CN107541518B - 棉花GhAS1基因、GhAS1蛋白、重组载体、重组菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花GhAS1基因、GhAS1蛋白、重组载体、重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过RACE获得棉花GhAS1基因的cDNA全长，发现其与拟南芥AtAS1基因具有67％的相似性；并获得该基因编码的蛋白序列，发现其保守的DNA结合域和钙离子结合域与拟南芥AtAS1、金鱼草PHAN、玉米RS2和小麦WRS2具有高度的同源性。将GhAS1基因转化拟南芥突变体as1‑101，获得的转基因植株，研究转基因植株发现棉花GhAS1基因可以恢复Atas1突变体的表型缺陷，能够促进转基因植株的表皮毛发育，并且具有提高植物抗盐胁迫性的作用。

Description

棉花GhAS1基因、GhAS1蛋白、重组载体、重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及棉花GhAS1基因、GhAS1蛋白、重组载体、重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

棉花是最主要的纤维作物之一，在我国国民经济中占有重要的地位。随着耕地面积不断减少，粮棉争地矛盾加剧，棉花的种植区域逐渐靠近土壤贫瘠，甚至盐碱化地区。因此，提高棉花品种的抗盐胁迫能力具有重要的生产应用价值。拟南芥ASYMMETRIC LEAVES1(AT2G37630)和AtAS2(AT1G65620)基因参与了叶片的极性建成过程。与正常的野生型拟南芥相比，as1和as2突变体有许多的表型缺陷：两者的叶片都向下卷曲，并且长有附属结构叶瓣(leaf lobe)；叶柄和叶片较短，没有明显的主叶脉，叶脉的分枝数目较少且不对称；用突变体叶片在不含激素的培养基进行组织培养时，愈伤分化出根的频率比野生型叶片低，但是分化出茎的频率比后者要高；叶片近轴面极性分化的程度降低，荚果的形态也不正常。由此可知，AtAS1和AtAS2基因不仅影响叶片中侧轴方向的极性分化，还参与了近远轴的极性建立和整个叶脉系统的发育。AtAS1基因编码一种MYB蛋白，主要在子叶和叶原基维管组织、发育的叶片中表达。拟南芥as1-101突变体中AtGA20ox1基因的转录水平显著降低，相应的活性赤霉素的含量明显减少，表明AtAS1基因可以促进活性赤霉素的合成，增强植物体内的赤霉素信号。而赤霉素信号强度的变化则会影响植物诸多方面的生长发育，如种子中脂肪酸的含量和组成。研究认为增强拟南芥种子中的赤霉素信号既可以促进脂肪酸的合成，又同时可以加快脂肪酸的水解，使得成熟种子中的总脂肪酸含量降低。除此之外，赤霉素(GA)信号还可以促进表皮毛(trichome)的分化与发育。GA对表皮毛发育的影响是通过降解DELLA蛋白实现的。拟南芥中的DELLA蛋白(GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3)可以抑制GLABROUSINFLORESCENCE STEMS(GIS，AT3G58070)、GIS2(AT5G06650)和ZINC FINGER PROTEIN8(ZFP8，AT2G41940)的表达，而这三个基因又可以在上游促进GL1和GL3的转录。GL1和GL3是表皮毛起始发育的关键促进因子，所以DELLA蛋白可以间接抑制表皮毛的形成。赤霉素信号可以促进DELLA的降解，解除其对GL1和GL3基因转录的抑制作用，从而促进表皮毛的起始和发育。同时，GAI蛋白可以抑制表皮毛的分枝，RGL1和RGL2则可以打破这种抑制，促进表皮毛的分枝。

人们最初是通过对金鱼草phantastica(phan)突变体的研究发现这一类基因的。phan突变体叶片与野生型金鱼草的扁平叶片相比存在严重的极性分化缺陷，主要表现在叶片的近轴面极性分化不充分，甚至出现针状叶等完全远轴面化的表型。同时，phan突变体中叶脉的结构也与野生型明显的不同。正常情况下，叶脉的韧皮部和木质部分别分布在远轴面和近轴面的一侧，但是，phan突变体中叶脉的木质部则被韧皮部包围着。分子水平的研究发现，PHAN基因编码一种MYB蛋白，该基因在叶原基中均匀表达。玉米中的ROUGH SHEATH2(RS2)和拟南芥中的AS1基因是金鱼草PHAN基因的同源基因。这些基因的功能主要是参与调控了叶片的生长发育过程。但是棉花AS1基因及其在抗盐胁迫和表皮毛发育过程的功能尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供了棉花GhAS1基因。

本发明还提供了上述基因编码的蛋白。

本发明还提供了包含上述基因的重组载体及重组菌。

本发明还提供了上述基因、蛋白、重组载体及重组菌的应用。

为了是实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

棉花GhAS1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中479-1549位所示。

上述GhAS1基因表达的GhAS1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

棉花GhAS1基因编码区全长1071bp，中间没有内含子，总共编码356个氨基酸。与拟南芥AtAS1基因比对后发现，两者具有67％的相似性。翻译成氨基酸序列后，与拟南芥AtAS1、金鱼草PHAN、玉米RS2和小麦WRS2等氨基酸序列比对，结果发现，GhAS1保守的DNA结合域和钙离子结合域与上述几个蛋白具有高度的同源性。进化分析表明，棉花GhAS1与拟南芥中的AtAS1亲缘关系最近。

重组载体，包含上述棉花GhAS1基因。本发明的重组载体包括克隆载体及表达载体，克隆载体可用于保存及复制GhAS1基因，表达载体可用于表达GhAS1基因，具体的，可用于过表达GhAS1基因。

