KR20200063568A - 내염성 및 내고온성 관련 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

내염성 및 내고온성 관련 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비생물적 스트레스 저항성 관련 유전자 및 저항성이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 BrMIEL1 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 식물세포를 형질전환하여 BrMIEL1 유전자를 발현시켜 염 및 고온 스트레스에 저항성을 가지는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 식물체를 이용하면 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.

Description

내염성 및 내고온성 관련 유전자 및 이의 용도{Gene implicated in salt stress tolerance and use thereof}
본 발명은 내염성 및 내고온성 관련 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
농업은 타산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성을 가지고 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물이 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다.
작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염지(鹽海地)가 많다. 염지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염해의 피해를 받는 일이 많다.
식물 형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발 및 염에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다. 냉해와 한발 및 염은 수분 스트레스에 의해 유발되고 상호관련 되어 있으며, 저온에 의하여 발현이 유도되는 유전자는 종종 삼투 및 염에 의해서도 그 발현이 야기되기도 한다.
특히, 염은 작물의 삼투압에 의한 수분부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화 뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자발현의 변화 등도 야기한다.
현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(‘95~’04)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천ha로, 우리나라 총경지면적 1,836 천ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 작물의 내염, 내고온성 증진방법에 관해 연구를 하던 중, 배추 유래 한 유전자가 식물체의 내염, 내고온성을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한국특허공개공보 10-2013-0113035 A (2013.10.15)
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 비생물적 스트레스 저항성 유전자 및 이를 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질을 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 저항성 식물체의 제조방법 및 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 비생물적 스트레스 저항성 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 배추(Brassica rapa) 유래의 E3 ubiquitin-protein ligase MIEL1(BrMIEL1) 유전자를 의미할 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrMIEL1 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 BrMIEL1 단백질로 발현될 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질이 식물체 내에서 비생물적 스트레스 저항성을 유도할 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “비생물적 스트레스”는 식물체의 생장을 저해할 수 있는 생물이 아닌 인자로, 염, 온도, 건조와 같은 환경적 인자를 포함할 수 있고, 중금속, 에탄올, 과산화수소, 퓨란, 약산, 페놀화합물 등과 같은 화학적 인자를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 본 발명에서 비생물적 스트레스는 환경적 스트레스일 수 있고, 보다 구체적으로, 염 및 고온에 대한 스트레스일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 구체적으로 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrMIEL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것이 바람직하며, 이에 한정하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시발현(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시발현 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시발현 프로모터는 선택 가능성을 한정하지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 CaMV 35S 프로모터가 포함된 벡터 pB2GW7에 BrMIEL1 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터을 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 상기 "식물체"는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되고 조직 배양을 통해 재분화시킨 비생물적 스트레스 저항성 식물체를 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명에 따른 비생물적 스트레스 저항성 식물체는 BrMIEL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, BrMIEL1 유전자가 포함된 재조합 발현벡터로 아그로박테리움에 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 꽃에 분사시켜 형질전환시켰다. 그 다음, 제초제에 살아남는 개체를 선발하여 비생물적 스트레스 저항성 식물체를 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 BrMIEL1 단백질의 세포 내 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 유전자를 발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 BrMIEL1 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 BrMIEL1 유전자 또는 이들에 대한 상동유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 BrMIEL1 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물의 세포 내 수준을 증가시키는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 발현시키는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이와 동등물을 암호화하는 유전자, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다.
상기 단백질 동등물에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상동성을 갖는 상동 단백질이 포함된다.
상기 "상동 단백질"이란 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질로서 본 발명의 BrMIEL1 유전자 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 단백질을 말한다.
또한, 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함한다.
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 BrMIEL1 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다.
상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 BrMIEL1 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.
상기 "실질적으로 동질의 기능"이란 비생물적 스트레스에 대한 저항성에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 BrMIEL1의 활성에 직접관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 BrMIEL1의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과의 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrMIEL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 배추 유래 BrMIEL1 단백질의 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.
