돌연변이 배추의 DNA를 주형으로, 태그 중합효소(Tag polymerase)로 PCR하였는데 그 프로그램은 94℃에서 2분간 초기 변성 시간을 둔 뒤 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 40 반복(cycle) 실행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 최종 연장시킨 후 4℃를 유지하여 전체 반응을 종료하였다.
실험결과 SOS3 유전자가 억제된 돌연변이 배추의 사진은 도 11에 나타내었다. 각각의 프라이머들로 증폭된 단편들은 전기영동을 통하여 밴드(band)의 유무를 확인하였다(도 12).
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 배추 유래의 SOS3 (Salt overly sensitive 3) 유전자를 제공하는 효과가 있고 이 유전자를 이용한 내염성 배추를 제공함으로서 경제적으로 유용한 배추 품종 육성을 도모하는 뛰어난 효과가 있으므로 원예산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Salt Overly Sensitive 3 involved in salt tolerance of Brassica rapa ssp. pekinensis and a gene encoding the same <130> 5103 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp. pekinensis <400> 1 atgggctgct ctctgtcga 19 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp. pekinensis <400> 2 ttagaaatat aggttttgca act 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp. pekinensis <400> 3 gaccttcttg catccgttac gc 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp. pekinensis <400> 4 gcgacggatt catggacaca aga 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector sequence <400> 5 tgcagtcctc tccaaatgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector sequence <400> 6 gttctgttag atcctcgatc 20 <210> 7 <211> 666 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp. pekinensis <400> 7 atgggctgct ctctgtcgaa gaagaagaaa attgcaatac caccgccggg atatgaggat 60 ccggaccttc ttgcatccgt tacgccgttt acggcagcag aagttgaagt tttgtacgaa 120 ttgttcaaaa aactaagcag ctcaatcatc gaggacggtc ttattcataa ggaagagttt 180 cagctggctt tactcggaaa caggaaccgg aacaatcttt tcgctgatcg gatatttgat 240 gtatttgatg tgaaacgtaa tggagtgatc gagtttggtg aatttgttcg gtctttaggt 300 gtcttccatc caaatgcacc tgtccatgaa aagatcaaat ttgctttcaa attgtacgat 360 ctaaggcaaa ctggattcat cgagcgagaa gaattgaaag agatggtaat agcgcttctt 420 cacgaatctg aacttgttct ttctgaagat atgatcgaag taatggtgga taaggcgttt 480 actgaaacag atcgcaacaa tgacgggaaa attgatgtag atgagtggaa agatcttgtg 540 tccatgaatc cgtcgctcat caaaaacatg actttgccct atctaaagga cataaaggcg 600 acgtttccaa gttttgtttt atctagtgaa gacgaagaac tggagttgca aaacctatat 660 ttctaa 666 <210> 8 <211> 222 <212> PRT <213> Brassica rapa ssp. pekinensis <400> 8 Met Gly Cys Ser Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ile Ala Ile Pro Pro Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Glu Asp Pro Asp Leu Leu Ala Ser Val Thr Pro Phe Thr Ala 20 25 30 Ala Glu Val Glu Val Leu Tyr Glu Leu Phe Lys Lys Leu Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Ile Glu Asp Gly Leu Ile His Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Gly Asn Arg Asn Arg Asn Asn Leu Phe Ala Asp Arg Ile Phe Asp 65 70 75 80 Val Phe Asp Val Lys Arg Asn Gly Val Ile Glu Phe Gly Glu Phe Val 85 90 95 Arg Ser Leu Gly Val Phe His Pro Asn Ala Pro Val His Glu Lys Ile 100 105 110 Lys Phe Ala Phe Lys Leu Tyr Asp Leu Arg Gln Thr Gly Phe Ile Glu 115 120 125 Arg Glu Glu Leu Lys Glu Met Val Ile Ala Leu Leu His Glu Ser Glu 130 135 140 Leu Val Leu Ser Glu Asp Met Ile Glu Val Met Val Asp Lys Ala Phe 145 150 155 160 Thr Glu Thr Asp Arg Asn Asn Asp Gly Lys Ile Asp Val Asp Glu Trp 165 170 175 Lys Asp Leu Val Ser Met Asn Pro Ser Leu Ile Lys Asn Met Thr Leu 180 185 190 Pro Tyr Leu Lys Asp Ile Lys Ala Thr Phe Pro Ser Phe Val Leu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Glu Glu Leu Glu Leu Gln Asn Leu Tyr Phe *** 210 215 220

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis) 유래의 SOS3 (Salt overly sensitive 3) 단백질을 코딩하는 프라이머 유전자.
  2. 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 배추 유래의 SOS3 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 배추 유래의 SOS3 단백질.
  4. 제2항 기재의 SOS3 유전자를 pGEM-T easy vector에 클로닝하여 제작된 재조합 벡터.
  5. 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 배추 유래의 SOS3 유전자를 pB7GWIWG2(Ⅱ)에 클로닝하여 제작된 발현 억제 재조합 벡터.
  6. 배추 유래의 SOS3 유전자가 도입되어 발현된 형질전환 배추.
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