重组菌，包含上述重组载体。本发明的重组菌为重组大肠杆菌或农杆菌，农杆菌可用于转化植物，获得转基因植株。

上述的GhAS1基因、GhAS1蛋白、重组载体或重组菌在植物育种方面的应用。具体的，在提高植物抗盐胁迫性方面的应用，将本申请的GhAS1基因构建过表达载体后转入拟南芥突变体as1-101中，发现转基因植株的长势明显好于野生型和突变体幼苗，表现出很强的抗盐胁迫性；另外，在促进植物表皮毛发育中的应用，发现转基因拟南芥突变体as1-101能够完全恢复拟南芥Atas1突变体的表型缺陷，包括叶片的大小、叶柄长度、株高、叶脉形态等，转基因植株叶片和茎秆上表皮毛的数目都显著地增加。

本发明通过RACE获得棉花GhAS1基因的cDNA全长，并获得该基因编码的蛋白序列，将GhAS1基因插入pCAMBIA1301质粒中，然后将构建该质粒的重组菌，转化拟南芥突变体as1-101，研究获得的转基因植株，发现棉花GhAS1基因可以恢复Atas1突变体的表型缺陷，能够促进转基因植株的表皮毛发育，并且具有提高植物抗盐胁迫性的作用。

附图说明

图1为棉花GhAS1基因编码区序列及其与拟南芥AtAS1基因的比对分析图；

图2为花GhAS1氨基酸序列及其与同源蛋白的比对分析图；

图3为棉花GhAS1基因在不同组织中的表达水平分析图；

图4为载体pCAMBIA1301结构示意图；

图5为转基因幼苗的筛选鉴定图；

图6为棉花GhAS1基因恢复拟南芥as1-101突变体表型图；

图7为棉花GhAS1基因促进转化幼苗茎秆和叶片上表皮毛的发育图；

图8棉花GhAS1基因增强转化幼苗对盐胁迫的抗性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

(一)棉花GhAS1全长cDNA的获得

(1)GhAS1基因特异引物设计

用拟南芥AtAS1基因序列到NCBI中做Blast，根据比对结果选择相似性最高的GhAS1基因的EST序列(890bp)。利用primer premier 5.0软件分别在EST序列的3’端设计一对正向引物和5’端设计一对反向引物，用于5’和3’RACE实验中的巢式PCR过程。两条正向引物之间的距离和两条反向引物之间的距离都是50bp左右，同时保证能够扩增200bp～300bp3’端和5’端的已知序列，测序完成后用以序列的确定和拼接。得到GhAS1基因的全长后，再设计包含整个编码区的引物进行确认。设计引物序列如表1所示：

表1巢式PCR所使用引物

(2)5’RACE和3’RACE实验步骤

为了获得GhAS1基因的cDNA全长序列，利用Invitrogen公司的GeneRacerTM Kit(Catalog nos.L1500-01)，通过5’RACE和3’RACE的方法分别获得GhAS1cDNA的5’末端和3’末端的序列，实验操作如下：

1)总RNA的去磷酸化：

a)在冰上的1.5ml离心管中配制如表2所示的反应体系：

表2获得GhAS1 cDNA的反应体系

b)轻轻混匀，短暂离心后，50℃温浴1h，然后瞬时离心，置于冰上；

c)加入90μl DEPC-ddH₂O和100μl酚:氯仿，涡旋30s；

d)室温，14000rpm，离心5min。吸去上层水相到新的离心管中(约100μl)；

e)加入2μl 10mg/ml mussel glycogen，10μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀后加入220μl 95％

无水乙醇，涡旋混匀；

f)4℃，14000rpm，离心20min，用移液器小心吸去上清液；

g)加入500μl 70％无水乙醇，颠倒数次混匀，4℃，14000rpm，离心2min；

h)倒掉乙醇后，室温放置1～2min，加入7μl DEPC-ddH₂O溶解RNA。

2)去除信使RNA 5’端的帽子

a)在冰上的1.5ml离心管中配制如表3所示的反应体系：

表3去除信使RNA反应体系

b)轻轻混匀后，瞬时离心。37℃温浴1h后，冰上冷却；

c)加入90μl DEPC-ddH₂O和100μl酚:氯仿，涡旋30s；

d)室温，14000rpm，离心5min。吸去上层水相到新的离心管中(约100μl)；

e)加入2μl 10mg/ml mussel glycogen，10μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀后加入220μl 95％无水乙醇，涡旋混匀；

f)4℃，14000rpm，离心20min，用移液器小心吸去上清液；

g)加入500μl 70％无水乙醇，颠倒数次混匀，4℃，14000rpm，离心2min；

h)倒掉乙醇后，室温放置1～2min，加入7μl DEPC-ddH₂O溶解RNA。

3)信使RNA5’端加Oligo接头

a)将7μl经过去磷酸化和去5’端帽子的RNA加入到装有GeneRacerTM RNA Oligo(0.25μg)干粉的离心管中，用移液器吸打混匀，瞬时离心；

b)65℃温浴5min，冰上冷却2min，瞬时离心；

c)依次加入下列试剂：10×Ligase Buffer、10mM ATP、RNaseOut(40U/μl)、T4RNAligase(5U/μl)各1μl；枪打混匀后瞬时离心；