또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 발현되는 단백질의 활성, 즉, 비생물적 스트레스에 대한 저항성과 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조한 비생물적 스트레스 저항성이 증진된 BrMIEL1 유전자 발현 형질전환 개체는 비형질전환체(야생형)와 비교하여 비정상적 성장 또는 발달이 관찰되지 않았으므로, 기타 형질에는 변화 없이 비생물적 스트레스 저항성만이 증진된 식물체를 얻을 수 있어 유용하다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따라 제조한 BrMIEL1 발현 애기장대 식물체에 대하여 비생물적 스트레스 조건에서의 생존률을 측정하였다. 검정 결과, BrMIEL1 발현 애기장대에서 대조군과 비교하여 생존률이 증가한 것으로 보아, BrMIEL1 유전자는 비생물적 스트레스, 특히 고온 및 염 스트레스에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에서, 식물체 방어 시스템에서 BrMIEL1 의 기능을 실험하기 위하여, BrMIEL1 발현 애기장대 식물체에 RT-PCR을 수행하고, 식물체 저항성 관련 유전자의 발현 패턴에 대한 BrMIEL1 발현의 효과를 검정하였다. 그 결과, BrMIEL1 발현 개체에서 스트레스-반응성 유전자들의 발현이 강력하게 유도되었으므로, BrMIEL1 은 비생물적 스트레스 저항성 마커 유전자의 발현과 관련이 있음을 확인하였다.
본 발명은 식물체에서 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공할 수 있으며, 종국에는 비생물적 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.
도 1은 BrMIEL1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 배추 BrMIEL1과 MIEL1 를 포함하는 다른 작물의 아미노산 서열의 상동성 분석 결과이다. B282: B. rapa MIEL1 (XP_009120622.1), BnMIEL1 : B. napus MIEL1 (CDY50333.1 ), BoMIEL1 : B. oleracea MIEL1 (XP_013623140.1 ), RsMIEL1 : R. sativus MIEL1 (XP_018473129.1 ), EsMIEL1 : E. salsugineum MIEL1 (XP_006400801.1 ), CaMIEL1 : C. sativa MIEL1 (XP_010421090.1 ), AlMIEL1 : A. lyrata MIEL1 (XP_020879011.1 ), AtMIEL1 : A. thaliana MIEL1 (NP_197683.1 ).
도 3은 배추 BrMIEL1 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환 벡터의 모식도이다. 35SP: CaMV 35S 프로모터, B282: BrMIEL1, T35S: CaMV 35S 터미네이터, Bar: 제초제 저항성 유전자
도 4는 형질전환체에서 Genomic DNA PCR로 유전자 도입을 확인한 결과이다. M: 마커, Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 5는 BrMIEL1 형질전환 애기장대 내염성을 검정한 결과이다. A: 125mM NaCl에서 BrMIEL1 형질전환체 내염성 반응, Wt: 비형질전환체, #2-2-1, #4-1-3, #5-5-1: 형질전환체. B: 125mM NaCl에서 형질전환체 백화현상 정도. C: 125mM NaCl에서 식물체 생존율. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.
도 6은 내염성 배지에서 BrMIEL1 형질전환 애기장대 뿌리 생장을 관찰한 결과이다. A: 125 mM NaCl이 첨가된 배지에서 형질전환체 뿌리 생장 반응. B: 125 mM NaCl 배지에서 12일 유묘 생장 동안 형질전환체 주근의 길이 비교. C: 125 mM NaCl 배지에서 형질전환체 발생 측근 수 비교. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 7은 염처리 토양에서 형질전환체의 내염성을 검정한 결과이다. Wt: 비형질전환체, #2-2-1, #4-1-3, #5-5-1: 형질전환체
도 8은 내염성을 나타내는 형질전환체에서 내염성 관련 유전자 발현을 확인한 결과이다. B282: BrMIEL1 유전자, SOS1: salt overly sensitive1, HKT1: High-affinity K+ transporter 1, ABA1: ABA deficient 1, ABI1: ABA-insensitive1, FRY1: Fiery1, HOS1: High expression of osmotically responsive gene 1, SAD1: supersensitive to abscisic acid and drought 1. DREB2A: dehydration-responsive element-binding protein 2A, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 9는 BrMIEL1 형질전환 애기장대 고온 내성을 검정한 결과이다. Wt: 비형질전환체, #2-2-1, #4-1-3, #5-5-1: 형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.