d)37℃温浴1h，冰上冷却；加90μl DEPC-ddH₂O和100μl酚:氯仿，涡旋30s；

e)室温，14000rpm，离心5min。吸去上层水相到新的离心管中(约100μl)；

f)加入2μl 10mg/ml mussel glycogen，10μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀后加入220μl 95％无水乙醇，涡旋混匀；

g)4℃，14000rpm，离心20min，用移液器小心吸去上清液；

h)加入500μl 70％无水乙醇，颠倒数次混匀，4℃，14000rpm，离心2min；

i)小心吸去无水乙醇，再次离心以收集剩余的无水乙醇；

j)再次小心吸去无水乙醇，室温放置1～2min，加入10μl DEPC-ddH₂O溶解RNA。

4)反转录信使RNA

a)在上一步的RNA中分别加入1μl的GeneRacerOligo dT Primer和1μl的dNTPMix(均为25mM)；

b)65℃温浴5min，然后冰上冷却2min，接着向离心管中加入下列试剂：5×RTBuffer，4μl；Cloned AMV RT(15U/μl)，1μl；Sterile water，2μl；RNaseOut(40U/μl)；1μl；

c)混匀后，瞬时离心。45℃温浴1h后，85℃温浴15min，-20℃备用。

5)cDNA末端的扩增

a)在微量离心管中配制如表4的PCR反应体系：

表4反转录PCR反应体系

b)颠倒混匀后，瞬时离心；

c)PCR反应程序如下：Step 1:94℃2minutes；Step 2:94℃30seconds；Step 3:72℃1minutes；Step 4:Go to step 2for 5cycles；Step 5:94℃30seconds；Step 6:70℃1minutes；Step 7:Go to step 5for 5cycles；Step 8:94℃30seconds；Step 9:65℃30seconds；Step 10:68℃1minutes；Step 11:Go to step 8for 25cycles；Step 12:72℃10minutes；Step 13:End。

6)巢式PCR扩增cDNA末端

a)在微量离心管中配制如表5的PCR反应体系：

表5巢式PCR扩增cDNA末端反应体系

b)颠倒混匀后，瞬时离心；

c)PCR反应程序如下：

Step 1:94℃2minutes；Step 2:94℃30seconds；Step 3:65℃30seconds；Step 4:68℃1minute；Step 5:Go to step 2for 25cycles；Step 6:68℃10minutes；Step 7:End。

7)琼脂糖电泳及产物回收

a)将上步的PCR产物全部点入1％的琼脂糖凝胶点样孔中，130V电泳30min；

b)用凝胶成像系统拍照后，在紫外灯下将目的条带割出，装入1.5ml离心管中；

c)根据凝胶回收试剂盒的说明书(北京天根生物有限公司)，回收目的片段。

d)再次电泳检测回收结果。

8)DNA片段的克隆(Takara公司的pMDTM18-T Vector试剂盒)

a)在微量离心管中配制下列DNA溶液：pMD^TM18-T Vector，1μl；Insert DNA，0.1～0.3pmol；Solution I，5μl；dd-H₂O，up to 10μl；

b)16℃反应过夜；

c)将10μl全部加入大肠杆菌感受态细胞，热激转化；

d)挑选阳性克隆测序。

9)序列的比对、拼接与分析

用ClustalX软件将测序获得的序列片段与已知的GhAS1EST序列比对，根据序列相同的部分确定RACE产物的正确性，然后将未知的序列拼接起来，得到GhAS1基因cDNA的全长序列，如SEQ ID NO.1中479-1549位所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

棉花GhAS1基因序列分析及表达分析。

获得棉花GhAS1基因全长cDNA后，用DNAMAN软件将cDNA序列翻译成氨基酸序列，然后与其他作物中的同源基因和同源蛋白做了比较分析。棉花GhAS1基因编码区序列与拟南芥AtAS1(拟南芥TAIR数据库，http://www.arabidopsis.org/index.jsp，AT2G37630)基因编码区序列的比对结果如图1所示，其相似性为64.02％。将棉花GhAS1的氨基酸序列与其他植物中同源蛋白进行比对，分别为拟南芥AtAS1、金鱼草中PHAN(Morimoto,R.,Nishioka,E.,Murai,K.and Takumi,S.(2009)Functional conservation of wheat orthologs ofmaize rough sheath1and rough sheath2genes.Plant molecular biology,69,273-285.)、玉米中RS2(Timmermans,M.C.,Hudson,A.,Becraft,P.W.and Nelson,T.(1999)ROUGH SHEATH2:a Myb protein that represses knox homeobox genes in maizelateral organ primordia.Science,284,151-153.)和小麦中的WRS2(Waites,R.,Selvadurai,H.R.,Oliver,I.R.and Hudson,A.(1998)The PHANTASTICA gene encodes aMYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateralorgans in Antirrhinum.Cell,93,779-789.)，比对结果如图2所示，它们的相似性也很高，尤其是在N端，两个关键DNA结合域(DNA-binding domain)和两个Ca²⁺离子结合位点(CaMBD)都高度的保守。

收取棉花幼苗的子叶、下胚轴、根、茎和叶等材料后，用CTAB法提取各组织总RNA。然后用反转录试剂盒(Omega，#TQ2501-02)得到cDNA模板，以棉花看家基因18S为内参，用RT-PCR的方法研究GhAS1基因的在棉花幼苗个组织的表达模式。结果如图3所示，在棉花茎、下胚轴、子叶、根和叶片组织中都检测到了GhAS1基因的表达，表明该基因具有重要的生物学功能。同时，根和叶片中该基因的表达水平明显较高，预示着该基因在植物抗性和叶片发育过程中的发挥重要作用。实验中用到的引物见表6：

表6基因表达检测所用引物

实施例3

GhAS1基因超表达植株的获得。

以棉花叶片组织cDNA为模板，用基因特异性引物对XbaⅠ-880E-F：5’-GTCTCTAGATGTCATTCCGTCTATCTTATTTG-3’和SacⅠ-880E-R：5’-AATGAGCTCCAACAACTTCAAATTCACATACC-3’扩增GhAS1基因的全长cDNA，经1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收后的cDNA片段和pCAMBIA1301质粒分别用XbaⅠ和SacⅠ双酶切过夜，酶切完成后再经琼脂糖凝胶电泳纯化。按5:1的比例混合酶切过的cDNA片段和pCAMBIA1300质粒(如图4所示)，利用T4连接酶16℃连接过夜。将连接产物转化入DH5α感受态大肠杆菌，经含有卡那霉素(50μg/ml)的抗性LB培养基筛选后，挑取阳性单克隆接种于10ml含有卡那霉素的LB培养液中，37℃，200rpm摇过夜，用质粒提取试剂盒抽提出重组质粒。

将提取的质粒送去测序，选择序列正确的质粒用于转化农杆菌感受态。挑取阳性克隆摇菌后，利用花序浸泡法转化拟南芥as1-101突变体植株，经抗生素筛选后，再用PCR鉴定，最终确定转基因植株。筛选过程如图5所示，转基因获得的T₁代种子首先在含有潮霉素(30μg/ml)的MS培养基上发芽筛选，只有含有抗性载体的种子才能正常的发芽生长(图5a)。提取正常生长幼苗的基因组DNA和RNA，以ACTIN2基因(AT3G18780)为内参基因，分别从核酸水平和转录水平两个层面进行进一步的PCR验证(图5c、d)。验证完成后，分别收获的T₂代纯合种子用于后续的功能研究。PCR鉴定过程中用到的引物见表7所示。

表7 PCR鉴定过程中用到的引物

实施例4

GhAS1基因超表达植株叶脉和表皮毛形态的观察。

在叶脉形态观察实验中，从长日照条件下生长22天的拟南芥植株上选取相同位置的叶片，室温条件下固定过夜(14％的冰醋酸、84％的乙醇和2％的无菌水)。第二天，分别用70％和99.5％乙醇脱水两次，接着用水合氯醛溶液(水合氯醛200g,甘油20g,蒸馏水50g)清洗后，用体视显微镜在暗视野下观察叶脉的形态，拍照后统计叶脉的分枝数。结果如图6所示，棉花GhAS1能完全恢复拟南芥Atas1突变体的表型缺陷，包括叶片的大小、叶柄长度、株高、叶脉形态等，表明棉花GhAS1在植物发育过程中与拟南芥AtAS1具有相同的生物学功能。在表皮毛形态观察实验中，从相同条件下生长的拟南芥植株上选取相同部位的叶片和茎秆，用体视显微镜拍照后，统计表皮毛的数目。结果如图7所示，与野生型拟南芥相比，as1突变体植株的叶片和茎秆上表皮毛的数目都明显减少。而当在as1突变体中过表达棉花GhAS1基因时，转基因植株叶片和茎秆上表皮毛的数目都显著地增加。Li等在研究中发现过表达油菜TTG2基因可以显著地增加植物表面表皮毛的数量，但是同时过表达植株对盐胁迫更加的敏感。它们认为TTG2能够通过抑制IAA的含量，从而降低植物的抗盐胁迫性。由此可知，植物的表皮毛发育与植物的抗盐胁迫性有可能是相关的。

实施例5

盐胁迫处理实验。

在相同的生长环境中种植拟南芥野生型、as1突变体和35S:GhAS1转基因植株，收获主茎基部的成熟种子，在生长室后熟两周。种子经表面消毒后点铺在含有不同浓度氯化钠(分别是0mM,150mM和200mM)的MS培养基上。每个培养基上均铺有野生型、as1突变体和35S:GhAS1转基因植株种子，每个盐浓度设置3个重复。4℃黑暗条件下春化2天后，转移到长日照生长室中竖直培养，发芽3周后，统计高盐处理下各基因型种子的存活率，并拍照。如图8所示，在含有150mM氯化钠的MS培养基上，野生型拟南芥发育缓慢，但是叶片呈现绿色；as1突变体同样发育迟缓，而且叶片几乎完全失绿，表现为黄色；35S:GhAS1转基因植株的长势明显好于野生型和突变体幼苗，表现出很强的抗盐胁迫性。在200mM氯化钠处理时，野生型和突变体幼苗都停止了生长，而35S:GhAS1转基因植株仍有部分叶片表现为绿色。由此可以看出，棉花GhAS1基因能够极大的增强植物的抗盐胁迫性。

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 棉花GhAS1基因、GhAS1蛋白、重组载体、重组菌及其应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 1866