도 10은 고온 내성을 나타내는 형질전환체에서 온도 관련 유전자 발현을 확인한 결과이다. B282: BrMIEL1, CYP71B: cytochrome P450 family 71 subfamily B polypeptide 21, HSP18.1: heat shock protein 18.1 TCH4: touch-induced 4, UK39: Unknown39, DREB2C: dehydration-responsive element-binding protein 2C, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> 배추 유래 BrMIEL1 유전자 분리 및 발현 벡터의 제작
<1-1> 배추 유래 BrMIEL1 유전자 분리
배추 생장발달 및 환경, 스트레스 처리 후에 유전자 은행을 제작하였다. 이로부터 구축된 EST 정보로부터 cDNA 클론이 완전장 (full-ORF)을 포함하고 있으며 특이적 발현을 나타내고 애기장대 유전자들과 유사성이 낮은 약 300개의 배추 고유 유전자 중에서 BrMIEL1 선발하였다.
선발된 배추 유전자의 아미노산 서열을 분석하여 본 결과 단백질 합성을 위한 ATG 시작 코돈부터 TAA 종결코돈까지 한 888개의 염기로부터 번역된 295개의 폴리펩티드로 구성된 구조를 가지고 있으며 CHY zinc finger와 zinc ribbon finger motif를 갖고 있는 MIEL1 유전자 (Genebank ID XP_009120622.1)로 확인되었다(도 1). 다른 식물 7종의 MIEL1 아미노산 서열들을 비교 분석한 결과 85.8-97.3%의 높은 상동성을 나타내고 있으며 CHY zinc finger와 zinc ribbon finger motif가 잘 보존되어 있었다 (도 2).
<1-2> 배추 BrMIEL1 유전자의 발현 벡터의 제작
게이트웨이 시스템을 이용해서 선발된 BrMIEL1 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환용 벡터를 제작하였다. 최종 운반체 (pB2GW7)에 삽입하기 위해 필요한 특정 서열(attB sequence)은 PCR을 통해서 얻었다. 위치 특이 재조합(site-specific recombination)을 위해 유전자에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 29bp로 PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부(12bp)만을 gene specific sequence (GSP)에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 시행하였다. 첫 번째 PCR은 B282B1 프라이머(5‘-AAAAAGCAGGCTATGGAGATTGGTTTCCA-3’; 서열번호 3) 및 B282B2 프라이머 (5‘-AGAAAGCTGGGTCTAACCGGTTAAACCAA-3’; 서열번호 4)를 이용하여 95℃ 2분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 68℃ 1분의 10회; 및 68℃ 10분의 조건으로 수행하였다. 이 PCR 반응액의 1/10을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 attB1 (5‘-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’; 서열번호 5) 과 attB2 (5‘-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3’; 서열번호 6)를 프라이머로 이용하여 95℃ 2분;94℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 1분의 5회; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 1분의 25회; 및 68℃ 10분의 조건으로 두 번째 PCR을 하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제하여 사용하였다. 따라서 이 PCR 산물은 attB 서열을 모두 갖게 되어 이것을 형질전환용 벡터 제작에 사용했다. 게이트웨이 시스템은 크게 BP 반응과 LR 반응으로 나눌 수 있는데, attB 서열을 가지고 있는 BrMIEL1 유전자의 PCR 산물을 pDNOR 벡터(invitrogen)와 먼저 BP 반응을 시켜 중간 벡터를 만들었고, 이 산물을 최종 운반체와 LR 반응을 하여 원하는 최종 형질전환용 벡터를 얻었다(도 3).
<실시예 2> 배추 BrMIEL1 유전자 발현 형질전환체 제작 및 발현 검정
본 발명자들은 실시예 1-2에서 제작한 벡터의 식물에서의 발현을 확인하기 위하여 애기장대에 형질전환하였다.
구체적으로, 제작된 벡터를 애기장대에 도입하기 위하여 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 냉동/해동을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열 쇼크(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 스펙티노마이신(spectinomycin) 50 ㎎/ℓ, 리팜피신(rifampicin) 50 ㎎/ℓ, 젠타마이신(gentamycin) 25 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28 ℃에서 3-4일 정도 배양하였다. 형성된 콜로니 중 형질전환된 콜로니를 애기장대 형질전환에 사용하였다. 상기에서 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101를 아그로박테리움 GV3101:pB282로 명명하였다.
제조한 pB282 재조합 발현벡터를 포함한 아그로박테리움 GV3101 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 23℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시킨다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도한다. pB282 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 균주를 항생제가 포함된 5㎖의 LB배지에서 48시간 동안 배양한 후 5% sucrose와 0.05% silwet L-77이 함유된 용액에 O.D 0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조한다. 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 동일한 방법으로 2회 형질전환을 반복한다. 이 후, 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 파종하여 생육 2주째 1차, 4주째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 형질전환체를 선발하여 같은 조건으로 생육시킨 후 후대종자를 확보하였다. 수확한 형질전환 애기장대 종자를 25㎍/㎖ 포스피노트리신 (DL-phophinothricin)이 포함된 MS배지에 파종하여 멘델의 유전법칙에 의한 잡종 제 2대의 분리비가 약 3 (항생제 저항): 1 (항생제 민감)로 나타나는 형질전환체를 선발하여 다음의 실험에 사용하였다.
Genomic DNA PCR과 RT-PCR을 통해 BrMIEL1 유전자 삽입 유무와 발현을 각각 확인하였다. 형질전환 애기장대 식물체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하였다(DNeasy Plant Kit, Qiagene). 분리된 genomic DNA 100 ng을 사용하여 유전자 특이 프라이머(B282F: 5'- ATGGAGATTGGTTTCCAAGAAAATG-3 ; 서열번호 7, B282R: 5'- CTAACCGGTTAAACCAACAACCTGAG-3' ; 서열번호 8)을 이용하여 PCR(95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 35 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 식물체내 유전자 도입을 확인하였다.
형질전환체에 도입된 유전자 발현을 확인하기 위해 3 주간 재배한 형질전환 식물체의 잎을 채취한 후 즉시 액체질소에 얼려 막자사발로 마쇄하였다. 마쇄한 시료로부터 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해서 total RNA를 분리 하였다. Semi-quantitative RT-PCR 분석을 위해 역전사 효소(MMLV transcriptase RNase free, Toyobo)를 이용하여 total RNA 2 μg을 cDNA 라이브러리로 제작하고 3배 희석하여 2 μl를 PCR 증폭에 사용하였다. 유전자 특이 프라이머 B282F(서열번호 7)와 B282R(서열번호 8)를 이용하여 PCR (95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 25 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 유전자 발현을 확인하였고 DNA 염기서열 분석을 통해 도입된 유전자의 발현을 최종 확인 하였다. Actin 유전자 발현 수준은 정량적 대조군으로 사용되었으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
그 결과, 비형질전환체에서는 BrMIEL1 이 발현되지 않는 반면에, 형질전환체에서는 BrMIEL1이 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 4).
<실시예 3> BrMIEL1 발현 형질전환체의 염 스트레스 저항성 검정
본 발명자들은 실시예 2에서 제작한 BrMIEL1 유전자 발현 애기장대의 염 스트레스에 대한 저항성을 확인하였다.
구체적으로,
가. 표면 살균한 형질전환 애기장대 종자를 125 mM NaCl이 포함된 1/2 MS 배지(MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite)에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파를 위해 저온처리 하였다. 저온처리 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 배양하였다. 15-20일 후에 백화현상이 나타난 비율과 생존비율을 측정하였다.
그 결과 백화율은 비형질전환체가 893%이며 형질전환체가 23%로 나타났고(도 5B), 생존율은 비형질전환체가 10.7%이며 형질전환체가 77%로 나타났다(도 5C).
나. 고염도에서 형질전환 식물체의 뿌리 길이 생장을 측정하기 위해 Square-dish (1/2MS salts, 1% Sucrose, 125 mM NaCl, 0.8% Gelrite) 배지에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 Square-dish를 세운 후 12일간 뿌리의 길이를 측정하였다.
그 결과, 내염성 배지에서 뿌리 길이 생장을 유묘 생장 12일 동안 측정한 결과 비형질전환체 비해서 형질전환체 뿌리가 거의 정상적으로 생장하였다(도 6A).
또한, 유묘 생장발달 동안 주근(Primary root)의 길이를 측정한 결과 비형질전환체에서는 주근 생장이 억제 받고 길이가 짧아졌으나 형질전환체 주근은 정상적으로 생장하였다(도 6B). 아울러 주근으로부터 발생된 측근의 수는 비형질전환체에서 1.2개로 급격하게 감소하였으나 형질전환체는 4-7개로 정상적으로 발생하였다(도 6C). 이 결과들로 부터 125 mM NaCl 배지에서 형질전환 애기장대는 BrMIEL1 유전자 도입에 의해 내염성이 증가한 것으로 예측되었다.