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum）

<221> GhAS1基因cDNA序列

<400> 1

gtgaaggaac aaattctgac attgttattc aattggtttc cgcatgcata tttgctatca 60

gacttcatat gttgtaaact gttaactatc tgagtgaggc taatttggaa ggtgtttgga 120

gttcttgatt cccgctttta gatctggaat tttattcttc aatcacttct gatctcggtg 180

tgtgttgtgt gcaaggcatg gtgttctctt aacttccatt tcttacaccc ttggtgtcat 240

gatacttgtt taaggtctag aaagtgcagt ggaggaattg ttgtatagcc tatggcattg 300

ttataagttc atctttgatt actcatgtca ttccgtctat cttatttgtg agtttgttgc 360

tgttggatcc agttgttatc agttggctat aagcaaagcg atggctaaac ttactgatca 420

tctttcagat acattatgag gatcacagag caatgggaag tggtgttttc ccctggaaat 480

gaaggagaga cagcggtgga gagctgaaga agacgctttg ttgtgtgcat acgtaaaaca 540

atatggtccr agggagtgga accttgtgtc acaccgcatg aacacacccc tgaacaggga 600

tgcaaaatct tgcttagaaa ggtggaataa ctatctcaaa cctggtatca agaagggatc 660

ccttacggaa gaagagcaac gtcttgtaat ccgtcttcaa gctaaacacg gcaacaaatg 720

gaagaaaatt gcagctgaag tccctggtag aacagctaaa agactgggca agtggtggga 780

ggtattcaag gagaagcaac aaagggaaca taaagagaag cataagacgg ttgagccagt 840

cgaggaggga aagtacgata ggatattaga aacttttgcc gaaaaaatag taaaacaggg 900

ccatagctca gcctttccca tggctgcttc taacgggggt tttcttcata ctgacccacc 960

ttcacctgca ccaccaactt tacttccacc ttggctttct aattccagca atgcatccgt 1020

tgtcacacca ccttcccctt ccgtgacttt aagcttatct ccctcaacgg tggcagctgc 1080

tcccccaatc ccatggctgc aacctgagag gatgtccgaa actagccctg tattgggaaa 1140

catggtgccc catggatcrt ttcctcgtag tgagaacctg ctaatatctg aactgatgga 1200

ctgctgcagg cagctagaag atgggcgacg tgcttgggtt gcacatagaa aggaagcggc 1260

ctggaggtta agaagggtag agttacaact cgaatcagaa aaggcttccc gtaaaaggaa 1320

gaagatggaa gaaatagagt caaagatcga ggctctaagg gaagagcaga agagtacact 1380

tgatagaatt gaagctgaat atagggaaca actggagggg ctaagaagag atgcggaagc 1440

gaaggagcaa aaattagcgg agcaatgggc tgcaaagcat ttgcatctga ccaagtttct 1500

tgaacaaacg gggtgcagac ccagggttgt ggagcctaat gggcagtgag caaagatcat 1560

ttatcaagca tctcctttca acagactctg cattgttttt gatgatattc tctactatag 1620

aagtctattt atagttggtt tttctaggat gggacactct gaatgggaaa ggtagcatta 1680

gctctatctt ttgtgttcac ctcttaaaaa gtatattaaa tttagattcc aatttctgga 1740

tattaaggag tctgatttgg catgtgaaag aagatgcctg atttggtatg tgaatttgaa 1800

gttgttggtg aattgatttc tccaaatcta tataaccata aaactaaact gatcgaaaaa 1860

aaaaaa 1866

<211> 356

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium hirsutum）

<221> GhAS1蛋白氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Glu Arg Gln Arg Trp Arg Ala Glu Glu Asp Ala Leu Leu

1 5 10 15

Cys Ala Tyr Val Lys Gln Tyr Gly Pro Arg Glu Trp Asn Leu Val

20 25 30

Ser His Arg Met Asn Thr Pro Leu Asn Arg Asp Ala Lys Ser Cys

35 40 45

Leu Glu Arg Trp Asn Asn Tyr Leu Lys Pro Gly Ile Lys Lys Gly

50 55 60

Ser Leu Thr Glu Glu Glu Gln Arg Leu Val Ile Arg Leu Gln Ala

65 70 75

Lys His Gly Asn Lys Trp Lys Lys Ile Ala Ala Glu Val Pro Gly

80 85 90

Arg Thr Ala Lys Arg Leu Gly Lys Trp Trp Glu Val Phe Lys Glu

95 100 105

Lys Gln Gln Arg Glu His Lys Glu Lys His Lys Thr Val Glu Pro

110 115 120

Val Glu Glu Gly Lys Tyr Asp Arg Ile Leu Glu Thr Phe Ala Glu

125 130 135

Lys Ile Val Lys Gln Gly His Ser Ser Ala Phe Pro Met Ala Ala

140 145 150

Ser Asn Gly Gly Phe Leu His Thr Asp Pro Pro Ser Pro Ala Pro

155 160 165

Pro Thr Leu Leu Pro Pro Trp Leu Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ser

170 175 180

Val Val Thr Pro Pro Ser Pro Ser Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro

185 190 195

Ser Thr Val Ala Ala Ala Pro Pro Ile Pro Trp Leu Gln Pro Glu

200 205 210

Arg Met Ser Glu Thr Ser Pro Val Leu Gly Asn Met Val Pro His

215 220 225

Gly Ser Phe Pro Arg Ser Glu Asn Leu Leu Ile Ser Glu Leu Met

230 235 240

Asp Cys Cys Arg Gln Leu Glu Asp Gly Arg Arg Ala Trp Val Ala

245 250 255

His Arg Lys Glu Ala Ala Trp Arg Leu Arg Arg Val Glu Leu Gln

260 265 270

Leu Glu Ser Glu Lys Ala Ser Arg Lys Arg Lys Lys Met Glu Glu

275 280 285

Ile Glu Ser Lys Ile Glu Ala Leu Arg Glu Glu Gln Lys Ser Thr

290 295 300

Leu Asp Arg Ile Glu Ala Glu Tyr Arg Glu Gln Leu Glu Gly Leu

305 310 315

Arg Arg Asp Ala Glu Ala Lys Glu Gln Lys Leu Ala Glu Gln Trp

320 325 330

Ala Ala Lys His Leu His Leu Thr Lys Phe Leu Glu Gln Thr Gly

335 340 345

Cys Arg Pro Arg Val Val Glu Pro Asn Gly Gln

350 355 356

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 5’ RACE Outer Primer

<400> 3

gctgatggcg atgaatgaac actg 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 5’ RACE Inner Primer