다. 원예용 상토에서 형질전환 애기장대 종자 50립을 파종 하여 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 10일간 키운 후 대조군으로 NaCl이 포함되지 않은 일반물과 150 mM NaCl과 200 mM NaCl이 포함된 물 각각을 2일 간격으로 5번 공급한 후 10일 뒤 생존률을 측정하였다.
고염농도의 토양에서 형질전환 애기장대의 내염성 검정을 분석하기 위해 원예용 상토에서 10일 생장한 형질전환 애기장대에 염처리(일반물, 150 mM NaCl, 200 mM NaCl)를 2일 간격으로 5번 처리하여 10일 후 생존율을 조사한 결과, 200 mM NaCl에서는 비형질전환체와 큰 차이 없이 생존율이 낮았으며 150 mM NaCl에서는 생존율이 비형질전환체가 약 22%이며 형질전환체가 약 79.3%로 비형질전환체보다 형질전환체의 생존률이 57.3% 더 높게 나타났다(도 7).
따라서, 비형질전환체(NT)에서 보다 형질전환 애기장대에서 염 스트레스 저항성이 증진되었음을 알 수 있었다.
<실시예 4> BrMIEL1 유전자의 발현에 따른 형질전환체 내 내염성 관련 유전자의 발현 분석
21일 생장한 형질전환 애기장대 5번째 잎에서 total RNA분리 후 애기장대 내부 내염성 관련 유전자들의 발현양상을 RT-PCR로 분석 하였다.
구체적으로, 형질전환 식물체에서 염 스트레스 관련 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 21일 자란 형질전환 식물체의 5번째 잎으로부터 Trizol을 사용하여 total RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리로 제작하고 (앞의 방법과 동일) 내염성 관련 유전자 특이 프라이머들(표 1)을 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다. Semi-quantitative RT-PCR 결과로부터 Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 GelQuant.NET (http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html)을 이용하여 상대적 발현 수준을 측정하였으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
내염성 관련 유전자 특이 프라이머 서열
유전자 AGI No. 프리이머 서열 예상 size (bp)
SOS1 At2g01980 5’-ATGACGACTGTAATCGACGCGACG-3’(서열번호 9) 정방향 727
5’-ACGCCAGACCAATGCCTACAGCTCC-3’(서열번호 10) 역방향
HKT1 At4g10310 5’-CGCTGTGACGTTGAGACTGTTACTG-3’(서열번호 11) 정방향 916
5’-CCATATGCACTGATAACTTCGAGAG-3’(서열번호 12) 역방향
ABA1 At5g67030 5’-TGACTCTGCAGCAGATTCTAGCACG-3’(서열번호 13) 정방향 892
5’-ACCCAGTCAAGCATCGATGGCATAGC-3’(서열번호 14) 역방향
ABI1 At4g26080 5’-ATGGAGGAAGTATCTCCGGCGATCG-3’(서열번호 15) 정방향 951
5’-ATCGCCAATGGATCTCGACATGGCG-3’(서열번호 16) 역방향
FRY At5g63980 5’-ATGGCTTACGAGAAAGAGCTTGATG-3’(서열번호 17) 정방향 884
5’-ACTATAGCACCAGCGACATGGTCC-3’(서열번호 18) 역방향
HOS1 At2g39810 5’-TGAACTATGTGTTGAATCCATGTGG-3’(서열번호 19) 정방향 744
5’-ACTGGTCTACAGCATCAGGCCATGC-3’(서열번호 20) 역방향
SAD1 At5g48870 5’-ATGGCGAACAATCCTTCACAGCTTC-3’(서열번호 21) 정방향 267
5’-TCATTCTCCATCTTCGGGAGACCC-3’(서열번호 22) 역방향
DREB2A At5g05410 5’-ATGGCAGTTTATGATCAGAGTGGAG-3’(서열번호 23) 정방향 879
5’-CCTGTATGAACCGTTGGCAACACTG-3’(서열번호 24) 역방향
그 결과, 내염 저항 경로에서 이온 항상성(Ion homeostasis under salt stress)유지에 중요한 역할을 하는 Na+/H+ antiporter SOS1(salt overly sensitive1) 유전자의 발현이 증가하였다(도 8).
따라서 애기장대 식물에 도입된 배추 BrMIEL1 유전자가 형질전환체에서 내염저항 경로에서 이온 항상성 유지에 관련된 유전자의 발현을 증가시킴으로써 식물체 내염성을 증가시키는 효과를 나타낸 것으로 예측되었다.
<실시예 5> BrMIEL1 발현 형질전환체의 고온 스트레스 저항성 검정
본 발명자들은 실시예 2에서 제작한 BrMIEL1 유전자 발현 애기장대의 염 스트레스에 대한 저항성을 확인하였다.
구체적으로,
가. 표면 살균한 형질전환 애기장대 종자를 1/2 MS 배지(MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite)에 파종하여 2-4일간 4℃에서 2-4일 처리 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 4일간 배양한다. 4일째 배양 플레이트를 45℃ 수조에 담구고 90분간 처리한다. 열처리한 플레이트를 23℃ 생장상으로 이동하여 10일 동안 회복배양 시킨 후 생존비율을 조사하였다.
그 결과 비형질전환체는 거의 살아남지 못했으나 형질전환체는 생존율 87.4%였다(도 8).
<실시예 6> BrMIEL1 유전자의 발현에 따른 형질전환체 내 고온 내성 관련 유전자의 발현 분석
형질전환 식물체에서 고온 스트레스 관련 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 21일 자란 형질전환 식물체의 5번째 잎으로부터 Trizol을 사용하여 total RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리로 제작하고 (앞의 방법과 동일) 내염성 관련 유전자 특이 프라이머(표 2)를 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다.
내고온성 관련 유전자 특리 프라이머 서열
유전자 AGI No. 프리이머 서열 예상 size (bp)
CYP71B2-1 At1g13080 5’-ATGACGATCTTGCTCTGTTTCTTC-3’(서열번호 25) 정방향 509
5’-TCAATAACGTTGAACAGGCACAAG-3’(서열번호 26) 역방향
HSP18.1 At5g59720 5’-TCTCCCGAAAAGCAACGAA-3’(서열번호 27) 정방향 366
5’-CATAAACTTCCCACTAGCTC-3’(서열번호 28) 역방향
TCH4 At5g57560 5’-ATGGCGATCACTTACTTGCTTCCTC-3’(서열번호 29) 정방향 864
5’-TTACTCTCTCTATGCAGCTAAGCAC-3’(서열번호 30) 역방향
Unknown39 At3g60520 5’-ATGGTGGATCTTGAAAGAAGAGTG-3’서열번호 31) 정방향 390
5’-CTAACACATAACATCCTTGAGAAG-3’(서열번호 32) 역방향
DREB2C At2g40340 5’-GGAGACTTTGGATGCTTG-3’(서열번호 33) 정방향 367
5’-TTATGTAGATCCATGAACATCTTTG-3’(서열번호 34) 역방향
그 결과 고온 스트레스 반응 경로에서 고온에서 세포를 보호하는 기능을 가진 HSP18.1 (heat shock protein 18.1)와 온도 자극 등의 환경 스트레스 관련 TCH4 (touch-induced 4) 유전자 발현이 증가되었다. 반면에, 세포내 산화환원효소 활성 기능을 가지는 CYP71B (cytochrome P450 family 71 subfamily B polypeptide 21) 유전자의 발현은 감소하였다(도 9).
이 결과로 부터 형질전환체에서 배추 BrMIEL1 유전자는 고온 및 온도 자극 환경 스트레스 관련 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 식물체의 고온 내성을 증가시키는 효과를 나타내지만 산화환원효소 활성 경로와 다른 경로로 내고온성 효과를 나타냈을 것으로 예측되었다.