<400> 4

cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatg 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 3’ RACE Outer Primer

<400> 5

gcgagcacag aattaatacg act 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 3’ RACE Inner Primer

<400> 6

cgcggatccg aattaatacg actcactata 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 88Q-F

<400> 7

atcacagagc aatgggaagt 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 88Q-R

<400> 8

cggattacaa gacgttgctc t 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 18S-F

<400> 9

aaataccgcg gcgctggca 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 18S-R

<400> 10

cggctaccac atccaaggaa 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> XbaⅠ-880E-F

<400> 11

gtctctagat gtcattccgt ctatcttatt tg 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> SacⅠ-880E-R

<400> 12

aatgagctcc aacaacttca aattcacata cc 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 35S-AS1F

<400> 13

gtcccaaaga tggaccccca ccc 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 35S-AS1R

<400> 14

agcagctgcc accgttgagg g 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> AS1-F

<400> 15

atgtcattcc gtctatctta tttg 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> AS1-R

<400> 16

caacaacttc aaattcacat acc 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> TUB4-F

<400> 17

ttgctgtctt cgtttccctg g 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> TUB4-R

<400> 18

gagggtgcca ttgacaacat c 21

<211> 1104

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<221> AtAS1基因编码序列

<400> 19

atgaaagaga gacaacgttg gagtggtgaa gaagatgcat tgttacgtgc ttacgttaga 60

cagttcggtc cgagagaatg gcatcttgtg tctgagcgta tgaacaaacc tttgaaccgt 120

gacgccaagt cttgtttaga gagatggaag aattatctta agccagggat caagaaaggg 180

tctttgacag aggaagagca gaggcttgtg atccgtcttc aggagaaaca cggcaacaag 240

tggaagaaga ttgctgctga ggttcccggg aggacggcaa agcggttagg gaagtggtgg 300

gaagtgttta aggagaagca acagagagaa gagaaagaga gtaacaagag agttgagcct 360

attgacgaga gtaagtacga tcggattctc gagagtttcg ctgagaagct tgtcaaagag 420

cggtctaacg ttgtccctgc tgctgccgct gctgcaacgg ttgtgatggc taattcgaat 480

ggagggtttt tacattctga acaacaagtt cagcctccta acccagtgat cccgccttgg 540

ttagctactt ctaacaatgg gaacaatgtt gttgcaaggc ctccctcggt aactttgaca 600

ttatcgcctt ccacagtggc tgcagctgcg cctcaaccgc caatcccgtg gctgcagcag 660

caacagcctg agagagcaga gaacggtcca gggggacttg tgttagggag tatgatgccg 720

tcttgtagtg ggagtagcga gagtgtgttc ttgtcagagc ttgtggagtg ttgtagagag 780

ttggaggaag ggcaccgagc ttgggcagac cataagaaag aggctgcatg gaggctaaga 840

aggctggagc tgcagctaga gtcagagaag acgtgtagac aaagggagaa gatggaggag 900

attgaggcaa agatgaaagc tcttagggaa gagcagaaga acgcaatgga gaagatcgaa 960

ggagagtaca gagaacagct cgttggtttg aggcgagacg cagaggccaa agaccagaaa 1020

ctggctgatc aatggacctc taggcatatc agactcacca agtttcttga acaacaaatg 1080

ggttgcagat tagaccgccc ctga 1104

<211> 367

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<221> AtAS1蛋白氨基酸序列

<400> 20

Met Lys Glu Arg Gln Arg Trp Ser Gly Glu Glu Asp Ala Leu Leu

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Val Arg Gln Phe Gly Pro Arg Glu Trp His Leu Val

20 25 30

Ser Glu Arg Met Asn Lys Pro Leu Asn Arg Asp Ala Lys Ser Cys

35 40 45

Leu Glu Arg Trp Lys Asn Tyr Leu Lys Pro Gly Ile Lys Lys Gly

50 55 60

Ser Leu Thr Glu Glu Glu Gln Arg Leu Val Ile Arg Leu Gln Glu

65 70 75

Lys His Gly Asn Lys Trp Lys Lys Ile Ala Ala Glu Val Pro Gly

80 85 90

Arg Thr Ala Lys Arg Leu Gly Lys Trp Trp Glu Val Phe Lys Glu

95 100 105

Lys Gln Gln Arg Glu Glu Lys Glu Ser Asn Lys Arg Val Glu Pro

110 115 120

Ile Asp Glu Ser Lys Tyr Asp Arg Ile Leu Glu Ser Phe Ala Glu

125 130 135

Lys Leu Val Lys Glu Arg Ser Asn Val Val Pro Ala Ala Ala Ala

140 145 150

Ala Ala Thr Val Val Met Ala Asn Ser Asn Gly Gly Phe Leu His

155 160 165

Ser Glu Gln Gln Val Gln Pro Pro Asn Pro Val Ile Pro Pro Trp

170 175 180

Leu Ala Thr Ser Asn Asn Gly Asn Asn Val Val Ala Arg Pro Pro

185 190 195

Ser Val Thr Leu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Val Ala Ala Ala Ala

200 205 210

Pro Gln Pro Pro Ile Pro Trp Leu Gln Gln Gln Gln Pro Glu Arg

215 220 225

Ala Glu Asn Gly Pro Gly Gly Leu Val Leu Gly Ser MET MET Pro

230 235 240

Ser Cys Ser Gly Ser Ser Glu Ser Val Phe Leu Ser Glu Leu Val

245 250 255

Glu Cys Cys Arg Glu Leu Glu Glu Gly His Arg Ala Trp Ala Asp

260 265 270

His Lys Lys Glu Ala Ala Trp Arg Leu Arg Arg Leu Glu Leu Gln

275 280 285

Leu Glu Ser Glu Lys Thr Cys Arg Gln Arg Glu Lys MET Glu Glu

290 295 300

Ile Glu Ala Lys MET Lys Ala Leu Arg Glu Glu Gln Lys Asn Ala

305 310 315

MET Glu Lys Ile Glu Gly Glu Tyr Arg Glu Gln Leu Val Gly Leu

320 325 330

Arg Arg Asp Ala Glu Ala Lys Asp Gln Lys Leu Ala Asp Gln Trp

335 340 345

Thr Ser Arg His Ile Arg Leu Thr Lys Phe Leu Glu Gln Gln MET

350 355 360

Gly Cys Arg Leu Asp Arg Pro

365 367

<211> 356

<212> PRT

<213> 金鱼草（Antirrhinum majus）

<221> PHAN蛋白氨基酸序列

<400> 21

Met Lys Glu Arg Gln Arg Trp Arg Pro Glu Glu Asp Ala Leu Leu

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Val Lys Glu Tyr Gly Pro Arg Asp Trp His Leu Val

20 25 30

Thr Gln Arg Met Asn Lys Pro Leu Asn Arg Asp Ala Lys Ser Cys

35 40 45

Leu Glu Arg Trp Lys Asn Tyr Leu Lys Pro Gly Ile Lys Lys Glu

50 55 60

Ser Leu Thr Gln Glu Glu Gln Ile Leu Val Ile Asn Leu Gln Ala

65 70 75

Lys His Gly Asn Lys Trp Lys Lys Ile Ala Ala Glu Val Pro Gly

80 85 90

Arg Thr Ala Lys Arg Leu Gly Lys Trp Trp Glu Val Phe Lys Glu

95 100 105

Lys Lys Gln Arg Glu Glu Lys Asp Asn Lys Lys Ile Thr Glu Pro

110 115 120

Ile Glu Glu Gly Lys Tyr Asp Arg Ile Leu Glu Thr Phe Ala Glu

125 130 135

Lys Ile Val Lys Glu Arg Val Gln Glu Leu Leu Gln Cys Arg Pro

140 145 150

Thr Ser Asn Ser Gly Phe Leu Gln Asn Asp Pro Ser Pro His Ser

155 160 165

Ala Gln Ser Val Leu Pro Pro Trp Leu Ala Ser Ser Ser Met Thr

170 175 180

Thr Thr Ile Arg Pro Gln Ser Pro Ser Val Thr Leu Ser Leu Ser

185 190 195

Pro Ser Val Val Pro Pro Ala Pro Ala Ile Pro Trp Leu His Pro

200 205 210

Asp Asn Thr Thr His Gly Pro Ser Asn Leu Ser Ser Leu Gly Val

215 220 225

Val Ala Pro Phe Met Gly Glu Asn His Ile Val Pro Glu Leu Leu

230 235 240

Glu Cys Cys Arg Glu Leu Glu Glu Gly Gln Arg Ala Trp Ala Ala

245 250 255

His Arg Lys Glu Ala Ala Trp Arg Leu Lys Arg Val Glu Leu Gln

260 265 270

Leu Glu Ser Glu Lys Ala Cys Arg Arg Arg Glu Lys Met Glu Glu

275 280 285

Ile Glu Ala Lys Met Lys Ala Leu Arg Glu Glu Gln Lys Ala Ser

290 295 300

Leu Asp Arg Ile Glu Ala Glu Tyr Arg Glu Gln Leu Ala Gly Leu

305 310 315

Arg Arg Glu Ala Glu Val Lys Glu Gln Lys Leu Ala Glu Gln Trp

320 325 330

Ala Ala Lys His Leu Arg Leu Thr Lys Phe Leu Glu Gln Thr Gly

335 340 345

Tyr Arg Ser Ile Ala Gly Glu Leu Asn Gly Arg

350 355 356

<211> 370

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<221> RS2蛋白氨基酸序列

<400> 22

Met Lys Glu Arg Gln Arg Trp Arg Pro Glu Glu Asp Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Val Arg Gln Tyr Gly Pro Arg Glu Trp His Leu Val

20 25 30

Ser Gln Arg Met Asn Val Ala Leu Asp Arg Asp Ala Lys Ser Cys

35 40 45

Leu Glu Arg Trp Lys Asn Tyr Leu Arg Pro Gly Ile Lys Lys Gly

50 55 60

Ser Leu Thr Glu Glu Glu Gln Arg Leu Val Ile Arg Leu Gln Ala

65 70 75

Lys His Gly Asn Lys Trp Lys Lys Ile Ala Ala Glu Val Pro Gly

80 85 90

Arg Thr Ala Lys Arg Leu Gly Lys Trp Trp Glu Val Phe Lys Glu

95 100 105

Lys Gln Gln Arg Glu Leu Arg Asp Ser Arg Arg Pro Pro Pro Glu

110 115 120

Pro Ser Pro Asp Glu Arg Gly Arg Tyr Glu Trp Leu Leu Glu Asn

125 130 135

Phe Ala Glu Lys Leu Val Gly Glu Arg Pro Gln Gln Ala Ala Ala

140 145 150

Ala Pro Ser Pro Leu Leu Met Ala Ala Pro Val Leu Pro Pro Trp

155 160 165

Leu Ser Ser Asn Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val

170 175 180

Ala His Pro Pro Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ser Val Thr Leu Ser