<110> Republic of Korea <120> Gene implicated in salt stress and high temperature tolerance and use thereof <130> P18R12C1139 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 888 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 atggagattg gtttccaaga aaatgatcaa aatcaagaac ttgactctca cgttacgcat 60 cttatggaga ttagttctgg gtattacggg tgctcacatt atagaagacg atgcaagatc 120 agagcaccat gctgtgatga agtattcgat tgcagacact gccacaacga agctaaggat 180 tctcttcaaa ctgaacagct ccttagacat gatcttcctc gacatgatgt ttccaagctc 240 atatgctcgc tttgtgagac agaacaagac gtccagcaaa actgctccac ttgtggtgta 300 tgtatgggga agtacttctg ctcaaaatgc aaatttttcg acgatgatct ttccaagaag 360 caatatcact gcgatgactg tgggatatgc aggaccggag gaaaagaaaa cttcttccat 420 tgcaaaagat gtcgatgttg ctactccaaa gttttggagg acaagcaccg gtgtctggaa 480 ggcgcattgc atcacaattg cccggtttgt tttgagtatc tttttgattc gacaagagat 540 atcacggtcc tgcgatgtgg tcacgctacg catttagaat gtaccaaaga tatggggctg 600 cataaccgat acacatgccc tttatgctct aaatcgatat gtgacatgtc cagcgtgtgg 660 aagaaacttg 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Ser Lys Val Leu Glu Asp Lys His Arg Cys Leu Glu 145 150 155 160 Gly Ala Leu His His Asn Cys Pro Val Cys Phe Glu Tyr Leu Phe Asp 165 170 175 Ser Thr Arg Asp Ile Thr Val Leu Arg Cys Gly His Ala Thr His Leu 180 185 190 Glu Cys Thr Lys Asp Met Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Cys Pro Leu 195 200 205 Cys Ser Lys Ser Ile Cys Asp Met Ser Ser Val Trp Lys Lys Leu Asp 210 215 220 Glu Glu Val Ala Ala Tyr Lys Ile Pro Lys Val Tyr Glu Asp Lys Met 225 230 235 240 Val Trp Ile Leu Cys Asn Asp Cys Gly Ser Asn Thr Asn Val Arg Phe 245 250 255 His Leu Ile Ala His Lys Cys Ser Ser Cys Gly Ser Tyr Asn Thr Arg 260 265 270 Lys Thr Gln Arg Gly Pro Asn Thr His Ser Cys Ser Ser Gly Gly Pro 275 280 285 Gln Val Val Gly Leu Thr Gly 290 295 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B282B1 <400> 3 aaaaagcagg ctatggagat tggtttcca 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B282B2 <400> 4 agaaagctgg gtctaaccgg ttaaaccaa 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<220> <223> ABA1 R <400> 14 acccagtcaa gcatcgatgg catagc 26 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABI1 F <400> 15 atggaggaag tatctccggc gatcg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABI1 R <400> 16 atcgccaatg gatctcgaca tggcg 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRY F <400> 17 atggcttacg agaaagagct tgatg 25 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRY R <400> 18 actatagcac cagcgacatg gtcc 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOS1 F <400> 19 tgaactatgt gttgaatcca tgtgg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOS1 R <400> 20 actggtctac agcatcaggc catgc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAD1 F <400> 21 atggcgaaca atccttcaca gcttc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAD1 R <400> 22 tcattctcca tcttcgggag accc 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A F <400> 23 atggcagttt atgatcagag tggag 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A R <400> 24 cctgtatgaa ccgttggcaa cactg 25 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP71B2-1 F <400> 25 atgacgatct tgctctgttt cttc 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP71B2-1 R <400> 26 tcaataacgt tgaacaggca caag 24 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP18.1 F <400> 27 tctcccgaaa agcaacgaa 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP18.1 R <400> 28 cataaacttc ccactagctc 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCH4 F <400> 29 atggcgatca cttacttgct tcctc 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCH4 R <400> 30 ttactctctc tatgcagcta agcac 25 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unknown39 F <400> 31 atggtggatc ttgaaagaag agtg 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unknown39 R <400> 32 ctaacacata acatccttga gaag 24 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2C F <400> 33 ggagactttg gatgcttg 18 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2C R <400> 34 ttatgtagat ccatgaacat ctttg 25

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는, 식물체의 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물.
  2. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는, 식물체의 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 식물체의 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물.
  4. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 상기 유전자의 발현이 유도된, 식물체의 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성 유도용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  6. 1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 1) 단계에서 제조된 벡터로 형질전환된 식물 형질전환세포를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계에서 제조된 식물 형질전환세포로 식물체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성 식물체의 제조방법.
  7. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 유전자를 발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것인 식물체의 염 및 고온 중 하나 이상의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20130113035A (ko) 2012-04-05 2013-10-15 경희대학교 산학협력단 배추 내염성에 관여하는 설트 오버를리 센시티브 3 단백질 및 그의 코딩 유전자

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