185 190 195

Leu Ala Ser Ala Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Ala Pro Ser Pro

200 205 210

Trp Met Pro Asp Arg Ala Ala Ala Asp Gln Ala Pro Tyr Gly Phe

215 220 225

Pro Ser Pro Pro Gln His Gly Gly Ala Ala Pro Pro Gly Met Ala

230 235 240

Val Val Asp Gly Gln Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu Cys Cys Arg

245 250 255

Glu Leu Glu Glu Gly Arg Arg Ala Trp Ala Thr His Arg Arg Glu

260 265 270

Ala Ala Trp Arg Leu Lys Arg Val Glu Gln Gln Leu Glu Met Glu

275 280 285

Arg Glu Met Arg Arg Arg Glu Val Trp Glu Glu Phe Glu Ala Lys

290 295 300

Met Arg Thr Met Arg Leu Glu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Arg Val

305 310 315

Glu Arg Asp His Arg Glu Lys Val Ala Glu Leu Arg Arg Asp Ala

320 325 330

Gln Val Lys Glu Glu Lys Met Ala Glu Gln Trp Ala Ala Lys His

335 340 345

Ala Arg Val Ala Lys Phe Val Glu Gln Met Gly Gly Cys Ser Arg

350 355 360

Ser Trp Ser Ser Ala Thr Asp Met Asn Cys

365 370

<211> 361

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<221> WRS2蛋白氨基酸序列

<400> 23

Met Glu Met Lys Glu Arg Gln Arg Trp Arg Pro Glu Glu Asp Ala

1 5 10 15

Ile Leu Arg Ser Tyr Val Arg Gln Tyr Gly Pro Arg Glu Trp Asn

20 25 30

Leu Val Ala Gln Arg Met Asn Val Pro Leu Asp Arg Asp Ala Lys

35 40 45

Ser Cys Leu Glu Arg Trp Lys Asn Tyr Leu Arg Pro Gly Ile Lys

50 55 60

Lys Gly Ser Leu Thr Asp Asp Glu Gln Arg Leu Val Ile Arg Leu

65 70 75

Gln Ala Lys His Gly Asn Lys Trp Lys Lys Ile Ala Ala Glu Val

80 85 90

Pro Gly Arg Thr Ala Lys Arg Leu Gly Lys Trp Trp Glu Val Phe

95 100 105

Lys Glu Lys Gln Gln Arg Glu Ile Arg Asp Ser Arg Arg Pro Pro

110 115 120

Pro Glu Pro Ser Pro Asp Glu Arg Gly Arg Tyr Glu Trp Leu Leu

125 130 135

Glu Asn Phe Ala Glu Lys Leu Val Lys Glu Arg Gln Gln Val Gly

140 145 150

Val Gly Ala Thr Pro Leu His His His Leu Met Ala Ala Pro Met

155 160 165

Leu Pro Pro Trp Met Ser Ser Thr Ala Thr Asn Gly Ala Pro Val

170 175 180

Ser Pro Ala Pro Pro Ser Pro Ser Val Thr Leu Ser Leu Ala Ser

185 190 195

Ala Val Val Pro Pro Pro Thr Ala Ala Pro Trp Met Gln Gln Gln

200 205 210

Met Ala Glu Asp Gly Ala Ala Phe Gly Phe Ala Arg Pro Pro Pro

215 220 225

Ala Pro Gly Met Val Ala Asp Ala Pro Gln Ala Ala Leu Ala Glu

230 235 240

Leu Ala Glu Cys Cys Arg Glu Leu Asp Glu Gly His Arg Ala Trp

245 250 255

Ala Ala His Arg Lys Glu Ala Ser Trp Arg Leu Lys Arg Val Glu

260 265 270

Leu Gln Leu Glu Ser Glu Arg Ala Cys Arg Arg Arg Glu Ala Ala

275 280 285

Glu Glu Phe Glu Ala Lys Met Arg Ala Leu Trp Glu Glu Gln Ala

290 295 300

Ala Ala Val Glu Arg Leu Glu Ala Glu Tyr Arg Glu Lys Val Ala

305 310 315

Gly Leu Arg Arg Asp Ala Glu Leu Lys Glu Gln Lys Met Ala Glu

320 325 330

Gln Trp Ala Ala Lys His Ala Arg Leu Thr Lys Phe Leu Glu Gln

335 340 345

Val Gly Ser Ser Cys Arg Arg Trp Pro Pro Gly Glu Met Asn Gly

350 355 360

Arg

361

Claims (2)

1.棉花GhAS1基因、棉花GhAS1基因表达的GhAS1蛋白、包含棉花GhAS1基因的重组载体、或者包含所述重组载体的重组菌在提高植物抗盐胁迫性方面的应用；所述棉花GhAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中479-1549位所示；所述GhAS1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.棉花GhAS1基因、棉花GhAS1基因表达的GhAS1蛋白、包含棉花GhAS1基因的重组载体、或者包含所述重组载体的重组菌在促进植物表皮毛发育中的应用；所述棉花GhAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中479-1549位所示；所述GhAS1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

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